整理豆粕中大豆異黃酮提取工藝研究設(shè)計(jì)

1、精品文檔豆粕中大豆異黃酮提取工藝研究大豆異黃酮 (Soy isoflavone) 是以大豆油渣為原料 ,經(jīng)過(guò)提取分離 ,加工成含 量達(dá) 30%-95% 的粉狀大豆異黃酮。近年來(lái)研究表明大豆異黃酮具有廣泛的生理活性, 除其自身作為異黃酮具有的抗氧化作用外,大豆異黃酮作為雌性激素治療 的替代品 ,可以改善婦女更年期綜合癥；其對(duì)與激素有關(guān)的腫瘤如乳腺癌和前列 腺癌的抑制作用更為顯著受到極大關(guān)注；此外 ,大豆異黃酮在治療和預(yù)防心腦血 管疾病方面也有明顯作用。 大豆異黃酮已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、 醫(yī)藥等行業(yè)。 大豆 異黃酮是多酚類混合物,分為游離型的甙元(Aglyco n)和結(jié)合型的糖甙 (Glucosid

2、es) 兩類。甙元包括染料木素 (Genistein) 、大豆黃素 (Daidzein) 和黃豆黃 素(Glycitein)。天然情況下它們主要以B-葡萄糖甙形式存在,即染料木甙 (Genistin) 、大豆黃甙 (Daidzin) 和黃素黃甙 (Glystin), 部分異黃酮甙發(fā)生乙?；?丙二酰化 ,但所有這些大豆異黃酮衍生物經(jīng)酸水解或酶催化分解后都能轉(zhuǎn)化為大 豆異黃酮甙元。大豆異黃酮所具有的良好的藥理作用顯示了它具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值,通過(guò)提取分離大豆異黃酮能充分合理利用大豆中的各種有效成分,提高其附加 值,實(shí)現(xiàn)良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。目前有關(guān)豆粕的提取工藝主要以乙醇為提取溶劑， 由于乙醇

3、系有機(jī)溶劑， 消 耗大、成本高、 且生產(chǎn)過(guò)程存在易燃等安全隱患， 為此我們根據(jù)豆粕異黃酮有一 定的水溶性， 試改用水做提取溶劑， 以大豆異黃酮為目標(biāo)， 對(duì)其大豆異黃酮進(jìn)行 了正交提取工藝研究， 并對(duì)最佳提取工藝得到的提取液進(jìn)行了大孔吸附樹(shù)脂吸附 分離性能研究，以期為豆粕大豆異黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。1 材料與儀器1.1 材料 豆粕 （采自陜西石羊公司 ），自然干燥，粉碎。1.2 試劑 染料木素和大豆黃素對(duì)照品 :百靈威化學(xué)；大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品 （中國(guó) 藥品生物制檢定所 1502-2001O1） 。大孔樹(shù)脂 ADS-21 、ADS-7 、D101 ，AB-8 購(gòu)自西安藍(lán)小科技開(kāi)發(fā)有限公司。 甲醇：色

4、譜純?cè)噭?，其余試劑均為分析純?.3 儀器 天津市泰斯特儀器有限公司 FZ102 植物粉碎機(jī)；德 Sartorius 賽 多利斯 ME235S- 電子分析天平； 上海亞榮生化儀器廠 RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀； 上 海醫(yī)療器械五廠H H S21-6C電熱恒溫水浴鍋；江蘇昆山超聲儀器公司KQ-50DB 超聲清洗器；鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司 SHB-C 循環(huán)水式多用真空泵；日本島津LC-20A 型高效液相色譜系統(tǒng) （包括 SPD-20A 檢測(cè)器、 LC-20A 型高壓恒流泵和LC Solution 工作站)；色譜柱：lnertsil C18 (4.6mm x250mm , 5 g);日本島津UV-1

5、700 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；日本島津 CS930 型薄層色譜掃描儀；日本島 津ZF 1型三用紫外分光儀；上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠 101A 2型鼓風(fēng)干燥箱；浙 江黃巖求精真空泵廠 2XZ-2 旋片式真空泵； 北京醫(yī)用離心機(jī)廠 LD5-10 高速離心 機(jī)；上海悅豐DE-10蒸餾水器；美國(guó)Bedford公司Milli-Q超純水制備儀；TGL-16C 型高速離心機(jī) ；上海滬西分析儀器廠有限公司 HL-2 恒流泵；上海大龍醫(yī)療器 械有限公司PotPette 100-1000 pl手動(dòng)單道可調(diào)式移液器；索式提取器；層析柱 (16 mm x30 cm) 。2 方法2.1 大豆異黃酮的薄層檢測(cè) 大豆異黃酮苷元的薄

