鏈格孢菌原生質體的制備與限制性內(nèi)切酶介導整合(REMI)

1、鏈格孢菌原生質體的制備與限制性內(nèi)切酶介導整合（REMI ）轉化的致病性誘變伏建國 朱云枝 強勝*（南京農(nóng)業(yè)大學雜草研究室，南京 210095）摘要：以鏈格孢菌(Alternaria alternata (Fr. Keissler菌株NEW 為供試菌株，研究了菌齡、酶系統(tǒng)、酶解時間、酶解溫度及穩(wěn)滲劑對鏈格孢菌原生質體制備的影響。結果表明，制備鏈格孢菌原生質體比較適宜的條件為PD 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h, 以0.7mol/ L NaCl為穩(wěn)滲劑,1 %Lysing Enzyme 、1 %Drislase 和1 %Snailase 3 種酶溶液混合使用, 30酶解3 h。對原生質體進行了限制性內(nèi)切酶

2、介導整合（REMI）轉化，篩選到了鏈格孢菌弱致病突變株NEW001，為致病相關基因的標記和克隆打下了基礎。關鍵詞：鏈格孢菌，原生質體，限制性酶介導整合，致病性變異紫莖澤蘭是一種世界惡性雜草，目前已對農(nóng)業(yè)、環(huán)境及人類的健康造成了極大的危害(強勝，1998。強勝等（1998；1999；2002）在紫莖澤蘭葉片的天然病株上分離到鏈格孢菌(Alternaria alternata (Fr. Keissler，發(fā)現(xiàn)該菌對紫莖澤蘭具有很好的防效，其產(chǎn)生的一種致病毒素能夠代替病原菌起到防除紫莖澤蘭的作用。進一步研究還發(fā)現(xiàn)該毒素對其它農(nóng)田主要雜草有較高的生物活性（萬佐璽等，2001），在100ppm 濃度以下

3、就可以殺死稗、馬唐和鱧腸等（安傳福，2003）。超微結構研究發(fā)現(xiàn)，該毒素對葉綠體造成傷害（常纓等，2003）。致病機理研究表明，該毒素作用于光合系統(tǒng)質體醌，引起光合作用代謝受阻（戴新賓等，2003）。是具有開發(fā)成生物源化學除草劑潛力的。為了探索該毒素的代謝過程以及通過改良菌株，更好地開發(fā)和利用這一具有潛力的生防菌，對致病和產(chǎn)毒相關基因的研究很有必要。目前克隆基因的方法很多，其中限制性內(nèi)切酶介導整合（REMI）轉化在絲狀真菌應用較為廣泛，操作也相對簡單，目前已在包括鏈格孢菌等幾種絲狀真菌致病相關基因的研究中應用并獲得成功（Tanaka et al.,1999；王政逸等，2001）。但是，直接引用

4、他們的方法并不能獲得對紫莖澤蘭鏈格孢菌的誘變轉化。在REMI 的操作過程中，大量原生質體的獲得是前提和關鍵。由于不同真菌，以及不同菌株在細胞壁組成及其它一些生物學特性方面都存在差異，制備原生質體的方法也不同，故開展研究非常必要。本文主要探索出了適合這種對*基金項目：國家863項目(2001AA246012；國家自然科學基金(30170619資助*通訊作者：強勝Tel:E-mail:紫莖澤蘭具有特殊防效的鏈格孢菌(Alternaria alternata (Fr. Keissler原生質體制備的方法，并通過REMI 轉化篩選到致病和產(chǎn)毒減弱的突變體，向致病相關基因的克

5、隆邁出了堅實的一步。1 材料與方法1.1菌株與質粒:鏈格孢菌菌株NEW 是本實驗室保存菌株，質粒pSH75由Takashi Tsuge贈送(Tanaka et al 1999。1.2 培養(yǎng)基:培養(yǎng)基:馬鈴薯200,蔗糖20,加水定容至1；PDA：馬鈴薯200, 蔗糖20,瓊脂粉15 g,加水定容至1；再生培養(yǎng)基：0.1%酵母粉，0.1%蛋白胨，1M 蔗糖，0.8% 的瓊脂；1.3 試劑 酶制劑：蝸牛酶(Snailase,簡稱S(北京百泰生化技術公司,崩潰酶(Drislase簡稱D(Sigma公司,裂解酶（Lysing Enzyme,簡稱L）(Sigma公司,限制性內(nèi)切酶Hind (上海生工,

