快速測(cè)定生物樣品中蛋白含量的同步熒光法研究

1、快速測(cè)定生物樣品中蛋白含量的同步熒光法研究崔鳳靈X,閆迎華,張強(qiáng)齋,渠桂榮,盧雁(河南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,河南省環(huán)境污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新鄉(xiāng)453007摘要:最佳實(shí)驗(yàn)條件下,基于脫氧尿苷與人血清白蛋白(HS A相互作用,導(dǎo)致血清白蛋白的同步熒光光譜發(fā)生特異性變化,且體系的同步熒光強(qiáng)度和溶液中白蛋白的濃度呈良好的線性關(guān)系,建立了以脫氧尿苷為探針,運(yùn)用固定波長同步熒光光譜快速測(cè)定生物樣品中蛋白質(zhì)總含量的新方法。深入考察了$K值、反應(yīng)介質(zhì)、試劑用量、離子強(qiáng)度、加入順序、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)測(cè)定的影響。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,體系的同步熒光強(qiáng)度與血清白蛋白在217652414L g P mL范圍內(nèi)的線性

2、相關(guān)系數(shù)為019991,方法的檢出限可達(dá)0111L g P mL。運(yùn)用本方法對(duì)人血清、唾液和尿液等生物樣品進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),回收率在9810%10215%之間。對(duì)11份空白溶液進(jìn)行平行測(cè)定,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為112%。用經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)G2250(CBB法做了對(duì)照實(shí)驗(yàn),兩種方法測(cè)定結(jié)果基本一致。還考察了一些常見離子和有機(jī)物存在時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響。本方法已用于血清、唾液和尿樣等生物樣品中蛋白質(zhì)總量的快速測(cè)定。關(guān)鍵詞:脫氧尿苷;人血清白蛋白(HSA;考馬斯亮藍(lán)G2250(CBB;同步熒光光譜;分子探針中圖分類號(hào):O657.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):100020720(200912200920

3、5蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子,它是構(gòu)成生命體最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。蛋白質(zhì)的定量測(cè)定是臨床檢驗(yàn)中診斷疾病及檢查治療效果的重要指標(biāo)。因此,蛋白質(zhì)定量測(cè)定在化學(xué)、生物、醫(yī)藥、食品等各相關(guān)學(xué)科中已經(jīng)成為一個(gè)非常熱門的研究課題1。血清白蛋白是動(dòng)物和人體血漿中重要的載體蛋白,它能和許多種內(nèi)源或外源化合物產(chǎn)生作用,承載著將藥物運(yùn)輸?shù)竭_(dá)靶點(diǎn)產(chǎn)生藥效和儲(chǔ)存藥物延長藥效等重要作用,對(duì)研究藥物的藥效和藥理及臨床用藥有重要意義2。蛋白質(zhì)測(cè)定較常用的經(jīng)典方法有凱氏定氮法、L owry法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外分光光度法3等,其中,凱氏定氮法因其適用樣品廣泛,測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確,是常用分析有機(jī)化合物含氮量的經(jīng)典方法之一4。近來又

4、發(fā)展了一些新方法如熒光光度法4,5、化學(xué)發(fā)光法6和共振光散射法7等。同步熒光光譜法自1971年被提出以來,由于其與常規(guī)熒光分析法相比具有靈敏度高、選擇性好、光譜簡(jiǎn)化、譜帶窄化及可減小散射光影響等優(yōu)點(diǎn)8,已成功地應(yīng)用于多組分的同時(shí)測(cè)定9以及生物分子10的研究中。核苷是生物系統(tǒng)的基本構(gòu)件,具有廣泛的生物活性11,12。核苷類化合物是目前公認(rèn)最有抗病毒潛能的一類藥物13,有關(guān)研究已成為當(dāng)今藥物化學(xué)中的熱點(diǎn)課題。脫氧尿苷(2c2D eoxyuridine是一種重要核苷類藥物中間體,常用于合成具有抗癌、抗病毒活性的52溴脫氧尿苷、52氟脫氧尿苷、碘苷等尿嘧啶類核苷藥物。因而,研究脫氧尿苷與蛋白質(zhì)的相互作

