大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎破骨細胞分化因子及骨保護素的基因表達研究(

1、    大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎破骨細胞分化因子及骨保護素的基因表達研究(1)    】 目的 本研究以大鼠的類風(fēng)濕性踝關(guān)節(jié)炎為實驗?zāi)Ｐ?，采用RT-PCR技術(shù)檢測大鼠踝關(guān)節(jié)組織中破骨細胞分化因子(ODF/RANKL)、骨保護素(OPG)的表達，探討關(guān)節(jié)組織中RANKL、OPG表達與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨吸收破壞的分子生物學(xué)機制。方法 建立大鼠實驗動物模型。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)的方法，檢測實驗組不同時間大鼠踝關(guān)節(jié)組織中RANKL、OPG mRNA基因表達。結(jié)果 通過RT-PCR 方法檢測大鼠踝關(guān)節(jié)組織中RAN

2、KL及OPG mRNA含量，并對其含量進行比較，在正常對照組OPG mRNA的含量高于RANKL mRNA，而隨著模型構(gòu)建成功，RANKL/OPG mRNA的含量比值出現(xiàn)倒置，RANKL mRNA的含量漸升高，其比值4周時為91，6周時為6.41。結(jié)論 隨著關(guān)節(jié)破壞程度的加重，RANKL mRNA組織中的表達量增加，OPG的表達量也增加，RANKL/OPG的比值增加程度比OPG增加明顯，在模型建立4周時達到91，表明RANKL與OPG的表達比例與破骨細胞的功能、活性、分化與成熟呈正相關(guān)。局部微環(huán)境中RANKL與OPG的相對比值決定骨組織中破骨細胞與成骨細胞功能傾向，決定局部骨組織是吸收、破壞還

3、是增生，而且決定骨的破壞程度。    【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕性踝關(guān)節(jié)炎 破骨細胞分化因子 骨保護素 基因表達Gene expression of osteoclastogenesis inhibitory factor and osteoclast differentiation factor in rat ankle rheumatoid arthritis    【Abstract】 Objective To take the rat ankle rheumatoid arthritis as animal mod

4、el，and to assay the expression of osteoclast differentiation factor in ankle rheumatoid arthritis(ODF/RANKL)and osteoprotegerin(OPG)in the rat ankle tissue by the means of molecular biology.To discuss the relationship between extent of bone tissue destruction and expression of RANKL and OPG，and to d

5、iscuss the molecular biology mechanism of bone tissue destruction in rheumatoid arthritis.Methods The rat animal model was established.The variety of RANKL and OPG expression by means of RT-PCR was assayed.Results With the inflammation worsening and the bone destruction， the RANKL mRNA expressional

6、quality was arisen.By comparing the expression of RANKL mRNA with that of OPG mRNA， we could draw a conclusion that the values in normal control group were changed into invert ratio when the joint inflammation was worse. And the ratio was 91 when it come to its climax. Conclusion With the increase o

7、f deterioration of the bone destruction，the ratio of RANKL/OPG is increased little by little，and the ratio comes to 91 when inducing the animal model at the forth week. Regulated the extent of bone destruction by means of negative-feed， bone absorption or hyperplasia and the extent of the

8、bone destruction depend on the ratio of RANKL and OPG in the local microenvironment.【Key words】 ankle rheumatoid arthritis osteoclast differentiation factor osteoprotegerin gene expression    風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA) 表現(xiàn)為慢性、對稱性多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變的一種自身免疫、炎性疾病1。病情進展中綜合體現(xiàn)了炎癥、自身免疫、滑膜組

9、織增生3種病理生理過程。許多證據(jù)表明，骨吸收是破骨細胞在成骨細胞(osteoblast，OB)參與下侵蝕骨質(zhì)的生物學(xué)功能，體現(xiàn)OB 的接觸依賴過程。成骨細胞和破骨細胞的細胞間接觸是決定破骨細胞形成及功能活動的必條件。因而，人們推測在成骨細胞的細胞膜上存在著一種膜結(jié)合因子，可以介導(dǎo)成骨細胞對破骨細胞分化及功能的調(diào)控，這一假設(shè)及其確切的分子機制直到近期才得以證實。1997年Simonet等2在胎鼠小腸組織構(gòu)建的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了一種新的TNF受體家族成員，它具有降低破骨細胞分化和增加骨密度的功能，故命名為護骨因子(osteoprotegerin， OPG)， 破骨細胞發(fā)生抑制因子(osteocl

