細胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)

1、細胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)書實驗一 細胞形態(tài)與細胞器的觀察一、實驗類型驗證性實驗二、實驗?zāi)康?、觀察各種不同細胞的形態(tài)大小，從而對細胞的分類，進化及分化有所了解。 2、 判斷和識別光學(xué)顯微鏡下各種細胞器的形態(tài)， 大小和數(shù)目。三、預(yù)習(xí)要求 了解顯微鏡的組成原理及使用方法，預(yù)習(xí)各種細胞及其細胞器的形態(tài)大小、數(shù)目、分布特點。四、實驗原理細胞是構(gòu)成生物有機體最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，其物種、部位和功能的不同在形態(tài)與大小上也呈現(xiàn)一些區(qū)別。由于細胞比較小，細胞器大部分在 0.1m 和10m 之間，而光學(xué)顯微鏡的最高分辨率為 0.2m，所以我們要借助于顯微鏡才可以觀測出細胞形態(tài)大小的差異。每種細胞器都有特殊的形態(tài)、大

2、小、分布位置及數(shù)目，并且通過特異性染色方法可把細胞器各種特殊結(jié)構(gòu)區(qū)分開來，這也是我們判斷和識別細胞器的依據(jù)。另外，細胞器在不同細胞、不同發(fā)育時期和不同生理狀態(tài)下的形態(tài)大小也會有所不同。因此，對細胞器的觀察可用來判斷細胞的生理和發(fā)育情況。在取材和觀察上要注意各種細胞器在不同細胞中的特殊性。不同細胞的形態(tài)大小可以借用目鏡測微尺和鏡臺測微尺進行測量。測微尺分物鏡測微尺（簡稱物微尺或臺微 尺）和目鏡測微尺（簡稱目微尺），兩者配合使用，可以測量細胞大小。目微尺是一個可以放在目鏡內(nèi)的特制玻璃圓片，圓片中央刻有一條直線，此線分為若干格。 物微尺為一載玻片中央封固的小尺，長1mm，被等分為100格，長為0.0

3、1mm(10m)。當測量細胞大小時，不能用物微尺直接測量細胞，而只能使用 目微尺。因目微尺測量的細胞是經(jīng)物鏡放大后的像，而它每格所代表的實際長度隨物鏡的放大率而變，在測量時需要先用物微尺來標定，求出某一放大率時目微尺每 格所代表的實際長度，然后再用以測定細胞大小。將物微尺放在顯微鏡的載物臺上，小心轉(zhuǎn)動目鏡測微尺，移動物微尺使兩尺平行，起點線重合，然后找出另一處兩尺刻度重合處，記錄起點線到重合線之間的各尺的刻度數(shù)（格數(shù)），按下式計算，在該放大系統(tǒng)下目微尺每格所代表的實際長度：例如：目微尺是100格，其對應(yīng)的物微尺是80格，則目微尺每格所代表的實際長度為80/100×10=8m。測量某一

4、細胞時，如果目微尺測得其橫徑為5格，則此細胞橫徑為8×5=40m。五、實驗內(nèi)容（一）實驗器材1、器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、剪刀、恒溫水浴箱、小培養(yǎng)皿、吸管、牙簽、燒杯、吸水紙、擦鏡紙等2、試劑 0.9%生理鹽水、0.1%亞甲基蘭、1% 碘液、蒸餾水、無水乙醇等3、材料 真核、原核細胞涂片或切片，動、植物不同組織的新鮮材料切片。4、溶液或試劑：香柏油，二甲苯。（二）操作步驟（一）、細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察：1、涂片法：人口腔上皮細胞的觀察：1）在潔凈的載玻片中央，滴一滴生理鹽水。2）用消毒牙簽的一端，在漱凈的口腔側(cè)壁上輕輕地刮幾下。3）把牙簽上附有碎屑的一端，放在載玻片上的生理鹽水

5、滴中涂勻。4）用鑷子夾起潔凈的蓋玻片，將它的一邊先接觸載玻片上的生理鹽水滴，然后，輕輕地蓋在水滴上。然后在蓋片的一側(cè)加一滴0.1%亞甲基蘭染液，在蓋片的另一側(cè)用吸水紙吸取，染色后細胞核被染成深藍色，細胞質(zhì)淺藍色。5）用顯微鏡觀察細胞形狀，細胞呈扁平鱗狀。2、撕片法：撕一小片植物表皮（洋蔥、芹菜和韭菜），放在盛有一小滴蒸餾水的載玻片上，用鑷子展平，蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察。細胞大小和形狀如何？（二）細胞大小的測定：1、將目微尺放于目鏡內(nèi)。2、將物微尺放在顯微鏡的載物臺上。3、小心轉(zhuǎn)動目鏡測微尺，移動物微尺使兩尺平行，起點線重合，然后找出另一處兩尺刻度重合處。4、記錄起點線到重合線之間的各尺的刻度