6、層檢測(cè) 硅膠薄板制作稱取 4g 硅膠 GF254 置于研缽中，加入 0.5% 的羧甲基纖維素鈉溶液 12ml ， 研磨15min后鋪于20 X10cm的干凈玻璃平板上，要求平整無(wú)氣泡，然后晾干即可。展開(kāi)劑配制取展開(kāi)劑氯仿-無(wú)水甲醇10： 0.5的比例配制52.5ml（50 : 2.5）作為展開(kāi)劑。薄板活化：將制好的硅膠薄板在 105 C下活化30min。點(diǎn)樣：點(diǎn)樣點(diǎn)距板子底端 1.5cm 左右，所有點(diǎn)樣點(diǎn)位于同一直線上，盡可能向 中間靠攏，每個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)點(diǎn)樣約 20山點(diǎn)樣點(diǎn)盡可能小。0.5h。1.5cm飽和：將板子不沒(méi)入層析缸內(nèi)的展層劑中，在展層劑的蒸氣中飽和約 層析：將板子下端插入展層劑中進(jìn)行展

7、開(kāi)，當(dāng)展層劑前沿距板子上端約 時(shí)取出板子，自然晾干。觀察：展開(kāi)取出晾干后， 在 254nm 熒光燈下觀察， 斑點(diǎn)呈淺黃色。 Rf2.2紫外分光光度法測(cè)定大豆異總黃酮 22張玉梅，孫學(xué)斌，高旭年，等.紫外分光光度法測(cè)定大豆異總黃酮的含量J.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志.2000 ,12(4)7-92.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱取大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品 （中國(guó)藥 品生物制檢定所 1502-2001O1）2.0mg, 置于 25 mL 容量瓶中，以甲醇溶解并定容 至刻線，搖勻，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.1 ， 0.2， 0.3， 0.4， 0.6， 0.8 mL 置 于 10 mL 容量瓶中，用

8、甲醇稀釋至刻線，搖勻，以甲醇為空自，在 254nm 的波 長(zhǎng)處測(cè)定 A 值，以濃度為橫坐標(biāo)， A 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.138X-0.0056 ，R2=0.9994 ，線性范圍 (0.8-6.4 ml/L) 。222含量測(cè)定 精確量取供試品溶液O.OImL用無(wú)水甲醇稀釋1000倍到10 mL 定容，用 TU-9100 紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 254nm 處測(cè)定 A 值 3 次，取平均值 測(cè)定結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品含量。2.3 紫外分光光度法測(cè)定大豆異總黃酮關(guān)于測(cè)定大豆異黃酮的含量有采用比色法、 薄層色譜法、 氣相色譜法和高效液相色譜法等，比色法干擾多，專一性差，測(cè)定結(jié)果偏

9、差較大;薄層色譜法存在 分離效果差，定量不準(zhǔn)確等不足 ;氣相色譜法需要將樣品進(jìn)行衍生，操作繁瑣， 易受雜質(zhì)干擾 ;高效液相色譜法能檢測(cè)不同類型的異黃酮，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，設(shè)備運(yùn)行費(fèi)用較高，不適于在提取工藝探討中大量多次地監(jiān)測(cè)異黃酮.大豆異黃酮 為黃酮醇類化合物， 在紫外光區(qū)有較強(qiáng)吸收， 因此可采用適當(dāng)對(duì)照品， 用紫外分光光度法檢測(cè)大豆異黃酮含量9。9楊曉文.大豆異黃酮測(cè)定力法的研究概況J.中國(guó)油脂.2006,31(1):60-622.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取120 °C干燥至恒重的染料木素5mg置于50mL 容量瓶中，用 95% 乙醇溶解，并定容個(gè)刻度，搖勻、分別用移液管準(zhǔn)確吸取

10、0.5mL,1.0mL,1.5mL,2.0mL,2.5mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于 50mL 容量瓶中，并各加入95%乙醇1.Oml,再加蒸餾水稀釋個(gè)刻度，搖勻、以1 mL95%乙醇加水到 50mL作空白對(duì)照、在260nm處測(cè)吸光度，染料木素的濃度 C以他/mL為橫坐 標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程A=0.1676X-0.0118 , r=0.9982。2.3.2 樣品的制備 豆粕多功能食品粉碎機(jī)粉碎后，過(guò) 30 目篩，稱取粉碎樣品 5.0000g, 、將無(wú)水乙醇配成 70%濃度后取 40mL ，索氏提取豆粕粉末， 在 70C 恒溫水浴中提取2h,減壓抽濾去殘?jiān)?，回收溶劑至干，?95%

11、乙醇溶解，定容至 50mL容量瓶中，作為儲(chǔ)備液、準(zhǔn)確吸取儲(chǔ)備液2mL置5OmL容量瓶中，加95%乙醇I.OmL定容個(gè)刻度，搖勻、作平行樣3份。序號(hào)吸光度含量（用/g）平均含量（用/g）RSD(%)10.6353118.9620.6373119.28118.591.030.6277117.532.4高效液相色譜法測(cè)定大豆異黃酮的含量?jī)x器條件:Waters液相色譜儀；Ci8色譜柱，150mmX4.6mm, 5呵;流動(dòng)相：甲醇:水:磷酸=55:45:0.3;流速:0.6mL/min;柱溫:25 C ;檢測(cè)波長(zhǎng):260nm 。標(biāo)準(zhǔn)溶液：用十萬(wàn)分之一電子天平準(zhǔn)確稱量 5.Omg染料木素和5.Omg大豆黃

