胰腺干細(xì)胞的分子標(biāo)志及其獲得途徑

1、胰腺干細(xì)胞的分子標(biāo)志及其獲得途徑 11-03-22 15:07:00 作者：吳偉全，周光紀(jì)編輯：studa20【摘要】 胰島移植是目前治療I型糖尿病的最佳方法，但供源的匱乏限制了此方法的應(yīng)用。尋找胰島細(xì)胞新來(lái)源已成為糖尿病研究的熱點(diǎn)。胰腺干細(xì)胞的研究為糖尿病的細(xì)胞移植治療展示了良好的應(yīng)用前景。本文就胰腺干細(xì)胞的分子特征及其獲得途徑的研究進(jìn)行綜述。 【關(guān)鍵詞】 胰腺干細(xì)胞；分子標(biāo)志；糖尿?。痪C述文獻(xiàn)Edmonton方案的成功1，使胰島移植成為治愈糖尿病最有希望的方法，但此方法的廣泛開(kāi)展仍受供體來(lái)源匱乏和免疫排斥的限制。理論上，胚胎干細(xì)胞能分化為我們希望得到的任何細(xì)胞，是一種“萬(wàn)能”的種子細(xì)胞；但

2、就胰島素分泌細(xì)胞而言，從胰腺組織得到的成體干細(xì)胞似乎更易于向具有胰島素分泌功能的胰島細(xì)胞分化2，所以胰腺干細(xì)胞作為胰島細(xì)胞的潛在種子細(xì)胞而成為研究的熱點(diǎn)。本文就胰腺干細(xì)胞研究的新發(fā)現(xiàn)進(jìn)行綜述。 1 胰腺干細(xì)胞的主要分子標(biāo)志物 探討胰腺干細(xì)胞的確切來(lái)源和特異性分子標(biāo)志，目的在于進(jìn)一步了解胰腺干細(xì)胞的生物學(xué)特性，對(duì)胰腺干細(xì)胞的分離、純化及轉(zhuǎn)型定向分化為胰島細(xì)胞有重要意義，胰腺干細(xì)胞的移植為糖尿病的治療開(kāi)辟道路。 1.1 巢蛋白(nestin) nestin是在神經(jīng)干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種中間絲蛋白,已被確認(rèn)是神經(jīng)干細(xì)胞的分子標(biāo)志。2000年 Hunziker 等3 首先報(bào)道4周齡的小鼠胰島內(nèi)存在nest

3、in陽(yáng)性細(xì)胞。 他們由nestin陽(yáng)性胰腺導(dǎo)管上皮樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到胰島細(xì)胞的一個(gè)亞群,認(rèn)為nestin是胰島干細(xì)胞的一個(gè)分子標(biāo)志物,其作用可能是促進(jìn)胰腺內(nèi)分泌干細(xì)胞的分化。在16d 小鼠胚胎的胰島細(xì)胞團(tuán)中nestin很豐富,并普遍存在于60 d 小鼠的胰島和胰腺導(dǎo)管，且nestin陽(yáng)性的細(xì)胞在體外培養(yǎng)8個(gè)月后仍具有增生能力。最近，Kedees等4根據(jù)胰高血糖素信號(hào)能控制nestin的表達(dá)的原理，通過(guò)分析小鼠胰腺上皮祖細(xì)胞和胰腺外分泌細(xì)胞的胰高血糖素信號(hào)，結(jié)合免疫組織化學(xué)染色和mRNA檢測(cè)，最終確定nestin確實(shí)在胰腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，認(rèn)為nestin可以作為胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志物。Bernard

4、o等5通過(guò)用增強(qiáng)綠色熒光蛋白技術(shù)（EGFP）結(jié)合免疫組織化學(xué)染色方法和RTPCR技術(shù)來(lái)分析轉(zhuǎn)基因小鼠nestin陽(yáng)性胰島細(xì)胞，結(jié)果顯示nestin陽(yáng)性胰島細(xì)胞具有多向分化的潛能，體外培養(yǎng)條件下可分化為胰腺內(nèi)、外分泌細(xì)胞。說(shuō)明胰島nestin陽(yáng)性細(xì)胞是胰腺干細(xì)胞，nestin是胰腺干細(xì)胞的重要分子標(biāo)志物。 1.2 胰腺十二指腸同源盒1（PDX1） 人PDX1蛋白由283個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量為31103D。 在成年胰腺組織中，PDX1僅存在于胰島中分泌胰島素的B細(xì)胞和分泌生長(zhǎng)抑素的D細(xì)胞上。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，PDX1最早在e9.5時(shí)即出現(xiàn)于原腸胚胰芽萌生處，繼而胰芽萌出，發(fā)育成胰腺。PDX1

