細胞融合試驗報告

1、【實驗題目】動物細胞融合【實驗?zāi)康摹?. 了解動物細胞融合的常用方法。2. 學習化學融合的基本操作過程。3. 觀察動物細胞融合過程中細胞的行為與變化。【實驗材料與用品】1、材料雞血紅細胞2、試劑50%PEG、GKN溶液、Alsever ' s細胞保存液、0.85%氯化鈉溶液。3、器材倒置顯微鏡、離心機、載玻片、蓋玻片、離心管、廢液缸、滴管等?！緦嶒炘怼考毎诤鲜侵冈谧园l(fā)或者誘導(dǎo)條件下，兩個或兩個以上細胞合并為雙核或者多核細胞的 過程。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有很多方法可以誘導(dǎo)細胞融合，包括：病毒誘導(dǎo)融合、化學誘導(dǎo)融 和和電激誘導(dǎo)融合。1、病毒誘導(dǎo)融合仙臺病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒

2、等可以介導(dǎo)細胞的融時也可介導(dǎo)細胞與 細胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導(dǎo)細胞發(fā)生融合。2、化學誘導(dǎo)融合很多化學試劑能夠誘導(dǎo)細胞融合，如聚乙二醇 (PEG)、二甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶 血性卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些物質(zhì)能夠改變細胞膜脂質(zhì)分子的排列，在去除這些物質(zhì) 之后，細胞膜趨向于恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)。在恢復(fù)過程中想接觸的細胞由于接口處脂質(zhì)雙分 子層的相互親和與表面張力，細胞膜融合，胞質(zhì)流通，發(fā)生融合?；瘜W誘導(dǎo)方法，操作方便， 誘導(dǎo)融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動、植物細胞，但對細胞具有一定的毒性。PEG是廣泛使用的化學融合劑。3、電激誘導(dǎo)融合包括電誘導(dǎo)、激光誘導(dǎo)等。其中，電誘導(dǎo)

3、是先使細胞在電場中極化成為偶極子，沿電力 線排布成串，再利用高強度、短時程的電脈沖擊破細胞膜，細胞膜的脂質(zhì)分子發(fā)生重排，由 于表面張力的作用，兩細胞發(fā)生融合。電誘導(dǎo)方法具有融合過程易控制、融合概率高、無毒 性、作用機制明確、可重復(fù)性高等優(yōu)點?！緦嶒灢襟E】在本次實驗中采用的是化學誘導(dǎo)融合的方法，利用PEG使雞血紅細胞發(fā)生融合。具體實驗步驟如下：1、取雞血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混勻后制懸液（4°C保存）【老師已 做好，可直接使用】2、取（1）中懸液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，進行以下三次離心處理：在1200r/min下離心5min，去

4、掉上清液，再加入 0.85%的 NaCl溶液至5ml；1000-1200r/min下離心5min,去掉上清液，再加入 0.85%的 NaCl溶液至5ml; 1000-1200r/min下離心7min【因時間關(guān)系此次實驗只離心一次】3、 將離心后的沉降血球（去上清后約 0.1-0.2ml ）加入GKNS 1-2ml，使之成為10%勺細胞 懸液；4、 取上述10%勺血球懸液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000個；5、 分別?。?） 1ml+0.5ml50%PEG（ 4） 0.5ml+0.5ml50%PEG （4） 0.5ml+1.0ml50%PEG 混勻滴片，編號分別為號溶液

5、。在常溫下2-3min后，顯微鏡下觀察?！緦嶒灲Y(jié)果】1、實驗中可觀察到兩個和多個細胞發(fā)生質(zhì)膜融合現(xiàn)象 ，可看到不同融合狀態(tài)的細胞： 兩細胞的細胞膜相互接觸、粘連；接觸部分的細胞膜崩解，兩細胞的細胞質(zhì)相同，形成一個細胞質(zhì)的通道，呈現(xiàn)啞鈴狀; 通道擴大，兩個細胞連成一體，呈現(xiàn)一個長橢圓形細胞； 細胞融合完成形成含有雙核或者多核的細胞，呈圓形。比較典型的細胞融合時的形態(tài)如下圖：圖1圖5圖6圖4步 融 合細 胞 進初 步 接 觸 融 合V圖7圖8融合完成2、在三種不同濃度的細胞懸液中，所觀察到的細胞發(fā)生質(zhì)膜融合的比率不同，如下圖所示:圖2：2號溶液中細胞融合整體圖像圖1：1號溶液中細胞融合整體圖像圖3

6、：3號溶液細胞融合整體圖像【討論與結(jié)論】1、實驗結(jié)果經(jīng)過PEG的介導(dǎo)融合，雞血紅細胞中有少部分細胞發(fā)生了融合，且多處于融合剛開始的 階段。大部分細胞仍處于離散狀態(tài)，另外，視野中還發(fā)現(xiàn)有細胞聚集成團的現(xiàn)象。另外，本次實驗進行了細胞懸液三個不同濃度的融合實驗，1ml+0.5ml50% PEG0.5ml+0.5ml50%PEG 0.5ml+1.0ml50%PEG前兩組的細胞融合率明顯沒有第三組的細胞融合 率高，因此可以得出結(jié)論：在一定范圍內(nèi)，PEG的濃度越高，細胞融合率越高。另外，由于本次實驗中的細胞懸液濃度偏低，因此無法直觀的對前兩組進行融合率的比較，但從理論上 分析，在PEG濃度一定時應(yīng)該是細胞

