{組織設(shè)計}植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)的綜述

1、（組織設(shè)計）植物組織培養(yǎng) 脫毒快繁技術(shù)的綜述20XX年XX月峯年的企業(yè)咨詢咸問經(jīng)驗.經(jīng)過實戰(zhàn)驗證可以藩地執(zhí)行的卓越萱理方案.值得您下載擁有植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)的綜述李西雁（廣西職業(yè)技術(shù)學院農(nóng)業(yè)技術(shù)工程系2002級應用生物技術(shù)專業(yè)）摘要：脫除病毒是植物組織培養(yǎng)深入探討研究中的壹個技術(shù)難題。本文結(jié)合于 桂林萊茵生物科技股份有限公司的實踐 情況 ，簡要 介紹 植物 組織培養(yǎng)的基本原 理和方法，綜述植物脫除病毒的熱處理、 莖尖培養(yǎng)和抗病毒藥劑三種方法的原理、 發(fā)展史和技術(shù)方法 ，且介 紹了幾種 常用的病毒檢測 方法。本文以馬 鈴薯為 例 ， 重 點 介紹了利用熱處理加莖尖組織培養(yǎng)法獲得馬鈴薯脫毒苗

2、的具體技術(shù)方 法，脫毒率可達100%。同時仍對 植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)的應用前景作了 分 析。關(guān)鍵詞：莖尖培養(yǎng)，組織培養(yǎng)，快繁脫毒技術(shù)，病毒檢測，應用前景1植物組織培養(yǎng)研究簡介1.1研究簡史自從1943年懷特（White）提出植物細胞“全能性” （Totipotency）學說 及諸多后學者（Steward，1958，Guha和Marteshwari，1964）相繼證實后， 引發(fā)植物組織和細胞培養(yǎng)快繁技術(shù)的勃然興起。 我國的專家學者于20世紀70年 代后也于此領(lǐng)域做了大量的研究和開發(fā)工作，創(chuàng)造了很多新方法、新技術(shù)，提出 不少新成果，開拓了植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的新局面1。目 前采 用組織培養(yǎng)脫

3、病毒快繁及離體快繁生 產(chǎn)株苗的 技術(shù)已發(fā) 展相當成熟2。脫毒株苗具有無雜 菌、適應 能力 較強 、繁育 較快 、質(zhì)量優(yōu)、抗性 好、 分蘗性強、繁殖系數(shù)高、大批量生產(chǎn)、周年供應、便于運輸?shù)葍?yōu)點，已得 到有關(guān)專家的鑒定及高 度評 價 和 種 植 試 驗 區(qū) 、種 植 產(chǎn) 區(qū) 果 農(nóng) 的 認 可 。 例 如 脫毒馬鈴薯、脫毒紅薯、脫 毒生姜、脫毒大蒜、脫毒草莓、脫毒苗木、脫毒花卉等等，已成為現(xiàn)代農(nóng)民致富的新寵2。1.2植物組織培養(yǎng)和脫毒快繁的定義植物組織培養(yǎng)（Planttissueculture）是指于無菌的條件下，將離體的植物 （根、莖、葉、花、果實、種子等）、組織（形成層、花藥組織、胚乳、皮層等

4、） 細胞（體細胞和生殖細胞）以及原生質(zhì)體，培養(yǎng)于人工配制的培養(yǎng)基上，給予適 當?shù)呐囵B(yǎng)條件，使其長成完整的植株。由于培養(yǎng)物是脫離植物母體，于玻璃瓶中 進行培養(yǎng)，所以也叫做離體培養(yǎng)。其完整過程是：脫分化再分化生長根莖葉外植體愈傷組織生長點或完整植株發(fā)生胚狀體于有些情況下，再分化也可不經(jīng)愈傷組織階段，而直接發(fā)生于脫分化的細胞1植物組織培養(yǎng)脫毒快繁是人工于無菌條件下利用植物體的壹部分，于人工控 制的營養(yǎng)和環(huán)境條件下繁殖植物，脫除病毒得到無毒苗株，繼而于大田快速繁殖 的技術(shù)。脫毒及離體快繁，這是目前植物組織培養(yǎng)應用最多、最廣泛和是有效的 壹個方面。主要是進行莖尖培養(yǎng)脫除病毒。對于脫毒苗、新育成、新引進、

5、稀缺 良種、優(yōu)良單株、瀕危植物和基因工程植株等可通過離體快速繁殖，同時可不受 地區(qū)和氣候的影響，比傳統(tǒng)的繁殖方法快數(shù)萬倍。植物組織培養(yǎng)已發(fā)展成為壹門 富有生命力的學科。追究植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)的發(fā)展簡史，于11世紀就出現(xiàn)的熱處理脫 毒法，最早解決壹些作物的病毒病害問題1。本世紀50年代發(fā)展的植物組織培 養(yǎng)技術(shù)為脫毒提供了壹條有效途徑。當下植物的脫毒技術(shù)有多種，其中應用最廣 泛的有三種：熱處理法、莖尖培養(yǎng)脫毒法、抗病毒藥劑法，將不同的方法相結(jié)合起來應用效果更好。它們的脫毒原理各不相同2脫毒技術(shù)及其原理2.1熱處理法2.1.1概述熱處理法是利用病毒和寄主植物對高溫的忍耐性的差異，使植物的生長速

6、度 超過病毒的擴散速度，得到壹小部分不含病毒的植物分生組織，然后進行無毒個 體培育。熱處理法中，最主要的影響因素是溫度和時間。熱處理可通過熱水浸泡或濕 熱空氣進行。 熱水浸泡對休眠芽效果較好， 濕熱空氣對活躍生長的莖尖效果較好， 既能消除病毒又能使寄主植物有較高的存活機會。熱空氣處理比較容易進行，把 旺盛生長的植物移入到1個熱療室中，于3540C下處理壹段時間即可，處理時 間的長短，可由幾分鐘到數(shù)月不等4。熱處理的方法有恒溫處理和變溫處理，處 理的材料能夠是植株，也能夠是接穗。2.1.2原理熱處理脫毒是根據(jù)病毒和寄生細胞對高溫的忍耐程度不同，選擇適當?shù)臏囟?和處理時間，植物組織中的很多病毒被部

7、分地或完全地鈍化而可控制其的活動， 但很少傷害甚至不傷害寄主組織，從而讓植物細胞加快生長，使生長點附近不帶 病毒，從而達到脫毒的目的。2.1.3簡史用熱處理脫除馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）是世界上脫除已知病毒最早的例子。早于1889年，印度尼西亞爪哇人就把繁殖用的甘蔗切斷放于50C左右的熱水中浸泡30min來防止枯萎?。ìF(xiàn)已知是病毒?。┑陌l(fā)生。當下世界許多國家于種 植前仍使用這種方法處理甘蔗?？墒呛髞砣藗儼l(fā)現(xiàn)熱水對植物的傷害大，Bake(1972)研究表明于熱水處理中， 由于植物組織經(jīng)過淋洗， 于水中長期浸泡常 常會窒息死亡，且且這種處理也會打破或延長植物的休眠期。所以當下更常用的 方法是將病毒

8、感染的植物用35C38C熱空氣處理24周或者更長時間進行脫 毒4。此法尤其適合處理生理干旱的材料和處于休眠狀態(tài)的果樹。熱處理脫毒法已應用多年，被世界多個國家利用。該項技術(shù)要求的設(shè)備條件 比較簡單，脫毒操作也比較容易。 主要缺點是脫毒時間長， 脫毒不完全，例如TMV這類桿狀病毒就不能用這種方法脫除，因而該方法有壹定的局限性。2.2莖尖培養(yǎng)脫毒法2.2.1概述莖尖培養(yǎng)脫毒就是采取莖尖分生組織離體培養(yǎng)的方法獲取無病毒試管苗，其 方法是于解剖鏡下，用鋒利的解剖刀進行迅速準確地莖尖剝離，因為莖尖分生組 織基本不帶病毒，利用植物莖尖分生組織進行離體培養(yǎng)，再結(jié)合病毒檢測，就能 夠獲得無病毒的植株。莖尖培養(yǎng)中