5、用并以其做為分子探針測(cè)定生物樣品中蛋白質(zhì)的含量有重要的意義。X收稿日期:2008212225;修訂日期:2009203210基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(20673034、高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20060476001和河南省教育廳自然科學(xué)基金(2006150012項(xiàng)目資助1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 儀器與試劑FP 26500熒光分光光度計(jì)(日本分光公司;T 26紫外2可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器公司;PB 210型酸度計(jì)(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)公司;BS 2110S 型電子天平(北京賽多利斯天平公司;脫氧尿苷11010-3mol P L 水溶液;人血清白蛋白(HS A,華蘭生物工程公司410

6、10-5mol P L 水溶液,在冰箱中保存(14e ;pH 714的Tris 2HCl 緩沖溶液;考馬斯亮藍(lán)溶液(溶液中含0101%考馬斯亮藍(lán)G 2250,417%乙醇,815%磷酸;015mol P L 的NaCl 水溶液。所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。112 實(shí)驗(yàn)方法 于10mL 比色管中依次加入:pH 714的Tris 2HCl 緩沖溶液210mL,015mol P L 的NaCl 溶液210mL,一定體積的HSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液,11010-3mol P L 的脫氧尿苷溶液012mL,用水定容至刻度,搖勻,用1cm 石英吸收池,在$K =50nm 時(shí)掃描體系的同步熒光光譜。

7、2 結(jié)果與討論2.1 脫氧尿苷與HS A 的相互作用研究分別用紫外吸收光譜(圖1和同步熒光光譜(圖2研究了脫氧尿苷與人血清白蛋白的相互作用。紫外吸收光譜顯示,實(shí)驗(yàn)條件下蛋白質(zhì)分別在210和280nm 左右出現(xiàn)兩個(gè)峰,加入不同濃度的脫氧尿苷后,210nm 處的吸收峰紅移至215nm,而280nm 處的峰消失,同時(shí)在260nm 左右出現(xiàn)新的強(qiáng)吸收峰,吸收光譜的這種特征變化,表明了HSA 與脫氧尿苷之間發(fā)生了相互作用,形成了新的復(fù)合物。在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的三種熒光生色團(tuán)中,常用色氨酸殘基的熒光來考查其構(gòu)象的變化14。在普通熒光光譜中,這三種內(nèi)源熒光生色團(tuán)的熒光發(fā)射峰基本重疊,難以區(qū)分,所得結(jié)果比較籠統(tǒng),

8、而同步熒光光譜能將其區(qū)分開。固定激發(fā)波長與發(fā)射波長的間距$K ,同步掃描激發(fā)波和發(fā)射波即可得同步熒光光譜,這種光譜已被用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化的分析。由$K =20nm 時(shí)掃描得到的同步熒光只顯示酪氨酸殘基的光譜特性,而$K =60nm 所得的同步熒光只顯示色氨酸殘基的光譜特性。Burstein 認(rèn)為色氨酸的最大發(fā)射波長與其所處的環(huán)境有關(guān),隨其所處環(huán)境的疏水性逐漸降低、其圖1 紫外吸收光譜Fig .1 UV absor ption spectra1-脫氧尿苷;2-人血清白蛋白;36-脫氧尿苷2人血清白蛋白(12c 2D eo xyuridine,c 2c 2D eoxyuridine =01210

9、-5mol P L;(2HSA,c HS A =01810-6mol P L;(362c 2Deox yuridi ne 2HSA,c HS A =01810-6mol P L,c 2c 2Deoxyuridine =012,014,016,01810-5mo l PL 圖2 胞苷酸與白蛋白相互作用的同步熒光光譜Fig .2 The synchr onous fluor escence spectr a of HSA at var ious concentrations of 2c 2Deoxyur idine while the $K =15nm (a and$K =60nm (b 16:c

10、 HS A =01810-6mol P L;c 2c 2D eoxyuridine =0,012,014,016,018,11010-5mol P L(a$K =20nm;(b$K =60nm最大發(fā)射波長紅移15,若色氨酸的最大發(fā)射波長改變,則說明蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了改變,故由發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。從圖2可以清楚的看出酪氨酸殘基和色氨酸酸殘基的最大波長都發(fā)生了紅移,說明脫氧尿苷與HS A 發(fā)生作用使其所處環(huán)境的疏水性降低。2.2 同步熒光光譜測(cè)定方法室溫條件下,設(shè)定熒光激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5nm,$K =50nm,以同步熒光信號(hào)(相對(duì)強(qiáng)度對(duì)激發(fā)波長測(cè)繪同步熒光光譜圖,在固定脫氧

11、尿苷濃度的條件下,逐漸增加HS A 的濃度,進(jìn)行同步熒光光譜掃描。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下掃描得到了2c 2Deoxyuridine 2HS A 體系的同步熒光光譜(圖3。體系的同步熒光強(qiáng)度隨HSA 濃度的增加有規(guī)律的增大,在一定濃度范圍內(nèi)與血清白蛋白的濃度呈良好的線性關(guān)系。據(jù)此,建立了一種同步熒光光譜法分析測(cè)定蛋白質(zhì)的新方法。 圖3 最佳實(shí)驗(yàn)條件下體系的同步熒光光譜Fig .3 Synchr onous fluorescence spectr a of the system underthe optimum conditions2.0mL Tris 2HCl+ 2.0mL NaCl+0.2mL 2c

12、 2Deoxy uridine +X HSA120:c HS A =0,014,018,112,116,210,214,218,312,316,410,414,418,512,516,610,614,618,712,716(10-6mol P L2.3 最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇為10,15,20,30,40,50,60nm 時(shí),體系的同步熒光光譜特征。結(jié)果顯示,當(dāng)$K =50nm 時(shí),可以得到同步熒光信號(hào)最強(qiáng)且半寬度最小的單峰同步熒光光譜。故本實(shí)驗(yàn)選擇$K =50nm 。度最高、穩(wěn)定性最好,且Tris 2HCl 緩沖溶液的用量在2.0mL 時(shí)體系靈敏度最高。本實(shí)驗(yàn)選用pH 7.4的Tris 2HCl

13、 緩沖溶液2.0mL 為反應(yīng)介質(zhì)?？疾炝朔磻?yīng)時(shí)間對(duì)體系同步熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明,在室溫下,該反應(yīng)在5min 內(nèi)即可完成,且體系的同步熒光強(qiáng)度至少在5h 內(nèi)基本不變。2.4 線性范圍、回歸方程、檢出限在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,以體系的同步熒光強(qiáng)度對(duì)HSA 濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,線性回歸方程為I SF =13.60246+211.19154107C HSA (mol P L,相關(guān)系數(shù)為R =0.9991。測(cè)定的濃度范圍在2.76524.4L g P mL 之間。根據(jù)IUPA C 的定義16,對(duì)11份空白溶液進(jìn)行平行測(cè)定,計(jì)算了方法的檢出限為0.11L g P mL 。2.5 樣品的測(cè)定和回收率取自于河

14、南師范大學(xué)校醫(yī)院的人血清樣品中蛋白質(zhì)的濃度較大,實(shí)驗(yàn)前將血清樣品用二次去離子水稀釋100倍至本方法的檢測(cè)范圍,唾液和尿樣也進(jìn)行了合適倍數(shù)的稀釋,按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)上述樣品進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見表1。參照文獻(xiàn)17,用經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)G2 250(CBB法做了樣品測(cè)定的對(duì)照實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。從表2中數(shù)據(jù)可以看出,兩種方法所得結(jié)果基本一致。表1對(duì)生物樣品的測(cè)定結(jié)果(n=6Tab.1Determination r esults o f biological samples(n=6樣品加入量Q P(L g P mL測(cè)得量Q P(L g P mL回收率P%RSDP%血清樣55.2110.416

15、5.6133.93190.83243.38299.58-100.999.6100.00.500.600.860.65尿樣55.2110.4165.615.2771.05128.79179.28-100.8102.599.10.380.691.30.47唾液樣55.2110.4165.686.88139.21195.12251.58-98.098.999.60.731.50.250.95表2CBB法與同步熒光法測(cè)定蛋白質(zhì)的結(jié)果對(duì)照Tab.2Compa rison of the exper imental results by synchro2 nous fluorescence a nd CBB