10、astogensis inhibitory factor，OCIF)。1998年有2個研究組分別發(fā)現(xiàn)了一種新的破骨細胞分化所必需的因子，分別將其命名為破骨細胞分化因子(osteoclast differentiation factor， ODF)3、OPG配體(osteoprotegerin ligand， OPGL)4，RANKL/ODF被認為可能是唯一能夠直接誘導(dǎo)破骨細胞分化和功能的細胞因子5。本實驗是應(yīng)用牛型膠原蛋白與弗氏佐劑為乳劑，制備Wistar大鼠類風(fēng)濕性踝關(guān)節(jié)炎模型，應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)檢測大鼠關(guān)節(jié)組織中ODF/RANKL mRNA及OPG mRNA表達，從分子生物學(xué)水平探討類

11、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨吸收破壞機制，為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨吸收破壞機制的進一步探討及早期診斷奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。    1 材料與方法1.1 一般材料     實驗動物 Wistar大鼠48只，雌性，5周齡，體重約(120±15)g左右，由長春高新醫(yī)學(xué)實驗研究中心提供，隨機分成正常對照組、實驗組各24只。     主試劑 (1)牛源性型膠原蛋白(collagen )，酸可溶性，美國Sigma公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑(complete Freunds adjuvant，CFA)，

12、美國Sigma公司產(chǎn)品。 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase 抑制劑和Trizol試劑 購自寶生物工程大連有限公司。     特異引物 由寶生物工程大連有限公司合成。(1)RANKL 擴增產(chǎn)物長度為822bp，引物順序如下：上游引物：5-GAGACTACGGCAAGTA-3；下游引物：5-CCTCCAACGTTTATGG -3。(2)OPG 引物擴增產(chǎn)物長度為 603bp順序如下：上游引物：5-TGGAGCTCGAATTCTGCTTG-3；下游引物：5-CATCAAGATGCGGAGCTGCT-3。(3)大鼠-actin引物擴增產(chǎn)物長度為410bp，順序如下： 上游引

13、物：5-GAAATCGTGCGTGACATTAAG-3；下游引物：5-CTAGAAGCATTTGCGGTGCA-3。-actin 作為檢測RANKL、OPG內(nèi)參對照。1.2 實驗方法 實驗組織制備 不同時間點實驗組大鼠（0、2、4、6周）兩側(cè)踝關(guān)節(jié)組織取出后，右側(cè)用10福爾馬林固定后，用于活組織檢查。左側(cè)踝關(guān)節(jié)組織放入液氮罐內(nèi)以備用來做分子生物學(xué)指標檢測。            作者：韓冰，張家穎，武廣恒，徐勇忠【摘】目的本研究以大鼠的類風(fēng)濕性踝關(guān)節(jié)炎為實驗?zāi)Ｐ停捎肦T-P

14、CR技術(shù)檢測         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。     組織總RNA提取 紫外分光光度計測定RNA含量和純度RT-PCR檢測RANKL、OPG、CTR mRNA基因表達，利用基因公司凝膠成像分析系統(tǒng)2 結(jié)果見圖1，2，3。圖中0周組為實驗對照組，2、4、6周組為異種膠原誘導(dǎo)注射后各不同時間實驗組。 

15、   RANKL mRNA 在正常對照組微弱表達，隨著關(guān)節(jié)炎癥狀和關(guān)節(jié)骨吸收程度的加重而升高，表達量在誘導(dǎo)注射第4周時達到高峰，6周時由于吸收破壞仍繼續(xù)，RANKL mRNA 的含量繼續(xù)處于高值。見圖1。    圖1 RT-PCR檢測大鼠RANKL mRNA表達    OPG mRNA在正常對照組呈弱表達，隨關(guān)節(jié)破壞程度加重，其表達量漸升高。見圖2。     圖2 RT-PCR檢測大鼠OPG mPNA表達   

16、60;圖1，2各泳道如下：M：DL-2000；1：對照組；2、3、4：分別為誘導(dǎo)注射2周、4周和6周組。        RANKL與OPG mRNA的含量進行比較，可以看出，在正常對照組OPG mRNA的含量高于RANKL mRNA的含量，RANKL與OPG比值為12，而當(dāng)大鼠異種膠原誘導(dǎo)注射后，RANKL與OPG mRNA比值出現(xiàn)倒置，RANKL mRNA的含量漸升高，在4周時其比值達91，6周時比值為6.41。見圖3。    圖3 大鼠RANKL/-actin和OPG/-

17、actin比值    2 討論    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)吸收和破壞有以下幾種不同類型6：血管翳直接侵害關(guān)節(jié)邊緣引起局灶性骨侵蝕；局灶性軟骨下骨侵蝕；炎癥關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)端骨量減少。破骨細胞來源于關(guān)節(jié)滑膜組織中骨髓干細胞/巨噬細胞，同時大量的研究證明關(guān)節(jié)滑膜組織中的成纖維細胞（synovial fibroblasts）具有分化為破骨細胞的潛能7。骨吸收是破骨細胞在成骨細胞(osteoblast，OB)參與下侵蝕骨質(zhì)的生物學(xué)功能，體現(xiàn)OB 的接觸依賴過程8，成骨細胞可能首先產(chǎn)生一種或多種酶介體，再作用于破骨細胞的前體細胞使之