9、最主要的影響因素就是切取莖尖的大小，壹般要求莖尖長度小于1mm。技術(shù)上通常切取莖尖越小，脫毒效果越好，可是莖尖培養(yǎng)成活率變低。 曹為玉等研究發(fā)現(xiàn)葡萄莖尖長度和存活率成正關(guān)聯(lián)，和脫毒率成反關(guān)聯(lián)。當切取 莖尖長度為0.20.3mm時，存活率為21%38%，脫毒率為91.4%97%；當 切取0.5mm之上時，存活率為75%83%，脫毒率僅為70.6%76.5%8。莖尖培養(yǎng)脫毒法脫毒率高，脫毒速度快，能于較短的時間內(nèi)得到較多的原種 繁殖材料，但這種方法存于的缺點是植物的存活率低。為了克服這壹缺點，當下 經(jīng)常是將莖尖培養(yǎng)和熱處理相結(jié)合來使用。莖尖培養(yǎng)和熱處理相結(jié)合之所以能夠 提高脫毒效果，是由于熱處理可

10、使植物生長本身所具有的頂端免疫區(qū)得以擴大， 有利于切取較大的莖尖(于1mm左右)，從而能夠提高培養(yǎng)或嫁接的成活率。 如大櫻桃置于45C的恒溫培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)35天，再切取0.20.4mm的莖尖培 養(yǎng)，平均脫毒率為98%。2.2.2原理莖尖培養(yǎng)脫毒的原理是植物體內(nèi)病毒靠維管束系統(tǒng)移動，分生組織中沒有維管束 存于，病毒只靠胞間連絲移動，速度很慢，難以追上生長活躍的分生組織，所以 旺盛生長的根尖、莖尖壹般均無病毒或很少有病毒分布。2.2.3簡史White于1943年首先發(fā)當下感染煙草花葉病毒的煙草生長點附近病毒的濃度很 低，甚至沒有病毒。這壹發(fā)現(xiàn)為莖尖培養(yǎng)脫除病毒提供了理論依據(jù)。懷特 (White,1

11、934)于體外培養(yǎng)感染了TMV病毒的馬鈴薯根，且用枯斑寄主法測定 了根不同部位的病毒含量，發(fā)現(xiàn)根尖部位的病毒含量比其他部位少，甚至不存于 病毒。Morel等1952年首先從感染了花葉病毒和斑萎病毒的大麗花植株上切取 莖尖，通過組織培養(yǎng)獲得了無病毒的大麗花， 證明了前人假設(shè)的正確性1。此后， 人們采用莖尖培養(yǎng)技術(shù)相繼獲得了多種植物的無病毒植株。當下莖尖培養(yǎng)脫毒法 已經(jīng)成為植物無毒苗生產(chǎn)中應用最廣泛的壹種方法。1998年，桂林市大地生物技術(shù)研究所和廣西山河經(jīng)濟發(fā)展公司聯(lián)合開展羅 漢果脫毒苗的培育生產(chǎn)技術(shù)科技攻關(guān)， 于選出的健康植株中選取營養(yǎng)體,經(jīng)過莖尖 培養(yǎng)和其它脫毒方法相結(jié)合脫毒后進行組織培養(yǎng)，

12、從而獲得不帶病的健康苗。經(jīng) 農(nóng)業(yè)種植區(qū)試點種植表明，這些經(jīng)莖尖培養(yǎng)脫毒快繁得到的羅漢果脫毒苗植株健 壯無病，長勢旺，結(jié)果早，數(shù)量多，品質(zhì)高，和傳統(tǒng)壓蔓技術(shù)種植的普通苗相比， 種后第壹年結(jié)果的植株達50%70%，增加近壹倍；平均每株掛果約30個，增 加了倆倍，壹級果增加了15%，有效成分羅漢果甜甙的收取率則提高了5%。廣西農(nóng)科院生物所杭玲 等于羅漢果莖尖脫毒快繁技術(shù)壹文中試驗， 選擇羅漢果青皮果品種 ，采用種子播種的實生苗,經(jīng)接花葉病毒而致病的植 株，運用莖尖培養(yǎng) 和熱處理相結(jié)合的方法對 供試材料進行 除病毒，經(jīng)用 生物學指示植物鑒定,脫 毒率 達100%。據(jù)研究，植物體內(nèi)某壹部分組織器官不帶病