6、10 mM Na 2HPO 4 ,pH 穩(wěn)滲劑:0.7 M 、山梨醇、蔗糖，及OM（1.2 M MgSO 45.8），STC(1 M sorbitol,50 mM CaCl2, 50 mM Tris-Cl,pH8.0其它：40%PEG4000(用STC 配制，潮酶素B(hygromycin B,CALBIOCHEM分裝1.4 原生質體制備:方法參考宋慶濤，張國真等（2003）和周益軍等（2000），并做適當?shù)男薷?。接種鏈格孢菌菌株NEW于PDA培養(yǎng)基，26 培養(yǎng)3 天，取直徑5 mm菌落邊緣菌絲塊若干塊接種80 mL PD培養(yǎng)基，26 120 r/min搖床培養(yǎng)20 h,收集0.2 g濕菌絲，

7、無菌水洗滌2 次，0.7 mol/L NaCl 穩(wěn)滲劑洗滌三次，加入10 mL 1% D+1% L +1% S 的混合酶液（0.7 mol/L NaCl 穩(wěn)滲劑配制），30 100 r/min 搖床酶解3 h。原生質體用400目尼龍篩過濾，濾液750 g 離心5 min,STC洗滌3 次，收集備用。每次試驗設3個重復。3.5和4 h 其它操作同上。以及OM（1.2 M MgSO 4, 10mM Na 2HPO 4,pH5.8）分別配制酶溶液,進行酶解試驗,洗滌菌絲時所用的穩(wěn)滲劑和酶溶液中穩(wěn)滲劑保持一致,最后也懸浮在相同的穩(wěn)滲液中,其它操作同上。1.5 限制酶介導整合（REMI）轉化:方法參考A

8、kamatsu et al （1997）和Tanaka et al （1999），并作適當修改。取80 µL 原生質體懸浮液（約10個）加入1.5 mL 的離心管中，依次加入20 µL 40 %的PEG4000，5 µg 質粒pSH75及10 U限制性內(nèi)切酶Hind，輕輕混合后置于冰上30 Min，加入900 µL PEG4000，混勻后室溫放置10 Min 。將上述反應液與5 mL 47 的再生培養(yǎng)基混勻后倒于含1.5 %瓊脂的再生培養(yǎng)基上，26倒置培養(yǎng)過夜。覆蓋5 mL含1.5% 瓊脂和400 µg/mL hygromycin B 的再生培

9、養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)3-4 天后獲得再生菌株。1.6 弱致病菌株的篩選:將1.6 中獲得的再生菌株連續(xù)轉接含400 µg/mL hygromycin B的PDA平板，再將穩(wěn)定生長的菌株轉接PDA平板生長三天，用打孔器取菌落邊緣直徑5 mm的菌苔置于紫莖澤蘭葉片背面，培養(yǎng)皿中保濕放置3 天，以出發(fā)菌株NEW為對照，檢測突變株的致病力，篩選致病力減弱突變株和致病缺失突變體。1.7 弱致病突變株產(chǎn)毒力的測定:將1.7 中獲得的弱致病力菌株置于PSK培養(yǎng)基中120 r/m搖床培養(yǎng)6 天，以出發(fā)菌株NEW為對照，檢測突變株無菌濾液的致病力。方法參考萬左璽等（2001）。2結果2.1 菌齡對原生質體制

10、備的影響:從表1結果可以看出，用于制備原生質體的鏈格孢菌菌絲最佳培養(yǎng)時間為20 h左右。菌絲培養(yǎng)時間過短，菌絲體比較幼嫩，形成的原生質體大小不一，釋放后更容易受到破壞；菌絲培養(yǎng)時間過長，菌絲細胞壁開始老化增厚，成分發(fā)生變化，產(chǎn)生對降解酶耐受的結構，不容易被酶解，所以原生質體釋放量減少。表1 菌齡對原生質體制備的影響Table 1 Effect of mycelia age on preparation of protoplasts菌齡(Mycelia age16 202428 原生質體數(shù)（10） (Yield of protoplasts 1.19 2.39 2.17 0.85 772.2 酶