5、純合缺陷的小鼠胚胎不能形成胰腺組織，雜合缺陷小鼠出生后將發(fā)展為糖尿病。在胰島再生過(guò)程中，總是先有PDX1的表達(dá)，再有胰島的新生。在胰腺發(fā)育的早期，胰腺內(nèi)、外分泌細(xì)胞上均有PDX1表達(dá)。發(fā)育成熟后，PDX1僅在胰島B細(xì)胞和D細(xì)胞中出現(xiàn)6。在胚胎干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的體外誘導(dǎo)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細(xì)胞階段和分化的早期（擬胚體）階段均無(wú)PDX1的表達(dá)。經(jīng)過(guò)特異性誘導(dǎo)之后，出現(xiàn)PDX1的表達(dá)，然后有胰島素分泌細(xì)胞出現(xiàn)7。在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)過(guò)程中，也是先有PDX1表達(dá)，再有胰島素分泌細(xì)胞出現(xiàn)8。因此，PDX1是胰腺干/祖細(xì)胞的特征性標(biāo)志之一。 1.3 細(xì)胞角蛋白19(CK

6、19) CK19是細(xì)胞角蛋白的片段，是上皮細(xì)胞骨架的一種中間絲狀物，是一種酸性蛋白。在胰腺發(fā)育過(guò)程中，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞來(lái)源于角蛋白陽(yáng)性的內(nèi)胚層上皮細(xì)胞，有高水平的角蛋白表達(dá)。Feng等9從胎豬胰島獲得導(dǎo)管上皮細(xì)胞中分離得到表達(dá)CK19的細(xì)胞，其體外的生長(zhǎng)行為有類似胚胎干細(xì)胞樣生長(zhǎng)形態(tài)，細(xì)胞體外增殖活力很強(qiáng)，現(xiàn)已傳至18代，細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后分化為分泌胰島素的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，并且伴隨著細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。最近，Chen等10通過(guò)研究證明人的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞表達(dá)CK19陽(yáng)性，是胰腺干細(xì)胞的主要來(lái)源，并證實(shí)這種CK19陽(yáng)性細(xì)胞能誘導(dǎo)分化為胰腺的內(nèi)分泌細(xì)胞。因此表明CK19也是胰腺干細(xì)胞的重要分子標(biāo)志。 1.

7、4 ABCG2 ABCG2是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATPbinding cassette transporter)家族成員ABCG2/Bcrpl。這種蛋白的功能目前還不清楚，但有人認(rèn)為可能屬于細(xì)胞膜上的泵蛋白，和多藥耐藥基因MDR相似。膜上表達(dá)ABCG2的細(xì)胞能夠把進(jìn)入細(xì)胞的熒光染料hoechst33342泵出細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的核酸不被染色，細(xì)胞呈現(xiàn)微弱的蘭色熒光。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，這些細(xì)分布于主要細(xì)胞的一側(cè)，因而被稱為側(cè)群細(xì)胞（side population, SP細(xì)胞）。SP細(xì)胞最早在作造血干細(xì)胞研究時(shí)被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)包括腫瘤在內(nèi)的多種組織中都有SP細(xì)胞，是一類原始幼稚的未分化細(xì)胞11。來(lái)源于胰

8、腺的SP細(xì)胞具有形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)的能力，也可以視為胰腺干細(xì)胞。但ABCG2不僅限于在胰腺組織中表達(dá)，可能是所有干細(xì)胞共有的一個(gè)“通用標(biāo)志”12。我們正在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從人胚胎胰腺得到的細(xì)胞經(jīng)過(guò)純化擴(kuò)增后，在流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)86%以上的細(xì)胞都可以表達(dá)ABCG2。這些細(xì)胞有很強(qiáng)的增殖能力，在體外能被誘導(dǎo)形成具有胰島素分泌功能的類胰島樣結(jié)構(gòu)胰島樣細(xì)胞團(tuán)（資料待發(fā)表）。 1.5 胰腺干細(xì)胞的其它分子標(biāo)志物 已知胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志物還有神經(jīng)元蛋白3(Ngn3)、波形蛋白(Vimentin)等1314，也許還有很多的標(biāo)志物尚未被發(fā)現(xiàn)，篩選胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志物的新方法也還在不斷探索之中。由于胰腺干細(xì)胞標(biāo)志物的