13、毒的原因是：分生組織的細胞生 長速度快，病毒于植物體內(nèi)繁殖的速度相對較慢，而且病毒的傳播是靠篩管組織 進行轉(zhuǎn)移或通過細胞間連絲傳遞給其他細胞，因此病毒的傳遞擴散也受到壹定限 制，這樣便造成植物體的部分組織細胞沒有病毒。根據(jù)這個原理，能夠利用莖尖 培養(yǎng)來培育無病毒苗木。2.3抗病毒藥劑法2.3.1概述抗病毒藥劑法，這是壹種新的脫毒方法，運用壹些抗病藥劑的作用影響病毒RNA的復制形成， 干擾病毒的正常生長， 從而達到除去病毒的目的。 常用的抗病 毒化學藥物有三氮唑核苷（病毒唑） ，5-二氫尿嘧啶（DHT）和雙乙酰-二氫-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）。這些藥物常常通過直接注射到帶病毒的植株上，或者加

14、 到植株生長的培養(yǎng)基上。這種方法壹般要和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合應用。經(jīng)過抗病毒藥 劑處理的嫩莖，切取莖尖，再進行組織培養(yǎng)，就會提高脫毒率和成活率。采用病毒抑制劑和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的脫毒方法， 能夠較容易的脫除多種病毒， 而且這種方法對取材要求不嚴，接種莖尖可大于1mm，易于分化出苗，提高存 活率。2.3.2原理抗病毒藥劑法的作用原理是抗病毒藥劑于三磷酸狀態(tài)下會阻止病毒RNA帽 子結(jié)構(gòu)形成而達到除去病毒的效果。58e簡史羅曉芳等于1996年曾于培養(yǎng)基中加入病毒唑， 脫除了倆種蘋果潛隱病毒1。除了之上三種脫毒方法以外， 花藥培養(yǎng)法、 莖尖嫁接脫毒、 愈傷組織培養(yǎng)法、 胚珠培養(yǎng)法也可用于植物組織培養(yǎng)快繁脫毒。

15、3脫毒效果的檢測方法經(jīng)過脫毒處理的植株是否仍存于病毒，必須經(jīng)過病毒學檢測才能確定。可靠的病毒檢測方法和建立有效的脫毒方法同等重要。傳統(tǒng)上壹直沿用的檢測方法是目測法，可是這種方法無法剔除潛隱性病毒。后來出現(xiàn)的指示植物法，擴大了檢測范圍。近年來隨著生物科學的迅猛發(fā)展，免疫學方法，分子生物學方法等許多先進 的理化技術(shù)的應用，促進了病毒檢測技術(shù)的改進和發(fā)展。下面簡要介紹幾種檢測 脫毒苗的方法。3.1植株直接測定法直接觀察植株莖葉有無某種病毒引起的可見癥狀，是最簡單的測定方法。 不過，由于某些寄 主植物感染病毒后需要較 長的時間才出現(xiàn)癥狀，有的 且不能使寄主植物出現(xiàn)可見的癥狀，因而無法快速檢驗。3.2指

16、示植物法此法最早是美國的病毒學家Holmesl929年發(fā)現(xiàn)的1。利用病毒 于 其 他植物 上出 現(xiàn)癥 狀的 特征， 作為 鑒別 種類 的 標準 。 當原始寄主的癥狀不 明顯時，就可用指示植物法，這是因為指示植物比原始寄主更容易表現(xiàn)癥狀。具體做法是將病葉研磨，把汁液接種到寄主植物上，對于木本植物，是將原始寄主 嫁接到指示植物上。指示植物法簡便易行， 成本低，但它靈敏性差， 所需時間長， 難以區(qū)分病毒種類。3.3血清學方法 抗血清鑒定法要進行抗原的制備（包括病毒的繁殖，病葉研磨和 粗汁液澄清等），抗血清的采收、分離等。血清可分裝到小玻璃瓶中，貯存于-15-25C的冰凍條件下。測定時，把稀釋的抗血清