7、濃度高的融合率高（細胞間的接觸幾率增大）。2、結(jié)果分析本次細胞融合實驗采用的是雞血紅細胞，鳥類紅細胞存在細胞核，且細胞體積較大，易于 實驗觀察。本次實驗由于時間關(guān)系只進行了一次離心，而正常實驗過程是要進行三次離心，目的是充 分清洗細胞表面，使細胞接觸面積達到最大，有利于細胞間的融合。每次離心前都要將樣品 小心混勻，否則有可能出現(xiàn)聚集成團的細胞。若視野中出現(xiàn)聚集成團的細胞，還有一種可能：制備的雞血紅細胞懸液濃度過高。 視野中經(jīng)常會看到兩個或多個細胞接觸在一起，此時不一定就是融合的細胞，需要轉(zhuǎn)動細 準焦螺旋對接觸部分進行觀察，通過觀察接觸部位細胞膜的有無判斷其為融合細胞還是重疊 在一起的細胞。 本

8、次實驗采用的是PEG介導(dǎo)，融合效果受到以下幾個因素的影響：PEG分子的分子量和濃度、 PEG乍用時間、融合溫度、PH值。在一定范圍內(nèi)適當調(diào)節(jié)這些條件，可以將融合率提高。但 在進行科研時還應(yīng)考慮到，PEG分子對細胞存活的影響（PEG具有一定的毒性，且分子量越大 毒性越大），因此取分子量 800-1000 較適合。 1號試管中的細胞懸液出現(xiàn)類似血絲的懸濁物， 可能是加入PEG之后沒有及時混合均勻，細 胞大量聚集。因此在加入PEG后先反應(yīng)30s左右后小心混勻，否則會導(dǎo)致細胞融合不充分。 且在加入時盡量避免震動。附：細胞融合的應(yīng)用動物細胞融合是從細胞水平來改變動物細胞的遺傳性，可用于生產(chǎn)單克隆抗體、疫

9、苗等 特定的生物制品。在培育動物新品種時，縮短動物的育種過程。動物細胞融合的應(yīng)用范圍已 廣及生物學的各個分支學科。動物細胞融合技術(shù)對于研究細胞分化、基因定位、腫瘤發(fā)生機制等方面都有重要意義。 在實際應(yīng)用方面，動物細胞融合技術(shù)在藥物定向釋放系統(tǒng)、細胞治療以及抗腫瘤免疫等方面 起到重要的乍用。1、生產(chǎn)單克隆抗體單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細胞與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細胞融合得到雜交瘤細胞，雜交瘤細胞既能像骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)。2、用于基因定位和繪制人類基因圖譜 雜種細胞中某一染色體或其片段的存在與否與細胞的某

10、一性狀表達與否相聯(lián)系， 從而可 以實現(xiàn)把基因定位于某一染色體或某一區(qū)段上。3、動物育種體細胞核移植技術(shù)是將細胞核移植到另一細胞的細胞質(zhì)中的生物技術(shù)。 動物體細胞融合 后，雜種細胞難以發(fā)育再生為一個個體。但借助于細胞核移植的方法將融合后雜種細胞的細 胞核移入去核成熟卵內(nèi)，可培育新的雜種。另外，細胞核移植技術(shù)的建立，還為目前進行的 哺乳動物體細胞克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)做了良好的鋪墊。4、細胞療法將患者的任何體細胞與去核卵細胞融合， 融合子進行有絲分裂形成囊胚， 囊胚的內(nèi)細胞 團是多能干細胞，對多能干細胞進行誘導(dǎo)使其定向分化可形成所需的組織和器官用于器官移 植，不僅解決了器官和組織來源問題，而且也避免宿主

11、對外來物的免疫排斥。5、植物細胞融合植物細胞融合在育種上有重要的應(yīng)用價值， 在生產(chǎn)研究應(yīng)用方面， 通過誘導(dǎo)不同種屬間 甚至不同科間原生質(zhì)體的融合， 可能打破有性雜交不親和性的界限， 廣泛地組合各種基因型， 從而有可能形成有性雜交方法所無法獲得的新型雜交植株。植物細胞融合可以將細胞器、DNA質(zhì)粒、病毒、細菌等外源遺傳物質(zhì)引入原生質(zhì)體， 從而有可能引起細胞遺傳性的改變，為某些珍稀動物的復(fù)壯等提供了可行的方法，應(yīng)用于植 物育種、種質(zhì)保存、無性系的快速繁殖和有用物質(zhì)生產(chǎn)等等。6、微生物細胞融合技術(shù) 對微生物而言，該技術(shù)主要用于改良微生物菌種特性，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，使菌種獲 得新的性狀，合成新產(chǎn)物等。

12、微生物細胞融合技術(shù)的一項突出應(yīng)用是生物藥品的生產(chǎn)，包括抗生素、生物活性物質(zhì)、 疫苗等。它適用于疾病的診斷、預(yù)防及治療等。另一方面的突出應(yīng)用就是為發(fā)酵工業(yè)提供優(yōu) 良菌種。僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途。For P ersonal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen fu r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recher

13、che uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.TO員bKO gHnrogeftko TOpMenob3ymTflCH6yHeHHac egoB u Huefigo 員冶hmucno 貝 b30BaTbc 刃B KoMMepqecKux以下無正文僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途。For P ersonal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen fu r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwend