酵母單雜交試驗方法

1、酵母單雜分析酵母單雜交技術是體外分析DNA與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的一種方法，通 過對酵母細胞內(nèi)報告基因表達狀況的分析來鑒別 DNA結(jié)合位點并發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié) 合蛋白基因，或?qū)Y(jié)合位點進行分析。運用此技術能篩選到與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，并可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列而無需復雜的蛋白質(zhì) 分離純化操作，故在蛋白質(zhì)研究中具有一定的優(yōu)勢； 而且酵母屬真核細胞，通過 酵母系統(tǒng)得到的結(jié)果比其它體外技術獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核細胞內(nèi)基因表達 調(diào)控的情況?！緦嶒災康摹苛私饨湍竼坞s交的基本原理和應用，掌握酵母單雜交的主要步驟及注意事 項，學會酵母感受態(tài)的制作與轉(zhuǎn)化，基因文庫的構(gòu)建及篩選?！緦嶒炘怼拷湍?/p>

2、單雜交方法是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白（即轉(zhuǎn)錄因子）與 DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報告基因表達的原理來克隆編碼目的轉(zhuǎn)錄因子的基因（cDNA）。該方法也是細胞內(nèi)分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合的有效方法。如圖所示， 將已知的特定順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子（minimal promoter，Pmin）上游，Pmin啟動子下游連接報告基因。進行 cDNA融合表達文庫時，編碼目的轉(zhuǎn) 錄因子的cDNA融合表達載體被轉(zhuǎn)化進入酵母細胞后，其編碼產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄因子） 與順式作用元件結(jié)合，就可以激活 Pmin啟動子，并促使報告基因表達。根據(jù)報 告基因的表達，篩選出與已知順式元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。“ Matchmaker

3、 Gold Yeast OnHybrid Library Screening System 提供了一個簡 單高效的構(gòu)建cDNA文庫并進行酵母單雜交篩選的方法，它使用aureobasidin A抗性基因作為報告基因，篩選效率高，背景低。單雜交篩選是從酵母雙雜交篩選 發(fā)展而來，利用單雜交篩選可以對cDNA文庫進行篩選直接獲得與目的順式作用元件相結(jié)合的蛋白質(zhì)。The Matchmaker Gold On e-Hybrid Library Scree ning process主 要包括以下步驟：1將已知序列(bait)克隆到pAbAi載體。2 pBait-AbAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母菌株，使其與

4、酵母基因組發(fā)生重組，生成 bait/reporter 酵母菌株。3檢測Y1HGold bait菌株AbAir基因的本底表達水平。4合成cDNA并通過cDNA和pGADT7-Rec載體共轉(zhuǎn)化酵母進行細胞內(nèi)同源重 組篩選cDNA文庫。5篩選結(jié)果的驗證和分析。【實驗準備】1儀器設備微量取液器(2.5 H_; 20 H_; 50 H_; 100 H_; 200 田_; 1000 »L)、PCR 儀、 低溫離心機、臺式離心機、CHROMA SPINtm+TE-400純化柱、瓊脂糖凝膠電泳 系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫搖床、恒溫孵箱、通風櫥、制冰機、振蕩器、恒溫金 屬浴、酒精浴、無菌接種環(huán)、10 c

5、m培養(yǎng)皿、15 cm培養(yǎng)皿等。2實驗材料YIHGold酵母株、TOP10大腸桿菌菌株、各種方法提取的 RNA、pGADT7-Rec 質(zhì)粒和pBait-AbAi質(zhì)粒等。3主要試劑(1) Advantage 2 PCR試劑盒、Easy Yeast Plasmid Isolation劑盒、MatchmakerInsert Check PCR Mix 1、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2(2) 各種基礎培養(yǎng)基和營養(yǎng)缺陷培 ，養(yǎng)基：minimal SD base minimal SD agar base YPD medium，YPD agar medium，-Leu D

6、O supplement, -Ura DO supplemen，腺苷酸(adenin®，PEG8000, carring DNA，aureobasidin A, LB培養(yǎng)基, 氨芐西林。(3) NaCl 溶液(0.9%)、sodium acetate (3 mol/L )、50% PEG、10 x LiAc (1 mol/L)、10xTE buffer、DTT (100 mmol/L)、RNaseH、限制性內(nèi)切酶?！緦嶒灧椒ā? pBait-AbAi載體的構(gòu)建(酵母報道子的構(gòu)建)注：酵母報道子(pBait-AbAi )包含目的順式作用元件的一個或多個拷貝， 且插入到pAbAi載體Ab