16、 G2250methods樣品測(cè)定值Q P(L g P mL同步熒光法CBB法RSD P% (n=62.6干擾實(shí)驗(yàn)在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,考察了一些常見離子和有機(jī)物存在時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響。相對(duì)誤差控制在?5%內(nèi),以下物質(zhì)共存(倍不干擾樣品的測(cè)定:K+(177、Ca2+(72、Z n2+(6、N H4+(65、SO42-(35、PO43-(28、C2O42-(7、F-(27;糊精(36、淀粉(54、果糖(35、葡萄糖(97、麥芽糖(36、檸檬酸(5、絲氨酸(37、D L2蘇氨酸(28、蔗糖(58。某些物質(zhì)的共存倍數(shù)較小,但樣品中這些物質(zhì)的實(shí)際含量很低,通過稀釋便可消除干擾而不影響測(cè)定,因此測(cè)定前不用

17、對(duì)樣品進(jìn)行特殊處理。參考文獻(xiàn)1崔鳳靈,張強(qiáng)齋,王俊麗等.分析試驗(yàn)室,2008,27(1:232Cui F L,Z hang Q Z,Yan Y H et al.Carbohy d Poly m,2008,73(3:4643李娟,張耀庭,曾偉等.中國生物制品學(xué)雜志,2000,13(2:1184Jiang C Q,Luo L.Anal Chi m Acta,2004,506(2:1715Cui F L,Cui Y R,Luo H X et al.Chin Sci Bull,2006,51(18:22016Z hang H M,Zhu Z W,Li N Q.J A nal Chem,1999,363

18、(4:4087江波,胡慶紅.分析試驗(yàn)室,2002,21(3:278陳國珍,黃賢智,許金鉤.熒光分析法(第二版.北京:科學(xué)出版社.19909鄢遠(yuǎn),彭學(xué)軍,許金鉤.分析測(cè)試學(xué)報(bào),1995,14(1:1610Cui F L,W ang L,Fan J et al.J Pharm Bio med A nal,2004,34(1:18911K umar R,Sharma N,Nath M et al.J Med Chem,2001,44(24:422512K umar R,Nath M,Ty rrell D L.J Med Chem,2002,45(10:203213Shiragami H,Ineyam

19、a T,Uchida Y.J Nucleosides&N u2cleotides,1996,15(1-3:4714Try nda2Lemiesz L,Karaczyn A,Kepple B K et al.J In2o rg Biochem,2000,78(4:34115朱鏗,童沈陽.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),1996,17(4:539PAC,Compendium of Analy tical No menclature,DefinitiveRules,Pergamo n Press,O xfo rd,198717王文平,郭祀遠(yuǎn),李琳等.食品研究與開發(fā),2008,29(1:115Study o

20、n determination of the total protein in biological samples by synchronous fluorescence techniqueCU I Fe ng2ling*,Y A N Y ing2hua,Z HA NG Qiang2zhai,QU G ui2rong and LU Y an(School of Che mistry and Envir2 onmental Science,Key Laboratory for Yellow River and Huai he River Water Environment and Pollut

21、ion Control Minis2 try of Education,Henan Normal University,Xinxiang453007,Fenxi Shiyanshi,2009,28(12:913 Abstract:Under the optimum experimental c onditions,2c2Deoxyuridine could interact with human serum albumin (HS A,resulting in the specific changes of the intrinsic fluorescence of serum albumin

22、.Synchronous fluorescence in2 tensity of the syste m had a good linear relationship with the serum albumin c oncentration in the range of2176 52414L g P mL,and the detection limit of this method w as0.11L g P mL.A novel method f or the determination of the proteins with2c2Deoxyuridine as a molecular

23、 probe was developed.The effect factors for spectral characterization and intensity of synchronous fluorescence such as the value of$K,reaction medium,rea gent concentration,ionic strength, addition sequence,reaction time were also investigated.The recoveries were98.0%102.5%and11blank solut2 ions to

24、 the parallel e xperimental data obtained the relative standard deviation of1.12%.The CBB G2250method was done as the control experiment and the results w ere in good acc ordance with those by synchronous fluorescence method. The results indicated that this method was simple,rapid,and had high sensitivity,w ide linear range,good stability and high selectivity.It w as successfully applied to the determination of the total proteins in human b