11、系統(tǒng)對原生質體制備的影響真菌細胞壁主要由幾丁質、半纖維素、糖元、蛋白質等多種成分構成，單一酶只能降解其中的一種或幾種成分，因此獲得的原生質體體積小，量也少。崩潰酶是一種復合酶, 內(nèi)含昆布多糖酶(laminarinase、木聚糖酶(xylanase和纖維素酶(cellulase,消解細胞壁的能力強，裂解鏈格孢菌獲得的原生質體最多。裂解酶和蝸牛酶也是復合酶，但效果較差。而三種酶復合使用后，原生質體的釋放量顯著增加。酶濃度也是影響原生質體制備的重要因素之一，一般情況下，原生質體的釋放量隨著酶濃度的升高而增加。但過高濃度的酶對原生質體的制備也不利?；诮?jīng)濟和實用的原則，本文使用1%的三種酶的混合酶即可

12、獲得符合轉化要求的原生質體。表2 酶系統(tǒng)對原生質體制備的影響Table 2 Effect of enzyme system on preparation of protoplasts酶系統(tǒng)(Enzyme system1%D 1%L1%s1%D+1%S1%D+1%S+1%L0.5%D+0.5%S+0.5%L 原生質體數(shù)（10） (Yield of protoplasts 0.683333 0.1 0.193333 1.36 2.536667 0.773333 72.3 酶解時間對原生質體制備的影響酶解時間對原生質體制備影響的結果見圖1，由于不能保證用于酶解的菌絲體的菌齡完全一致，在酶解過程中，幼

13、嫩菌絲先被裂解而釋放出原生質體，隨后相對較老的菌絲體開始釋放原生質體。所以隨著酶解時間的延長，原生質體的釋放量不斷增加，但達到3 h后，原生質體量開始下降。這可能是由于先釋放出的原生質體長時間暴露在酶液中，酶液中蛋白酶對原生質體膜造成損害而導致原生質體破裂。2.4 酶解溫度對原生質體制備的影響溫度是影響酶作用效果的主要因素之一，不同酶具有各自最適溫度，但混合酶最適溫度需要測定。由于實驗所用的三種酶的最適溫度都是30 左右，所以混合酶的也在30 時獲得的原生質體量最多。表3 酶解溫度對原生質體制備的影響Table 3 Effect of digesting temperature on prep

14、aration of protoplasts酶解溫度(digesting temperature28 3032 2.5 穩(wěn)滲劑對原生質體制備的影響多數(shù)情況下，有機類化合物作為穩(wěn)滲劑要好于無機鹽，這可能與有機化合物分子量較大有關。但也有不同的報道。本實驗中，以無機鹽做穩(wěn)滲劑效果明顯比有機類化合物好。這說 明穩(wěn)滲劑的選擇與菌本身特性有關，不同菌的適合穩(wěn)滲劑不同。原生質體數(shù)（10） (Yield of protoplasts 2.093333 2.303333 1.953333 72.6 轉化子的篩選 野生型菌株不含有抗hygromycin B的基因（hph ），因此在含hygromycin B 的

15、再生培養(yǎng)基上長出的菌落理論上都是成功的轉化子。將這些轉化子連續(xù)多次轉接400µg/mL hygromycin B 的再生培養(yǎng)基中都能穩(wěn)定生長，沒有出現(xiàn)流產(chǎn)轉化子，而對照的野生型菌株NEW不能生長。初步認定含有抗hygromycin B基因的質粒pSH75已成功地插入鏈格孢菌基因組中。轉化效率約為4-5個轉化子/µg 質粒DNA。2.7 弱致病菌株的篩選 在獲得的轉化子中，有一突變株NEW001在菌落形態(tài)上變異明顯（圖3），菌落顏色變黑，菌苔變薄，菌絲緊貼培養(yǎng)基表面生長，絨毛狀的菌絲少。致病力實驗發(fā)現(xiàn)，突變株NEW001的對紫莖澤蘭的致病力顯著降低（圖4）。產(chǎn)毒力實驗也發(fā)現(xiàn)，