7、Air報告基因的上游。大量研究表明最有效的構(gòu)建應包含 目的DNA三個以上的首尾連接的拷貝。首尾連接的拷貝產(chǎn)生方式很多，但對于 長度小于20 bp的調(diào)控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途徑。(1) 設計并合成包含目的序列的兩條反向平行的寡核苷酸序列，且兩端加上與 pAbAi載體酶切產(chǎn)物一致的粘性末端(建議合成一個目的序列的突變序列 作為對照，以排除可能的假陽性)。(2) 用TE buffer溶解寡核苷酸至終濃度100mol/L。(3) 將正向鏈和反向鏈按照1:1的比例混合(退火后的雙鏈寡核苷酸最大濃度為 50 Jmol/L)。(4) 95 C保溫30 s,去除二級結(jié)構(gòu)。(5) 72 C 保溫

8、 2 min，37 C 保溫 2 min，25 C 保溫 2min。注：緩慢退火，有助于雙鏈寡核苷酸的形成。(6) 冰上放置。退火后的產(chǎn)物可貯存在-20 C冰箱備用。(7) 酶切1 JL pAbAi載體，用凝膠回收純化或柱純化的方式純化酶切產(chǎn)物。注：回收前，可用瓊脂糖凝膠檢測是否酶切完全。（8）將退火后的寡核苷酸稀釋100倍至終濃度為0.5 5OI/L（9）在連接反應管中加入如下成分:pAbAi 載體（50 ng/L）1.0兒annealed oligonucleotide ( 0.5 Jmol/L)1.0兒10 x T4 DNA ligase buffer1.5兒BSA (10 mg/mL)

9、0.5 UNuclease-free H2O10.5 4T4 DNA ligase (400 UM)0.5此總體積15 U注：如果有必要，可用1 JL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作為陰性對照。（10）將反應體系室溫放置連接3 h，轉(zhuǎn)化E coli，采用常規(guī)方法檢測陽性克隆。注：可用酶切或測序進行檢測。2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細胞，生成 Bait-Reporter酵母菌株（圖）Linearize pBait-AbAi and integrate into the ur&3-52 lous of Y1H Gold圖3 Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意圖4(1) 用

10、BstB I 或者 Bbs I 酶切 2 兒 pBait-AbAi ,pMutant-AbAi ,p53-AbAi 質(zhì)粒， 使其在URA3基因處斷開，純化酶切產(chǎn)物。(2) 按 Matchmaker Yeast Transformation System 2的步驟用 1 .酶切后的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母。(3) 稀釋每個轉(zhuǎn)化體系至 1/10、1/100、1/1000,分別取每個稀釋物均勻涂于SD/-Ura瓊脂平板上。3 d后挑取5個單克隆，用 Matchmaker Insert Check PCR Mix1進行PCR檢測陽性克隆，用Y1HGold的單克隆做陰性對照。(4) 在 PCR 管中

11、加 25 屮 PCR-grade H2O。(5) 用干凈的槍頭輕輕接觸酵母單克隆，以獲得非常少量的酵母細胞。將槍頭 伸進PCR-grade H2O中攪拌，使酵母細胞散開。注：切忌挑取整個酵母單克隆，因為細胞過多會阻止PCR反應的進行。如果加入細胞后水變渾濁，證明加入了過多的酵母細胞。(6) 向每個管中加入 25 Jl Matchmaker Insert Check PCR Mix，混勻，離心。每 個PCR管中現(xiàn)已含有如下反應物：Matchmaker In sert Check PCR Mix25 JlH2O/yeast25 7總體積50 Jl(7) 按下述程序進行PCR反應;(8)95 C1