18、向破骨細胞分化，破骨細胞分化因子(ODF)就是這樣一種酶介體9。其功能受骨保護素(OPG)反饋調(diào)節(jié)10。    本實驗采用RT-PCR技術(shù)對大鼠踝關(guān)節(jié)標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)實驗對照組大鼠（生后4周大鼠），其保護素(OPG)弱表達，破骨細胞分化因子(RANKL)呈微弱表達，RANKL/OPG mRNA間比值小于1；從大鼠的骨組織發(fā)育進程看，此時大鼠的骨骼處于新生發(fā)育階段，成骨細胞發(fā)揮主作用，以骨形成為主。而筆者的研究結(jié)果，OPG的表達量高于RANKL的表達。    當(dāng)大鼠注射異種膠原產(chǎn)生急性免疫反應(yīng)，出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎性病變時，

19、關(guān)節(jié)組織RANKL、OPG表達出現(xiàn)了改變。經(jīng)過注射異種膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎2周后，檢測RANKL mRNA表達量升高明顯，OPG mRNA略有升高，RANKL/OPG比值（大于1）升高。而在這一時期的關(guān)節(jié)活組織檢查，可以見到關(guān)節(jié)周圍組織內(nèi)毛細血管、關(guān)節(jié)滑膜增生， 髁突表面覆蓋炎性細胞，髁突表面軟骨可見骨吸收陷窩11。這與Romas的實驗研究相符，在Romas等的研究中，對大鼠進行異種膠原誘導(dǎo)注射（注射1次）誘發(fā)膝關(guān)節(jié)炎19d時，檢測RANKL/OPG表達改變結(jié)果，與筆者經(jīng)2次誘導(dǎo)注射后2周時間大致相符，其細胞因子含量的改變亦相符，支持Evan Romas等的實驗結(jié)果12。  &#

20、160; 隨著關(guān)節(jié)破壞模型的建立，關(guān)節(jié)破壞程度加重，RANKL mRNA組織中的表達量增加，骨及軟骨吸收破壞高峰期時RANKL mRNA表達量達到最高值，證明RANKL刺激破骨細胞的分化和成熟，從而導(dǎo)致骨的吸收破壞加重。    破骨細胞功能和活性是受破骨細胞分化因子和骨保護素這對競爭抑制因子所調(diào)控，隨著關(guān)節(jié)破壞進一步加重，OPG的表達量隨著關(guān)節(jié)破壞程度的加重也在增加，表明OPG作為RANKL 競爭抑制受體的調(diào)節(jié)作用。而RANKL/OPG的比值增加程度比OPG增加明顯，在最后一次誘導(dǎo)注射模型建立4周時達到91，此時表達破骨細胞的降鈣素受體亦升至最

21、高，表明RANKL與OPG的表達比例比局部RANKL表達量更能有效解釋局部破骨細胞的功能活性改變。RANKL與OPG的表達比例與破骨細胞的分化與成熟、功能、活性正相關(guān)，RANKL刺激破骨細胞的增殖和分化，從而導(dǎo)致骨的吸收破壞加重。當(dāng)關(guān)節(jié)破壞進入慢性過程時，RANKL/OPG mRNA表達略有下降，但其比值仍然較高，而且降鈣素受體表達量持續(xù)呈高水平表達，提示此時的骨組織仍處于吸收破壞階段，進一步驗證了RANKL是骨吸收促進因子，促進破骨細胞的分化、成熟。在實驗中OPG mRNA 表達量隨著骨吸收破壞加重、RANKL mRNA表達增加而增加，考慮這是由于OPG是RANKL基因的“圈套”受體，受RA

22、NKL的負反饋調(diào)節(jié)，表達量相對也增加，從而能競爭性與RANKL結(jié)合，負反饋調(diào)節(jié)骨的破壞程度。局部微環(huán)境中RANKL與OPG的相對比值決定骨組織中破骨細胞與成骨細胞功能傾向，決定局部骨組織是吸收、破壞還是增生，而且決定骨的破壞程度。【參考文獻】    1 Golden BD， Wong DC， Dicostanzo D，et al. Rheumatoid papules in a patient with acquired immune deficiency syndrome and symmetric polyarthritis.J Rheumatol，

23、1996，23(4):760-762.    2 Simonet WS， Lacey DL， Dunstan CR， et al. Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell，1997，89(2):309-319.    3 Thomas GP， Baker SU， Eisman JA. Changing RANKL/OPG mRNA expression in differen

24、tiating murine primary osteoblasts. J Endocrinol，2001，170(2):451-460.    4 Miyamoto T，Arai F， Ohneda O.An adherent condition is required for formation of multinuclear osteoclasts in the presence of macrophage colony-stimulating factor and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand. Blood，2000，96(13):4335-4343.