9、多樣性，在確定胰腺干細(xì)胞時(shí),需多種標(biāo)志物綜合考慮才能確定。 2 胰腺干細(xì)胞的獲得 作為一種存在于已分化組織中的成體干細(xì)胞，自然狀態(tài)下的胰腺干細(xì)胞只存在于胰腺組織，主要是胰腺導(dǎo)管、胰島以及胰腺腺泡中。由于干細(xì)胞的多向分化特性，在特定情況下其他組織的多能干細(xì)胞也可能“轉(zhuǎn)分化（transdiffetentiation）”為胰腺干細(xì)胞。因此，獲得胰腺干細(xì)胞的方法主要是從胰腺組織中分離或從其他多能干細(xì)胞“轉(zhuǎn)分化”而來(lái)。 2.1 胰腺導(dǎo)管 絕大多數(shù)研究者認(rèn)為，胰腺干細(xì)胞存在于胰腺的導(dǎo)管中。Ramiya等15最先報(bào)道從分離的小鼠胰腺導(dǎo)管培養(yǎng)中獲得了胰腺干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下傳代了3 a。該細(xì)胞可培養(yǎng)分化為

10、胰島樣細(xì)胞團(tuán)，將該細(xì)胞團(tuán)移植到NOD鼠(nonobese diabetic mice,非肥胖型糖尿病鼠)可顯著降低其血糖，能夠逆轉(zhuǎn)NOD鼠的糖尿病癥狀。最近，喬海等16 從胎兒胰腺中采用膠原酶消化法分離出胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ICCs)，并對(duì)其進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，從中純化分離出具有自我更新能力的上皮樣細(xì)胞,為導(dǎo)管來(lái)源, 免疫組織化學(xué)染色顯示其表達(dá)胰十二指腸同源異型盒基因1 (PDX1)、CK19、神經(jīng)Nestin，不表達(dá)胰島素，具胰腺干細(xì)胞特性。 2.2 胰島 胰腺干細(xì)胞存在于胰島本身越來(lái)越受研究者關(guān)注。Yang等17從大鼠胰腺中采用膠原酶V消化法分離出胰島樣細(xì)胞團(tuán)，根據(jù)胰島細(xì)胞的純度分為3個(gè)等級(jí)組，A為低

11、等級(jí)(43.606.29)%，B為中等級(jí)(65.304.40)%，C為高等級(jí)(77.606.36)%。然后提取細(xì)胞RNA，再進(jìn)行RTPCR測(cè)定細(xì)胞的CK19和PDX1的表達(dá)，結(jié)果顯示不同純度的胰島中均有CK19及PDX1蛋白和mRNA的表達(dá),表明在純化胰島中均有胰腺干細(xì)胞存在。 2.3 胰腺腺泡 有些研究者認(rèn)為胰腺干細(xì)胞也可能存在于胰腺腺泡中。Ku等18 報(bào)道胰腺腺泡中也存在胰腺干細(xì)胞，雖然數(shù)量較少，但其誘導(dǎo)后產(chǎn)生細(xì)胞的比例高于導(dǎo)管中的胰腺干細(xì)胞，在葡萄糖刺激反應(yīng)中分泌胰島素的量更大。 2.4 多能干細(xì)胞的“轉(zhuǎn)分化” 胚胎干細(xì)胞（ESC）和胚胎生殖嵴干細(xì)胞（EGC）是目前發(fā)現(xiàn)的具有“全能性”的

12、干細(xì)胞。自2000年有胚胎干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞（insulin producing cell,IPC）的報(bào)道以后，ESC在糖尿病治療中的研究一直是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。我們也成功將ESC誘導(dǎo)成了IPC，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)方法，縮短了誘導(dǎo)時(shí)間，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的實(shí)驗(yàn)性治療中取得了初步療效。但所能獲得的IPC數(shù)量太少，胰島素分泌功能差是目前存在的主要問(wèn)題19。EGC是從胚胎內(nèi)胚層遷移到胚胎生殖嵴中的原始細(xì)胞，保留了與ESC相似的“全能性”，可以分化為肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，但目前還沒(méi)有EGC分化為IPC的報(bào)道。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)情況下可以分化為

