細(xì)胞融合試驗(yàn)報(bào)告

1、【實(shí)驗(yàn)題目】動(dòng)物細(xì)胞融合【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 了解動(dòng)物細(xì)胞融合的常用方法。2. 學(xué)習(xí)化學(xué)融合的基本操作過(guò)程。3. 觀察動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程中細(xì)胞的行為與變化?！緦?shí)驗(yàn)材料與用品】1、材料雞血紅細(xì)胞2、試劑50%PEG、GKN溶液、Alsever ' s細(xì)胞保存液、0.85%氯化鈉溶液。3、器材倒置顯微鏡、離心機(jī)、載玻片、蓋玻片、離心管、廢液缸、滴管等?！緦?shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞融合是指在自發(fā)或者誘導(dǎo)條件下，兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并為雙核或者多核細(xì)胞的 過(guò)程。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有很多方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合，包括：病毒誘導(dǎo)融合、化學(xué)誘導(dǎo)融 和和電激誘導(dǎo)融合。1、病毒誘導(dǎo)融合仙臺(tái)病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒

2、等可以介導(dǎo)細(xì)胞的融時(shí)也可介導(dǎo)細(xì)胞與 細(xì)胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生融合。2、化學(xué)誘導(dǎo)融合很多化學(xué)試劑能夠誘導(dǎo)細(xì)胞融合，如聚乙二醇 (PEG)、二甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶 血性卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些物質(zhì)能夠改變細(xì)胞膜脂質(zhì)分子的排列，在去除這些物質(zhì) 之后，細(xì)胞膜趨向于恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)。在恢復(fù)過(guò)程中想接觸的細(xì)胞由于接口處脂質(zhì)雙分 子層的相互親和與表面張力，細(xì)胞膜融合，胞質(zhì)流通，發(fā)生融合?；瘜W(xué)誘導(dǎo)方法，操作方便， 誘導(dǎo)融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動(dòng)、植物細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性。PEG是廣泛使用的化學(xué)融合劑。3、電激誘導(dǎo)融合包括電誘導(dǎo)、激光誘導(dǎo)等。其中，電誘導(dǎo)

3、是先使細(xì)胞在電場(chǎng)中極化成為偶極子，沿電力 線排布成串，再利用高強(qiáng)度、短時(shí)程的電脈沖擊破細(xì)胞膜，細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子發(fā)生重排，由 于表面張力的作用，兩細(xì)胞發(fā)生融合。電誘導(dǎo)方法具有融合過(guò)程易控制、融合概率高、無(wú)毒 性、作用機(jī)制明確、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)?！緦?shí)驗(yàn)步驟】在本次實(shí)驗(yàn)中采用的是化學(xué)誘導(dǎo)融合的方法，利用PEG使雞血紅細(xì)胞發(fā)生融合。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：1、取雞血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混勻后制懸液（4°C保存）【老師已 做好，可直接使用】2、?。?）中懸液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，進(jìn)行以下三次離心處理：在1200r/min下離心5min，去

4、掉上清液，再加入 0.85%的 NaCl溶液至5ml；1000-1200r/min下離心5min,去掉上清液，再加入 0.85%的 NaCl溶液至5ml; 1000-1200r/min下離心7min【因時(shí)間關(guān)系此次實(shí)驗(yàn)只離心一次】3、 將離心后的沉降血球（去上清后約 0.1-0.2ml ）加入GKNS 1-2ml，使之成為10%勺細(xì)胞 懸液；4、 取上述10%勺血球懸液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000個(gè)；5、 分別?。?） 1ml+0.5ml50%PEG（ 4） 0.5ml+0.5ml50%PEG （4） 0.5ml+1.0ml50%PEG 混勻滴片，編號(hào)分別為號(hào)溶液