17、和未知的病毒植物 于小試管內(nèi)混合， 這壹反應導致形成可見的沉淀， 然后根據(jù)沉淀 反應來鑒定病 毒。 此法靈敏度高 ，獲得檢測結(jié)果迅速，是 目前檢測病毒的壹種最好方 法。此外，PCR微量板雜交法、蛋白質(zhì)電泳法、嫁接檢測法、電子顯微鏡檢定 法、病毒癥狀學診斷法等也能夠用來檢測植物病毒。4馬鈴薯組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)鑒于當前農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物生產(chǎn)上苗木（主要是無性繁殖作物）存于著嚴重病毒 累積、品種退化、產(chǎn) 量和 品質(zhì)大幅度的下降等問題， 探索壹種脫毒效果好、 繁殖系數(shù)高、簡易且經(jīng)濟的繁育良種及健苗技術(shù)，是當前農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物種苗木生 產(chǎn)中急需研究和探討的課題。下面通過以馬鈴薯為例，進行熱處理加莖尖培養(yǎng)結(jié) 合病

18、毒檢測法獲得脫毒苗的方法， 簡述植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)的應用。4.1研究簡史 馬鈴薯于種植過程中易感染病毒，當條件適合時，就會于植株體內(nèi)增殖，轉(zhuǎn)運和 積累于所結(jié)薯塊中，且且世代傳遞，逐年加重4。病毒的增殖和植物正常代謝極 為密切，目前尚沒有發(fā)現(xiàn)既能殺死病毒又不損傷植物的藥劑，病毒危害壹度成為馬鈴薯的不治之癥。1953年Nirris將孔雀石綠(Malachitegreen)加入培養(yǎng)基 中抑制病毒繁殖，且通過莖尖組織培養(yǎng)，獲得青山(Greenmountain)品種無PVX(馬鈴薯X病毒)的馬鈴薯植株。 此后， 通過莖尖組織培養(yǎng)獲得無病毒植株 的技術(shù)迅速發(fā)展，為解決馬鈴薯病毒危害提供了有效途徑，

19、為生產(chǎn)提供優(yōu)良種薯。 目前，國際上用莖尖培養(yǎng)產(chǎn)生的馬鈴薯品種已達150個左右1?？茖W研究結(jié)果證明，侵染馬鈴薯的病毒有20多種。這些病毒壹旦侵入馬鈴 薯植株和塊莖，就會引起馬鈴薯退化，出現(xiàn)各種各樣的病態(tài)，造成不同程度的減 產(chǎn)。研究的結(jié)果仍證明，病毒于植物組織中分布是不均勻的，且且受壹定環(huán)境條 件影響，于靠近馬鈴薯莖的頂端病毒濃度很低或不含病毒。根據(jù)這壹特點，通過 莖尖培養(yǎng)能夠獲得馬鈴薯無病毒苗3。另外，馬鈴薯病毒，有的對溫度比較敏感， 有的不敏感，但對植株或發(fā)芽的塊莖進行高溫處理后再作莖尖培養(yǎng)，壹般脫毒率 均比較高。因此，于莖尖培養(yǎng)前，對植株和發(fā)芽塊莖進行3035C,28天的高溫預處理，能收到良

20、好的效果。4.2馬鈴薯莖尖培養(yǎng)脫毒方法 利用莖尖組織培養(yǎng)結(jié)合病毒檢測，對馬鈴薯進行脫毒，進而生產(chǎn)脫毒種薯用 于生產(chǎn)，可有效地防止種薯退化，大幅度提高馬鈴薯產(chǎn)量3。其主要脫毒方法如 下：4.2.1取材和消毒將欲脫毒地品種塊莖催芽，芽長45cm時，剪芽且剝?nèi)ネ馊~，自來水下沖 洗40min，于無菌室內(nèi)用漂白粉溶液消毒后，無菌水沖洗23次。離莖尖和接種于無菌室內(nèi)，于40倍地解剖鏡下，剝?nèi)?個葉原基地莖尖，接種于MS莖尖培養(yǎng)基地試管中。試管中的MS莖尖培養(yǎng)基包括大量元素、微量元素、有機 成分和生長素、細胞分裂素、蔗糖和瓊脂，pH值為5.8，經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后使 用，每試管接種1個莖尖。養(yǎng)基和培養(yǎng)條件莖