12、min98 C10 s >55 C30 s68 C2 min取5卩1 PCR產(chǎn)物，用30 cycles1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。16注：引物與AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因組結(jié)合，擴增片段長約 1.4 kb。_AbArURA3圖4 PCR檢測pBait-AbAi的插入情況正確的PCR檢測結(jié)果應是:陽性對照：1.4 kb陰性對照：無條帶誘餌菌株：1.35 kb+in sert size（9）分別挑取PCR檢測呈陽性的誘餌克隆和p53-AbAi對照克隆，在SD/-Ura 平板上劃線培養(yǎng)。30 C孵育3 d后，將平板置于4 C保存，即為新構(gòu)建 的 Y1HGoldBait/AbA

13、i菌株和p53/AbAi對照菌株。（10） 經(jīng)過長期放置后，挑取單克隆在 YPDA液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用1 mL預冷培養(yǎng)基（100 ml滅菌的YPDA與50 ml滅菌的75% 甘油混合）重懸菌體，速凍后與-70 C保存。3檢測誘餌菌株AbAr基因的表達在不存在捕獲物的情況下，由于克隆到 pAbAi載體中的誘餌序列不同，誘 餌菌株報告基因的本底表達水平也不相同。例如：p53-AbAi對照的最低aureobasidin A 抑制濃度為 100 ng/ml。注：酵母單雜交實驗成功的前提是沒有內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子能夠與目的序列結(jié)合或者結(jié)合能力非常弱。因此在進行文庫篩選之前，檢測所構(gòu)建的誘餌菌株

14、AbAr基因的表達情況十分重要。所以需要進行實驗以確定進行文庫篩選時抑制誘餌菌株 報告基因本底表達所需的AbA濃度。（1） 分別挑取誘餌克隆和對照克隆，用0.9% NaCI重懸細胞，調(diào)節(jié)A600到0.002（大約2000個細胞/100 7）。（2） 在下述培養(yǎng)基上分別涂布100 Jl重懸后的菌液，30 C培養(yǎng)2-3 doSD/-UraSD/-Ura with AbA （100 ng/mL）SD/-Ura with AbA （150 ng/mL）SD/-Ura with AbA （200 ng/mL）預期結(jié)果如下所示：表1 AbAr基因預期本底表達結(jié)果AbA/ （ n g/mL）Y1HGoldp

15、53-AbAi克隆數(shù)Y1HGoldpBait-AbAi克隆數(shù)0約 2000約 20001000Bait depe ndent1500Bait depe ndent2000Bait depe ndent（3）在進行文庫篩選時，使用 AbA的濃度應為最低抑制濃度，或使用比最低抑制濃度稍高的AbA濃度（高約50-100 ng/mL）,以徹底抑制誘餌菌株的 生長。注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表達，可以嘗試提高AbA濃度至500-1000 ng/mL。然而，在不存在捕獲物的情況下，如果 1000 ng/mL的AbA濃 度仍無法抑制AbAr基因的表達，那么很可能存在能夠識別并與目的序列結(jié)

16、合的 內(nèi)源調(diào)控因子，因而該目的序列無法用來進行酵母單雜交篩選。4文庫cDNA的合成提取試材總 RNA，進行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。合成的cDNA末端具有與pGADT7-Rec相同的酶切位點。（1） cDNA第一鏈的合成準備高質(zhì)量的poly A和/或總RNA，用human placenta poly A+RNA作為陽性 對照。注：RNA的質(zhì)量決定文庫的質(zhì)量，RNA應為所要研究的特定時期和特定組織的RNA。在微量離心管中加入如下反應物：RNA 模板（0.025-1.0 Jg poly A 和/或 0.10-2.0 Jg 總 RNA）1-2 JlCDS III（oligo-dT）or CDS 111/

17、6（ random）引物1.0 JlDeionized H2O （使總體積達到 4.0 T）1-2 Jl總體積4.0川在另外一支管中加入對照cDNA反應物，即RNA使用1川（1 -g） control polyA+RNA 。72 C孵育2 min。冰上放置2 min，輕輕混勻，立即加入步驟中的試劑。每一個反應加入如下試劑，輕輕混勻離心。5X first-strand buffer2.0山DTT (100 mmol/L)1.0山dNTP mixture (10 mmol/L)1.0SMART M-MLV RT1.0屮總體積5.0 Jl注：步驟中的試劑可在步驟之前加好置于冰上。此步是 cDNA合成