5、。在常溫下2-3min后，顯微鏡下觀察?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】1、實(shí)驗(yàn)中可觀察到兩個(gè)和多個(gè)細(xì)胞發(fā)生質(zhì)膜融合現(xiàn)象 ，可看到不同融合狀態(tài)的細(xì)胞： 兩細(xì)胞的細(xì)胞膜相互接觸、粘連；接觸部分的細(xì)胞膜崩解，兩細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)相同，形成一個(gè)細(xì)胞質(zhì)的通道，呈現(xiàn)啞鈴狀; 通道擴(kuò)大，兩個(gè)細(xì)胞連成一體，呈現(xiàn)一個(gè)長(zhǎng)橢圓形細(xì)胞； 細(xì)胞融合完成形成含有雙核或者多核的細(xì)胞，呈圓形。比較典型的細(xì)胞融合時(shí)的形態(tài)如下圖：圖1圖5圖6圖4步 融 合細(xì) 胞 進(jìn)初 步 接 觸 融 合V圖7圖8融合完成2、在三種不同濃度的細(xì)胞懸液中，所觀察到的細(xì)胞發(fā)生質(zhì)膜融合的比率不同，如下圖所示:圖2：2號(hào)溶液中細(xì)胞融合整體圖像圖1：1號(hào)溶液中細(xì)胞融合整體圖像圖3

6、：3號(hào)溶液細(xì)胞融合整體圖像【討論與結(jié)論】1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)PEG的介導(dǎo)融合，雞血紅細(xì)胞中有少部分細(xì)胞發(fā)生了融合，且多處于融合剛開(kāi)始的 階段。大部分細(xì)胞仍處于離散狀態(tài)，另外，視野中還發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞聚集成團(tuán)的現(xiàn)象。另外，本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了細(xì)胞懸液三個(gè)不同濃度的融合實(shí)驗(yàn)，1ml+0.5ml50% PEG0.5ml+0.5ml50%PEG 0.5ml+1.0ml50%PEG前兩組的細(xì)胞融合率明顯沒(méi)有第三組的細(xì)胞融合 率高，因此可以得出結(jié)論：在一定范圍內(nèi)，PEG的濃度越高，細(xì)胞融合率越高。另外，由于本次實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞懸液濃度偏低，因此無(wú)法直觀的對(duì)前兩組進(jìn)行融合率的比較，但從理論上 分析，在PEG濃度一定時(shí)應(yīng)該是細(xì)胞

7、濃度高的融合率高（細(xì)胞間的接觸幾率增大）。2、結(jié)果分析本次細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)采用的是雞血紅細(xì)胞，鳥(niǎo)類紅細(xì)胞存在細(xì)胞核，且細(xì)胞體積較大，易于 實(shí)驗(yàn)觀察。本次實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間關(guān)系只進(jìn)行了一次離心，而正常實(shí)驗(yàn)過(guò)程是要進(jìn)行三次離心，目的是充 分清洗細(xì)胞表面，使細(xì)胞接觸面積達(dá)到最大，有利于細(xì)胞間的融合。每次離心前都要將樣品 小心混勻，否則有可能出現(xiàn)聚集成團(tuán)的細(xì)胞。若視野中出現(xiàn)聚集成團(tuán)的細(xì)胞，還有一種可能：制備的雞血紅細(xì)胞懸液濃度過(guò)高。 視野中經(jīng)常會(huì)看到兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞接觸在一起，此時(shí)不一定就是融合的細(xì)胞，需要轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì) 準(zhǔn)焦螺旋對(duì)接觸部分進(jìn)行觀察，通過(guò)觀察接觸部位細(xì)胞膜的有無(wú)判斷其為融合細(xì)胞還是重疊 在一起的細(xì)胞。 本

8、次實(shí)驗(yàn)采用的是PEG介導(dǎo)，融合效果受到以下幾個(gè)因素的影響：PEG分子的分子量和濃度、 PEG乍用時(shí)間、融合溫度、PH值。在一定范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)節(jié)這些條件，可以將融合率提高。但 在進(jìn)行科研時(shí)還應(yīng)考慮到，PEG分子對(duì)細(xì)胞存活的影響（PEG具有一定的毒性，且分子量越大 毒性越大），因此取分子量 800-1000 較適合。 1號(hào)試管中的細(xì)胞懸液出現(xiàn)類似血絲的懸濁物， 可能是加入PEG之后沒(méi)有及時(shí)混合均勻，細(xì) 胞大量聚集。因此在加入PEG后先反應(yīng)30s左右后小心混勻，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞融合不充分。 且在加入時(shí)盡量避免震動(dòng)。附：細(xì)胞融合的應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞融合是從細(xì)胞水平來(lái)改變動(dòng)物細(xì)胞的遺傳性，可用于生產(chǎn)單克隆抗體、疫