13、IPC。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)容易獲得，其最大優(yōu)勢(shì)還在于取自自身的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于自體移植時(shí)可消除免疫排斥這個(gè)器官移植的最大難題，因而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的IPC來(lái)源20。 十二指腸、空腸上段組織中的“K”細(xì)胞在體外有很強(qiáng)的增殖分化能力，也可以轉(zhuǎn)分化為IPC21。在某些情況下，肝臟組織中可以看到胰腺組織的“化生”現(xiàn)象，說(shuō)明肝臟中也有能分化為胰腺組織的細(xì)胞。在胚胎發(fā)育上，肝臟、胰腺和小腸的同源性很高。因此，從理論上來(lái)說(shuō)，這些組織中殘留的干細(xì)胞是最有可能轉(zhuǎn)分化為胰腺組織的，但目前為止尚未看到從肝、腸干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為IPC的報(bào)道。 3 胰腺干細(xì)胞的分離及純化 胰腺干細(xì)胞的分離及純

14、化方法主要包括：(1)膠原酶解離法(多用V型膠原酶)結(jié)合密度梯度離心分離技術(shù)；(2)離解組織法：包括機(jī)械分離法(組織研磨、過(guò)濾等)與酶分解法；(3)利用細(xì)胞表面的分子標(biāo)志分離純化，包括免疫溶解法、流式細(xì)胞結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、平面黏附分離法及免疫磁珠分選技術(shù)。 3.1 膠原酶解離結(jié)合密度梯度離心分離技術(shù)法 在酶學(xué)方法解離的方法中，常用的技術(shù)包括用胰蛋白酶消化、膠原酶消化等。用酶學(xué)方法到達(dá)部分分離純化的主要依據(jù)是不同的組織的細(xì)胞和間質(zhì)的構(gòu)成不同。而利用細(xì)胞體積和密度進(jìn)行分離純化的技術(shù)均基于沉降作用。其基本原理是，在離心力的作用下，細(xì)胞在一定介質(zhì)中的沉降速率與細(xì)胞的體積及細(xì)胞密度和其

15、周圍介質(zhì)密度之差成正比。細(xì)胞的體積越大，其與分離介質(zhì)的密度差越大，則細(xì)胞的沉降速率就越快。對(duì)與特定的待分離細(xì)胞來(lái)說(shuō)，其體積和密度是固定的，可以選擇的只是具有一定密度與黏度的分離介質(zhì)。使之沉降的細(xì)胞密度應(yīng)該比介質(zhì)大，而使之漂浮的細(xì)胞的密度則應(yīng)比介質(zhì)小。因此，實(shí)施沉降技術(shù)分離細(xì)胞的關(guān)鍵在于選擇密度梯度形成介質(zhì)，故沉降技術(shù)也稱為密度梯度離心技術(shù)。陳維平等22 用V型膠原酶消化小鼠胰腺組織( 濕重), 結(jié)合自然沉降技術(shù)形成不連續(xù)密度梯度離心。分別從磷酸鹽緩沖液/1.068 g/L Percoll液(第一界面)、1.068 g/L Percoll 液/1.096 g/L Percoll液(第二界面)、1

16、.096 g/L Percoll液/1.118 g/L Percoll液(第三界面) 收集細(xì)胞。各界面細(xì)胞均加入含體積分?jǐn)?shù)為0.1 胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基, 置于經(jīng)多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。最終從胰腺內(nèi)、外分泌部的組織中能成功獲取胰腺干細(xì)胞特異性標(biāo)志Nestin表達(dá)陽(yáng)性的干樣細(xì)胞。最近，Noguchi等23 采用膠原酶消化小鼠胰腺組織,結(jié)合自然沉降技術(shù)形成不連續(xù)密度梯度離心，經(jīng)過(guò)雙硫腙染色技術(shù)和在顯微鏡下將消化后的胰島細(xì)胞從多種細(xì)胞懸液中挑出來(lái)，剩余的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化，最終可以得到分泌胰島素的細(xì)胞。因此，這種方法可以認(rèn)為是一種很好的分離胰腺干細(xì)胞的方法。 3.2 離解組織法 機(jī)械分離與酶學(xué)解離是將組織分散成單細(xì)胞常用的方法。王貝斌等24無(wú)菌采集胎豬胰腺, 置于預(yù)冷的PBS中沖洗并除去周圍的脂肪、