18、的 起始關鍵步驟，變性后的 RNA/引物mix冰上放置的時間不應超過 2 min。 如果用的是CDS III/6隨機引物，25-30 C保溫10 min。如果用的是CDS III 引物，省略此步，進行步驟。 42 C保溫10 min。 加入1 T SMART III oligo，充分混合，42 C保溫1 h。 75 C保溫10 min終止第一鏈的合成。 降至室溫，加入1 T RNase H（ 2 U）。11 37 C 保溫 20 min。12 cDNA第一鏈合成產(chǎn)物應于-20 C保存，可用3個月。(2) long distanee PCR (LD-PCR)合成 cDNA 第二鏈根據(jù)合成cDNA

19、第一鏈時使用的RNA量，下表給出了進行LD-PCR時最佳 的熱循環(huán)數(shù)。使用的熱循環(huán)數(shù)越少，非特異性PCR產(chǎn)物越少。表2 RNA量與最佳熱循環(huán)數(shù)總RNA/也Poly A+RNA/ Jg循環(huán)數(shù)1.0-2.00.5-1.015-200.5-1.00.25-0.520-220.25-0.50.125-0.2522-240.05-0.250.025-0.12524-26LD-PCR反應混合物中加入如下物質(zhì)(每個樣品做 2個100川體系，對照做1個100屮體系):First-stra nd cDNA ( from protocol A)2 JlDei on ized H2O70 “10 x adva nt

20、age 2 PCR buffer10 '-l50 x dNTP mix2 Jl5' RAC引物2 Jl3' RAC引物2 JlMelt ing solution10 Jl50 x adva ntage 2 polymerase mix2 41總體積100 Jl按照以下程序進行PCR反應：1個循環(huán)95 乜 30 sX個循環(huán)95 七 10 s 686 min1個循環(huán)685 min取7屮PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測，檢測時使用 1 kb DNA ladder。(2) 使用 CHROMA SPIN+TE-400 柱純化 ds cDNA為每一個要純化的 cDNA樣品準備一

21、個 CHROMA SPIN+TE-400柱。將純化柱翻轉(zhuǎn)幾次，充分懸浮 gel matrix。移去柱的頂蓋和底蓋，將柱放入 2 ml收集管中。將柱放入離心機，700 g離心5 min以消除平衡緩沖液，棄掉收集管中的液體。將柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使樣品沿柱的 內(nèi)壁流下。注：加到邊上易使樣品沿柱內(nèi)壁流下，易混有小片段cDNA。700 g離心5 min,純化的cDNA收集到管中。將兩個純化的cDNA樣品合并到一管，測量體積。加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉(pH5.3)，混勻。加入2.5倍體積無水乙醇。-20 C冰凍1 h0(11) 室溫，14000

22、r/min 離心 20 min。(12) 小心棄去上清液，切勿碰到沉淀。(13)14000 r/min瞬時離心，去除殘留上清液(14) 沉淀于空氣中干燥10 min。注：一般干燥至無乙醇味，不可過度干燥，否則很難溶解。(15) 用20川滅菌去離子水溶解沉淀，此cDNA可用來進行同源重組構(gòu)建文庫。純 化后的cDNA用1%的瓊脂糖電泳檢測。5構(gòu)建并篩選酵母單雜交文庫(cDNA融合表達文庫的構(gòu)建及篩選)(1) 構(gòu)建并在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上檢測 Y1HGoldBait/AbAi菌株。注：AbA的濃度根據(jù)構(gòu)建誘餌載體時轉(zhuǎn)入酵母抑制本底表達時的濃度而定。(2) 按SMART tech no lo

23、gy步驟合成ds cDNA，其濃度為2-5弋/20兒。(3) 用Yeast Transformation System 2的方法轉(zhuǎn)化酵母，在轉(zhuǎn)化體系中加入如下 物質(zhì)： cDNA 文庫轉(zhuǎn)化 Y1HGoldBait/AbAi菌株20 屮 SMART-amplified ds cDNA (2-5 乜)6 Jl pGADT7-Rec， (Sma I-linearized) (3 Jg) Y1HGold 53/AbAi的轉(zhuǎn)化5 屮 p53 fragme nt (125 Jg)2 屮 pGADT7-Rec， (SmaI-linearized) (1 Jg)將轉(zhuǎn)化體系分別稀釋至1/10、1/100、1/10