16、NEW001 產(chǎn)生致病毒素的量也顯著下降。初步判斷突變株NEW001以上性狀的改變與質粒的插入有關。 圖3 突變株NEW001和野生型菌株NEW菌落形態(tài)的比較左：突變株NEW001，右：野生型菌株NEW. Fig 3 Morphology differences between mutant NEW001 and wild type NEWThe left colony is mutant NEW001, the right one is wild type NEW圖4 突變株NEW001和野生型菌株NEW致病力的比較左半葉為NEW形成的病斑，右半葉為NEW001形成的病斑Fig 4 Path

17、ogenicity comparision between mutant NEW001 and wild type NEWNecrosis on the left and right side of the leaf was caused by NEW and NEW001 respectively3.討論原生質體的量是影響轉化結果的關鍵因素之一。實驗發(fā)現(xiàn)，轉化所用的原生質體量低于106個幾乎得不到轉化子。Tanaka et al（1999）等得到成功轉化所用的原生質體量都在10左右。因此，大量原生質體的獲得成為必要。由于不同真菌的細胞壁存在差異，所以制備原生質體所用的酶以及適合的酶解條件和方

18、 法也不同。本文對紫莖澤蘭生防菌NEW 的原生質體制備尚屬首次，通過實驗探索出了制備鏈格孢菌原生質體的可行方案，獲得了限制性內(nèi)切酶介導轉化所需的原生質體，為后面的成功轉化打下基礎。 7REMI 是Schiestl & Petes(1991在轉化酵母時建立起來的一項技術，后來在多種絲狀真菌中廣泛應用，使轉化效率得到不同程度的提高。本文使用這一方法獲得的轉化效率雖然不高（約為4-5個/µg DNA），但不加限制性內(nèi)切酶的對照轉化實驗沒有得到轉化子。這說明REMI 方法在這一真菌的轉化中是可行的，只是轉化效率相對較低，轉化方法還需進一步摸索和改進。REMI 可以隨機插入受體菌的某一

19、相關基因或調控序列，從而導致相應功能的喪失或減弱，同時也對這一基因或序列進行了標記，為基因的克隆提供了條件。目前，應用該方法已在玉米小斑病病原菌、鏈格孢菌梨?；汀⒌疚敛【榷喾N絲狀病原真菌的致病相關基因克隆和致病缺失突變體的篩選中獲得成功（王政逸等，2001），充分證明了這一方法的可行性。本文通過REMI 獲得的突變株NEW001經(jīng)多次繼代后仍能在含有潮酶素的培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長，其菌落形態(tài)、生長速率及產(chǎn)孢量等基本特性都沒有發(fā)生變化。這可以初步判定含抗潮酶素基因（hyh ）的質粒已經(jīng)成功插入鏈格孢菌基因組中，并可以通過有絲分裂穩(wěn)定遺傳。突變株NEW001不僅在菌落形態(tài)上發(fā)生變異，其生長速率、產(chǎn)孢

20、量及孢子萌發(fā)率都比野生型菌株NEW顯著降低（資料未列出）。致病力實驗發(fā)現(xiàn)，突變株NEW001對紫莖澤蘭的致病力顯著下降，僅能在紫莖澤蘭的葉片上形成很小的病斑。同時，突變株NEW001液體搖瓶培養(yǎng)獲得的初毒素的量也大大降低，不到野生型菌株NEW的三分之一，為毒素是主要致病因子的推測提供了佐證。這些變異很有可能是由于質粒插入導致鏈格孢菌致病相關基因失活或表達受到抑制。后面的工作將是用PCR和Southern雜交對質粒的插入進行進一步的鑒定，致病相關基因有待于通過質粒拯救或反向PCR的方法獲得。REFERENCESAkamatsu H, Itoh Y, Kodama M et al,1997.AAL

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