12、素 對(duì)照品，加入50mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品預(yù)處理:因大豆異黃酮甙元容易得到純品，所以測(cè)定大豆異黃酮含量時(shí)都以 甙元做對(duì)照品。這樣在進(jìn)行HPLC分析之前，需對(duì)大豆異黃酮樣品進(jìn)行預(yù)處理。準(zhǔn)確稱量5Omg待分析樣品于50mL錐形瓶中，加入3OmL甲醇和5mL質(zhì)量分 數(shù)為25%的鹽酸水溶液，在恒溫水浴鍋上 80 C加熱回流水解1h至大豆異黃酮甙完全水解為大豆異黃酮甙元后，把水解液用甲醇定容至5OmL容量瓶中，進(jìn)液相色譜進(jìn)行分析。樣品分析 :以標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰保留時(shí)間和峰面積與溶液濃度的對(duì)應(yīng)工作曲線為依 據(jù)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的相應(yīng)組分的換算系數(shù)計(jì)算樣品中總大豆異黃酮甙的含量。

13、2.5 RP-HPLC 測(cè)定大豆異黃酮的含量阮洪生，秦學(xué)功，陳志寶，等 . 大孔吸附樹(shù)脂富集豆粕中大豆異黃酮的工藝研究 J .黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào) 2007 ，19（ 5）：72-76采用 RP-HPLC 測(cè)定豆粕中以大豆苷和染料木苷為主的異黃酮含量。 色譜條件為色譜柱：KromasilCi8柱(4.6 mm X 250 mm, 5 呵);柱溫:30 C ;流動(dòng)相：甲醇-水 (3:7);流速:1.00 mL.min -1;檢測(cè)波長(zhǎng):260nm;進(jìn)樣量:10此。建立測(cè)定大豆苷與染料 木苷的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。用 ADS-21 大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行 大豆異黃酮分離實(shí)驗(yàn)A 樹(shù)脂處理1. 準(zhǔn)確稱取 20gNa

14、oH, 慢慢加入到盛有 300ml 蒸餾水的燒杯中溶解，稀釋至 500ml ，配成 4%的 NaoH 溶液。將新購(gòu) ADS-21 大孔吸附樹(shù)脂 300g 置于其中，其間不斷進(jìn)行攪拌，冷浸 3h, 之后用蒸餾水洗至中性。2. 精確量取 15ml 鹽酸，慢慢加入到盛有 300ml 蒸餾水的燒杯中溶解，稀釋至 500ml，配成3%HCL溶液。加入上步處理后的樹(shù)脂，冷浸 3h,攪拌，之后用蒸 餾水洗至中性。備用。3. 樹(shù)脂的再生：做過(guò)實(shí)驗(yàn)的樹(shù)脂用 4%的 NaoH 溶液冷浸 3h ,之后用蒸餾水洗至 中性備用。B 豆粕樣液制備2.3.2 豆粕樣液制備稱取粉碎后豆粕100g，加600ml 75%酒精于6

15、0 C熱回流提取120min，用4層紗布粗濾得粗濾液，殘?jiān)偌尤?500ml75%酒精于60 C熱回流提取90min，用4層紗布粗濾得粗濾液，殘?jiān)偌尤?00ml75%酒精于60 C熱回流提取90min ，用 4 層紗布粗濾得粗濾液，合并三次粗濾液，在用濾紙或離心過(guò)濾得豆粕提取液。提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的 1/5，再加入和濃縮液同體積的蒸餾水水，繼續(xù)蒸餾至餾出液中乙醇含量為10%時(shí)停止。調(diào) pH 為 4,使蛋白析出，離心 l5min ，倒出上清液，再將 pH 調(diào)到中性，得到豆粕大豆異黃酮溶液mg/ml )。C ADS-21 大孔吸附樹(shù)脂分離 大豆異黃酮1. 將處理后樹(shù)脂，裝入4.5 X38.0cm柱中，上樣，平均流速3-5ml/min，流出液收集，取其 10ml 留樣，冰箱保藏。2. 用蒸餾水以平均流速 5-8ml/min 進(jìn)行洗滌，洗至無(wú)色。3. 經(jīng)層析柱后，被樹(shù)脂吸附物質(zhì)即為大豆異黃酮， 用 8 ml/ min 的流速，用 500 ml15.0% 的乙醇洗脫，收集流出液，取其 10ml 留樣，冰箱保藏。洗脫液減壓濃縮 回收酒精至無(wú)醇味。4. 用 500ml 30% 乙醇洗脫，洗脫液收集，取