24、00 1/10000后，各取100 Jl涂100 mm平板。文庫轉(zhuǎn)化涂 SD/-Leu和SD/-Leu/AbA 平板，對照 p53轉(zhuǎn)化涂SD/-Leu和 SD/-Leu/AbA200 平板。(4) 將剩余的所有文庫轉(zhuǎn)化混合物(約 15 ml)涂在150 mm SD/-Leu/AbA平 板上，每板涂150屮。(5) 倒置培養(yǎng)3-5 do(6) 3-5 d后，通過統(tǒng)計SD/-Leu 100 mm平板上的克隆數(shù)目來計算篩選的克隆注：所篩選的克隆數(shù)至少應該達到1百萬，否則會降低篩選到目的產(chǎn)物的可 能性。篩選的 克隆數(shù)=cfu/ml on SD/-Leu x dilution factor x resu

25、spension volume (15ml)例如：resuspension volume=15 mlPlating volume=100 Jl250 colo nies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu platesThe number of clo nes scree ned=250 cfu/0.1 mx 100 x 15 ml=3.75 millio n(7)預期結(jié)果陽性對照試驗：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培養(yǎng)基上的克隆數(shù)相近。文庫篩選試驗：根據(jù)SD/-Leu平板上的克隆數(shù)計算所篩選的克隆數(shù)，其結(jié)果應大于1百萬且SD/-Leu/A

26、bA平板上的克隆數(shù)遠遠少于1百萬，陽性克隆數(shù)目 取決于誘餌序列。6陽性克隆的鑒定及cDNA質(zhì)粒的分離(1) 陽性克隆重新劃線培養(yǎng)，進行表型確認 將陽性克隆在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上重新劃線，產(chǎn)生新的單克隆。 2-4 d后，選擇能夠正常生長的克隆進行后續(xù)分析。(2) 酵母克隆PCR消除重復克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 (，對插入到 pGADT7 載體中的 cDNA片段進行擴增。PCR管中加入以下反應物：Matchmaker In sert Check PCR Mix25 JlH2O/Yeast25 T總體積50 Jl按下述程序進行PCR反應:9

27、4 C 1 min98 °C 10 s68 °C 3 min PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。產(chǎn)物不是單一的條帶很正常， 這表明在同一酵母細胞不存在一種捕獲載體注：為了確認大小相近的條帶是否是同一種插入片段，用Alu I或Hae III或者其它常用的限制性內(nèi)切酶消化 PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分 析。 如果大量的克隆含有同一插入片段，則另取50個克隆進行PCR分析。 為了快速驗證克隆，PCR產(chǎn)物可經(jīng)過純化后用T7引物測序。（3）陽性cDNA質(zhì)粒的分離獲取 酵母中文庫質(zhì)粒的分開。與轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不同，轉(zhuǎn)化的酵母細胞可以含多種相關質(zhì)粒，這就意味著 陽

28、性克隆里不只含有能激活 AbAr報告基因的質(zhì)粒，還可能含有一種或多種不表 達相互作用蛋白的cDNA質(zhì)粒。如果不事先將非互作質(zhì)粒分開出去而直接通過 轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲取質(zhì)粒，那么很有可能獲取到非相互作用的質(zhì)粒。為了增加獲取 陽性克隆捕獲質(zhì)粒的幾率，可以將陽性克隆在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上重復涂布2-3次，每次都挑取單一的克隆進行下一步涂布。 從酵母中獲取陽性cDNA質(zhì)粒為了鑒定陽性互作相關的基因，用 Easy Yeast Plasmid Isolation Kit （ 轉(zhuǎn)化E coli并分離陽性cDNA質(zhì)粒用常用的克隆菌株對陽性cDNA質(zhì)粒進行克隆，用LB加100 g/ml ampicillin進行選擇(4) 鑒別陽性和假陽性互作酵母單雜交篩選可能會檢測到假陽性，用以下標準可以區(qū)分陽性和假陽性 陽性：正確的誘餌序列和捕獲物都是激活 AbAr報告基因所必需的。假陽性：在誘餌序列突變的情況下，誘餌仍可以激活AbAr報告基因。用下述程序在選擇培養(yǎng)基上對陽性和假陽性相互作用進行確認： 用 Yea