21、尖培養(yǎng)的關(guān)鍵是獎脫毒后的莖尖透導生成帶有完整根、莖、的植株，因此選擇適合的培養(yǎng)基十分重要。對于馬鈴薯的莖尖培養(yǎng)來說，需要較多的N03和NH4+營養(yǎng)，MS和Miller基本培養(yǎng)基均是較好的培養(yǎng)基，而且附加少量 (01.mol/l0.5mol/l)的生長素或細胞分裂素或二者均加，培養(yǎng)的效果更好。接種的莖尖培養(yǎng)于25C、15003000LX光照條件下培養(yǎng)室內(nèi)，3個月則長成34片葉的小植株于無菌條件下，進行切段擴繁壹次，取部分苗進行病毒檢測6。毒檢測病毒檢測是莖尖脫毒不可缺少的步驟。常用鑒別寄主即指示植物或血清學方 法進行檢測，及時淘汰血清學陽性反應或于指示植物上有癥狀的莖尖苗，無任何 反應的莖尖苗即

22、脫毒苗用作大田快速繁殖。果 通過利用莖尖組織培養(yǎng)結(jié)合病毒檢測法獲得馬鈴薯脫毒苗，經(jīng)病毒檢測，除去了馬鈴薯中的病毒病，脫毒率可達100%。5植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)應用前景的簡述植物組織培養(yǎng)技術(shù)于作物上主要用于育種和良種繁殖，其次用于無性繁殖作 物的脫毒和快繁以及種質(zhì)的保存等，可見植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)對于農(nóng)作物 苗木的生產(chǎn)具有極其重要的地位1。壹些農(nóng)作物或是花卉植物等因長期的栽培和 種植，植物體內(nèi)被侵染攜帶病毒、種性退化當下能利用組織培養(yǎng)及快繁脫毒方法 開發(fā)出的植物脫毒新品種有馬鈴薯、甘薯、生姜、大蒜、草莓、羅漢果、棕櫚、 劍麻、香蕉、甘蔗以及花卉植物等幾百種再生植株。目前這種技術(shù)已得到了廣

23、泛 應用，前景及范圍非常廣闊。脫毒株苗的快繁技術(shù)是，經(jīng)過莖尖培養(yǎng)和檢測取得的脫毒苗，首先按不同品 種保存于管瓶中。于需要時對脫毒苗進行切段繁殖，繁殖試管苗壹般均用MS培 養(yǎng)基，于100ml的三角瓶接種46節(jié)段。每節(jié)含壹個葉片。于無菌條件下進行 培養(yǎng)。培養(yǎng)的節(jié)段經(jīng)過35天即可生根，幼芽也從葉腋發(fā)出，10天左右可形成23片葉的幼苗。20天左右即長成56片葉的小植株。 壹個三角瓶有46株脫 毒苗。這些小植株又可按上述方法進行切段繁殖， 從而擴大無病毒苗株的數(shù)量7。6結(jié)論由微生物所引起的植物組織培養(yǎng)污染壹直是當前制約植物組培發(fā)展的主要 障礙，特別于接種和培養(yǎng)過程中， 污染率常常高達80%之上。如何解決這個問題 已經(jīng)引起很多人的重視.國內(nèi)許多研究人員開展了這方面的壹些研究， 但仍欠缺更 深入的研究探討。這是有待去探討開發(fā)的壹個課題。本文結(jié)合了筆者于桂林萊茵生物科技股份有限公司的實習 實踐 ，綜合了 自 己通 過做實驗 和工作實踐 中獲得的 知識 和想法 ，對國 內(nèi)外植物 組織培養(yǎng)的 研究簡介作了簡要 介紹，詳細地綜述了植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)和方 法以 及 病 毒檢 測 方 法， 且 對脫毒快繁的應用前景作了較詳 盡