6、數(shù)（格數(shù)），按下式計算，在該放大系統(tǒng)下目微尺每格所代表的實際長度：目微尺每格所代表的實際長度 = 物微尺格數(shù)/目微尺格數(shù) × 10M5、將制作的各種細胞臨時裝片置于載物臺上，測定細胞的大小（包括長徑和短徑）。 六、注意事項：1、制作臨時裝片時避免產(chǎn)生氣泡。2、用物微尺標定的目微尺每格長度的數(shù)值代表在某一放大系統(tǒng)下的情況，這一數(shù)值會隨物鏡的放大率而改變，因此，在什么放大倍數(shù)物鏡下標定的目微尺只能在同一放大倍數(shù)的物鏡下測定細胞的大小。實驗二 細胞和細胞器活體染色一、實驗類型綜合性實驗二、實驗?zāi)康?、觀察動、植物活細胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布； 2、學(xué)習(xí)一些細胞器的超活

7、染色技術(shù)。三、預(yù)習(xí)要求 預(yù)習(xí)各種細胞及其細胞器染色原理和方法。四、實驗原理 活體染色是能使生活有機體的細胞或組織特異性著色但對活樣品又沒有毒害作用的一種活體染色方法，其目的是顯示生活細胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細胞的死亡?；铙w染色技術(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。通常把活體染色分為體內(nèi)活體染色與體外活體染色兩類。體外活體染色又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是靠染料的“電化學(xué)”特性。堿性染料的膠

8、粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活體染色，理論上應(yīng)選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料，且使用時需要配成稀淡的溶液。一般說來，最為適用的是堿性染料，這可能是因為它具有溶解在類脂質(zhì)(如卵磷脂、膽固醇等)的特性，易于被細胞吸收。詹納斯綠B(Janus green B)和中性紅(neutral red)兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體和液泡系的染色分別具有專一性。 線粒體是細胞內(nèi)一種重要細胞器，是細胞進行呼吸作用的場所。細胞的各項活動所需要的能量，主要是通過線粒體呼吸作用

9、來提供的?；铙w染色是應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯示活細胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而又很少影響細胞生命活動的一種染色方法。詹納斯綠 B是線垃體的專一性活體染色劑。線粒體中細胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))呈藍綠色，而在周圍的細胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。中性紅為弱堿性染料，對液泡系(即高爾基體)的染色有專一性，只將活細胞中的液泡系染成紅色，細胞核與細胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。 五、實驗內(nèi)容（一）實驗器材1、器材 顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、解剖盤載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙等2、試劑 Wright 溶液、甲醇60ml、

10、蘇木精、硝酸銀、中性紅-詹納斯綠染液等（1）Ringer溶液： 氯化鈉 8.5g (變溫動物用6.5g) 氯化鉀 2.5g 氯化鈣 0.3g 蒸餾水 1000ml （2）1%、1/3000中性紅溶液： 稱取0.5g中性紅溶于50ml Ringer液，稍加熱 (3040)使之很快溶解，用濾紙過濾，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混勻，裝入棕色瓶備用。（3） 1%、1/5000詹納斯綠B溶液 稱取50mg詹納斯綠B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微熱(3040)，使之溶解，用濾紙過濾后，即為1%原液。取1

11、%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。 3、材料 真核、原核細胞涂片或切片，動、植物不同組織的新鮮材料切片。4、溶液或試劑：香柏油，二甲苯。（二）操作步驟1. 人口腔上皮細胞線粒體的活體染色及觀察實 驗 方 法1、人口腔粘膜上皮細胞線粒體的超活染色與觀察清潔載玻片放在37恒溫水浴鍋的金屬板上 滴2滴1/5000詹納斯綠B染液 用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細胞 刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中 染色10l5min(注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液) 蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察 2、植物細胞液泡系的超活染色

12、與觀察 取豆芽的根尖 用刀片縱切根尖 放入中性紅染液滴中，染色510min。 吸去染液，滴一滴Ringer液 蓋上蓋玻片進行鏡檢(鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察) 實 驗 結(jié) 果 在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點的細胞，可見細胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細胞中，一般只有一個淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細胞的絕大部分，將細胞核擠到細胞一側(cè)貼近細胞壁處。實驗報告（1）描述口腔上皮細胞示線粒體的形態(tài)與分布 （2）細胞中液泡形態(tài)與分布實驗三 酸性磷酸酶（AC

13、P）的顯示方法一、實驗類型驗證性實驗二、實驗?zāi)康淖寣W(xué)生熟悉并掌握細胞內(nèi)酸性磷酸酶的顯示方法和原理；了解植物液泡在化學(xué)組成上的特點。掌握顯示細胞中ACP的操作步驟，觀察酸性磷酸酶在細胞內(nèi)的分布狀況。三、預(yù)習(xí)要求 預(yù)習(xí)組織細胞制片及染色的過程；理解細胞吞噬作用、溶酶體功能和分布以及溶酶體標志酶的性質(zhì)。四、實驗原理酸性磷酸酶廣泛存在于各種動物植物組織細胞的溶酶體中，當溶酶體膜保持穩(wěn)定和完整時，底物不易滲入溶酶體中，溶酶體內(nèi)的酸性磷酸酶活力微弱或無活性。酸性磷酸酶在組織退變過程中活性增強。當細胞被固定，并在合適的pH值下，溶酶體膜的通透性被改變而變得不穩(wěn)定，其底物滲透入溶酶體中，酸性磷酸酶顯現(xiàn)活力。故

14、其在研究溶酶體異常時有意義。酸性磷酸酶分解磷酸脂而釋放出磷酸基。在PH5.0的環(huán)境中，磷酸基與鉛鹽反應(yīng)形成磷酸鉛。但磷酸鉛是無色的，所以再與硫化銨作用，形成棕黑色的硫化鉛沉淀，由此就能顯示酸性磷酸酶在細胞內(nèi)的存在與分布。本實驗的技術(shù)特點是：用較短的作用時間，可避免細胞質(zhì) 內(nèi)其它蛋白質(zhì)及核內(nèi)出現(xiàn)陽性假象，保證了實驗的可靠性。Gomori硝酸鉛改良法是根據(jù)：以磷酸酯為底物，其被磷酸酶水解后釋放出磷酸基，在 pH5左右和鉛鹽結(jié)合成磷酸鉛鹽，但磷酸鉛無色，須經(jīng)硫化銨作用使其變成棕黃色至棕黑色的硫化鉛沉淀。五、實驗內(nèi)容（一）試劑與器材1.材料：洋蔥。2.試劑： Gomori硝酸鉛作用液、1硫化銨溶液等。

15、1） 10%中性福爾馬林(pH6.87.2) 甲醛                               10ml 醋酸鈉            

16、0;                2g 蒸餾水                             90ml 2）酸性磷酸酶作用液 蒸餾水

17、60;                            90ml 0.2mol/L 醋酸緩沖液(pH4.6)         12ml 5%硝酸鉛      

18、60;                     2ml 3.2%-甘油磷酸鈉                   4ml 先將蒸餾水和醋酸緩沖液混合，隨后分成大致相等的兩份，一份中加醋酸鉛溶液，另份加甘油磷酸鈉溶液，然后

19、再將兩者緩緩混合，邊混勻邊攪勻。若PH5.0，可加少量醋酸調(diào)節(jié)。臨用前配制。配好后的作用液應(yīng)透明無絮狀懸浮物和沉淀，否則將嚴重影響實驗結(jié)果。 3) 1%硫胺溶液 硫化胺                                 1ml 蒸溜水  

20、;                               9ml 4)  姬姆薩染液(1:30) 姬姆薩原液              

21、;               3 滴 磷酸鹽緩沖液(PH6.8)                    5ml 3.器材：冰箱，顯微鏡、注射器、解剖用具、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片，內(nèi)有濕紗布的小鋁盒等。（二）操作步驟。 1.取洋蔥內(nèi)表皮

22、（1cm×0.6cm每瓶放3片）沉于10%中性富爾馬林液中，4下固定30分鐘，（置冰箱貯藏室），對照實驗置50烘箱中。（加液至青霉素瓶1/2體積）2.去福爾馬林液，自來水漂洗5分鐘。（青霉素瓶水加滿，換3次）3.去水，加酸性磷酶作用液，室溫下置30分鐘。（加液至青霉素瓶1/3體積）4.去作用液，自來水漂洗10分鐘。（青霉素瓶水加滿，換3次）5.去水，加1%硫化銨處理3-5分鐘。（加液至青霉素瓶1/3體積）6.去硫化銨，加水漂洗。（青霉素瓶水加滿，換1次）7.置載玻片上，加蓋玻片。8.顯微鏡觀察（注意液泡中標黑色的小顆粒，表示有酸性磷酸酶的活力）。9.顯微數(shù)碼拍照。六、注意事項作對照實

23、驗：在處理過程中，對照組的作用液中不加入甘油磷酸鈉而加入蒸餾水，則呈陰性。七、實驗報告實驗四 細胞膜的滲透性一、實驗類型驗證性實驗二、實驗?zāi)康?.了解細胞膜對物質(zhì)通透性的一般規(guī)律。2.了解溶血現(xiàn)象及其發(fā)生機制。3掌握普通光學(xué)顯微鏡下細胞及細胞碎片的形態(tài)。三、預(yù)習(xí)要求 預(yù)習(xí)細胞膜的組成及功能特點。四、實驗原理細胞膜是細胞與環(huán)境進行物質(zhì)交換的選擇通透性屏障。它是一種半透膜，可選擇性控制物質(zhì)進出細胞。將紅細胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細胞內(nèi)，可使細胞 脹破，血紅蛋白釋放到介質(zhì)中，由不透明的紅細胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液，這種現(xiàn)象稱為溶血。將紅細胞放在某些等滲鹽溶液中，由于紅細胞膜對各種溶

24、 質(zhì)的通透性不同，膜兩側(cè)的滲透壓平衡會發(fā)生改變，也會發(fā)生溶血現(xiàn)象。因此，發(fā)生溶血現(xiàn)象所需時間長短可作為測量物質(zhì)進入紅細胞速度的一種指標。本實驗選用紅細胞作為細胞膜透性的實驗材料，將其放入不同的介質(zhì)溶液中，觀察紅細胞的變化。五、實驗內(nèi)容（一）試劑與器材1.材料：血細胞。2.器材：普通顯微鏡、試管、試管架、滴管、載玻片、蓋玻片、擦鏡紙、記號筆等。3. 試劑：0.128 mol/L NaCl溶液、0.128 mol/L NH4Cl溶液、0.128 mol/L 醋酸銨溶液、0.128 mol/L草酸銨溶液、 0.128 mol/L NaNO3溶液、0.24mol/L 葡萄糖、0.24mol/L甘油、

25、0.24mol/L 乙醇、 0.24mol/L 丙酮、蒸餾水。（1）Alsever溶液葡萄糖 2.05g 檸檬酸鈉(Na9C6H5O7.2H2O) 0.89g 檸檬酸（C6H6O7.H2O） 0.05g 氯化鈉 0.42g 蒸餾水 100ml 調(diào) PH 至 7.2，過濾滅菌或高壓滅菌 10min，置 4冰箱保存。（二）操作步驟1血細胞懸液的制備：取從集市處接新鮮血5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsever溶液瓶中，勻后置冰箱保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)使用）。 2.使用前，取用 Alsevers 液保存的新鮮雞血 5ml，加入 8ml 0.128mol/L 的 NaCl 溶液，小心混勻，1000

26、 rmin離心 5min，如此 3 次洗滌，最后成 30%的雞紅細胞（CRBC）懸液。3.取 10 支試管，按附表中所示測試溶液，分別取樣各 3ml，作出標記后，各管均加入紅細胞懸液 2 滴，混勻后靜置于溫室中，觀察各支試管中發(fā)生溶血的時間及其變化。4.顯微鏡檢查細胞的完整性5.結(jié)果1）試管內(nèi)液體分兩層：上層淺黃色透明，下層紅色不透明為不溶血；鏡檢紅細胞完好為不溶血。2）如果試管內(nèi)液體混濁，上層帶紅色者，稱不完全溶血（或）鏡檢有部分紅細胞呈碎片。3）如果試管內(nèi)液體變紅而透明者，稱完全溶血（），鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞全部呈碎片。六、注意事項1.膠頭滴管不可混用，以免造成溶液間的交叉污染。2. 雞血在離心時，試管均需在扭力天平上平衡。離心結(jié)束后，小心傾去上層血漿及中層血小板等成分，盡量控干。目測紅細胞體積或置于帶刻度的離心管中，加入生理鹽水配成30%的紅細胞懸液；試管中有紅細胞和測試溶液時，不應(yīng)強力搖晃，以免造成人為的紅細胞破裂。3. 結(jié)論應(yīng)肉眼觀察與鏡檢相結(jié)合。七、實驗報告書寫實驗報告，并就細胞膜對不同物質(zhì)的滲透性不同，對實驗結(jié)果進行分析，見表 1。 表 1 各種溶液的溶血現(xiàn)象觀察結(jié)果編號測試溶液是否溶血分析原因1