9、苗等 特定的生物制品。在培育動(dòng)物新品種時(shí)，縮短動(dòng)物的育種過(guò)程。動(dòng)物細(xì)胞融合的應(yīng)用范圍已 廣及生物學(xué)的各個(gè)分支學(xué)科。動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)對(duì)于研究細(xì)胞分化、基因定位、腫瘤發(fā)生機(jī)制等方面都有重要意義。 在實(shí)際應(yīng)用方面，動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)在藥物定向釋放系統(tǒng)、細(xì)胞治療以及抗腫瘤免疫等方面 起到重要的乍用。1、生產(chǎn)單克隆抗體單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞既能像骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無(wú)限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)。2、用于基因定位和繪制人類基因圖譜 雜種細(xì)胞中某一染色體或其片段的存在與否與細(xì)胞的某

10、一性狀表達(dá)與否相聯(lián)系， 從而可 以實(shí)現(xiàn)把基因定位于某一染色體或某一區(qū)段上。3、動(dòng)物育種體細(xì)胞核移植技術(shù)是將細(xì)胞核移植到另一細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的生物技術(shù)。 動(dòng)物體細(xì)胞融合 后，雜種細(xì)胞難以發(fā)育再生為一個(gè)個(gè)體。但借助于細(xì)胞核移植的方法將融合后雜種細(xì)胞的細(xì) 胞核移入去核成熟卵內(nèi)，可培育新的雜種。另外，細(xì)胞核移植技術(shù)的建立，還為目前進(jìn)行的 哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)做了良好的鋪墊。4、細(xì)胞療法將患者的任何體細(xì)胞與去核卵細(xì)胞融合， 融合子進(jìn)行有絲分裂形成囊胚， 囊胚的內(nèi)細(xì)胞 團(tuán)是多能干細(xì)胞，對(duì)多能干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)使其定向分化可形成所需的組織和器官用于器官移 植，不僅解決了器官和組織來(lái)源問(wèn)題，而且也避免宿主

11、對(duì)外來(lái)物的免疫排斥。5、植物細(xì)胞融合植物細(xì)胞融合在育種上有重要的應(yīng)用價(jià)值， 在生產(chǎn)研究應(yīng)用方面， 通過(guò)誘導(dǎo)不同種屬間 甚至不同科間原生質(zhì)體的融合， 可能打破有性雜交不親和性的界限， 廣泛地組合各種基因型， 從而有可能形成有性雜交方法所無(wú)法獲得的新型雜交植株。植物細(xì)胞融合可以將細(xì)胞器、DNA質(zhì)粒、病毒、細(xì)菌等外源遺傳物質(zhì)引入原生質(zhì)體， 從而有可能引起細(xì)胞遺傳性的改變，為某些珍稀動(dòng)物的復(fù)壯等提供了可行的方法，應(yīng)用于植 物育種、種質(zhì)保存、無(wú)性系的快速繁殖和有用物質(zhì)生產(chǎn)等等。6、微生物細(xì)胞融合技術(shù) 對(duì)微生物而言，該技術(shù)主要用于改良微生物菌種特性，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，使菌種獲 得新的性狀，合成新產(chǎn)物等。

12、微生物細(xì)胞融合技術(shù)的一項(xiàng)突出應(yīng)用是生物藥品的生產(chǎn)，包括抗生素、生物活性物質(zhì)、 疫苗等。它適用于疾病的診斷、預(yù)防及治療等。另一方面的突出應(yīng)用就是為發(fā)酵工業(yè)提供優(yōu) 良菌種。僅供個(gè)人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途。For P ersonal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen fu r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recher

13、che uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.TO員bKO gHnrogeftko TOpMenob3ymTflCH6yHeHHac egoB u Huefigo 員冶hmucno 貝 b30BaTbc 刃B KoMMepqecKux以下無(wú)正文僅供個(gè)人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途。For P ersonal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen fu r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwend