噬菌體隨機(jī)肽庫中與受損內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合短肽的篩選X

1、第29卷第6期南華大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版2001年12月噬菌體隨機(jī)肽庫中與受損內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合短肽的篩選郭玉1,王芳宇2,唐圣松1,廖端芳(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)生物化學(xué)教研室)摘要:目的篩選與受損內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽。方法以氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,ox-LDL)損傷牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,用絲狀噬菌體(FUSE5)表面展示的隨機(jī)6肽和15肽文庫進(jìn)行混合篩選,通過DNA序列測定確定其插入的氨基酸序列。結(jié)果經(jīng)過3輪篩選,得到一些特異性結(jié)合的噬菌體克隆,隨機(jī)挑選10個(gè)克隆,進(jìn)行DNA序列分析,其中8個(gè)克隆含6

2、肽序列,2個(gè)克隆含15肽序列。結(jié)論用噬菌體技術(shù)能篩到與受損內(nèi)皮細(xì)胞親和力高、結(jié)合力強(qiáng)的特異性短肽。關(guān)鍵詞:噬菌體多肽文庫;生物淘選法;內(nèi)皮細(xì)胞中圖分類號:Q343.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號:1000-2510(2001)06-0535-04ScreeningthePeptidesSpecificallyBindingtheInjuredEndothelialCellwithTwoPhage-DisplayedRandomPeptideLibrariesGUOYu,WANGFang-yu,TANGSheng-song,LIAODuan-fang(TheInstituteofPharmacyand

3、Pharmacology,NanhuaUniversity,Hengyang,Hunan421001,China)Keywordsphage-displayedlibrary;micropanning;endothelialcell噬菌體多肽文庫是利用噬菌體表面表達(dá)技術(shù)(phagedisplaytechniques,PDT)在體外條件下構(gòu)建的多肽文庫,將編碼外源肽可變區(qū)DNA片段插入噬菌體基因組中,以融合形式與噬菌體的表面蛋白共同表達(dá)于噬菌體表面。外源蛋白基因?yàn)殡S機(jī)合成的寡核苷酸,具有多種多樣的排列方式,其表達(dá)的氨基酸序列也是多種多樣的,幾乎可以包括自然界中任意一種短肽的排列方式。表達(dá)在噬菌體

4、外殼上的蛋白535特異性結(jié)合的短肽,以該短肽作為先導(dǎo)分子,經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化,可用于受損內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物9和治療藥物篩選研究。1材料與方法1.1材料噬菌體展示的FUSE5隨機(jī)6肽及15;KanK91四環(huán)素抗性的F+大腸桿菌;膠原酶、胰酶為Sigma公司產(chǎn)品;飽和酚、乙醇等均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品;PBS為2.5mmol/LKCl、140mmol/LNaCl、1.5mmol/LKH2PO4和6mmol/LNa2HPO4,pH7.4,高壓滅菌;TBS為150mmol/LNaCl和50mmol/LTris,pH7.4;PEG/NaCl為20%PEG8000和2.5mol/LNaCl。1.2方法用0.1%膠原酶3

5、7消化20min。以小匙輕刮內(nèi)膜,收集消化液,1000r/min離心5min。沉淀的細(xì)胞團(tuán)加培養(yǎng)液制成懸液,計(jì)數(shù),以2×104/cm種植于培養(yǎng)瓶,置二氧化碳培養(yǎng)箱中,24h后換液1次,待細(xì)胞基本融合后,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。第49代供實(shí)驗(yàn)使用。培養(yǎng)KanK91,37約36h后,挑一單克隆于2mLLB培養(yǎng)基中,37振蕩培養(yǎng)過夜。取30L過夜菌至3mLTB培養(yǎng)基中,37劇烈振搖至OD600為1.252.5,減速振搖10min即為感受態(tài)細(xì)胞,須立即用作噬菌體的感染。L適當(dāng)?shù)南♂屢号c10L上述感受態(tài)細(xì)菌,室溫靜置20min,加入480LLB(含四環(huán)素Tc0.2g/mL),37緩慢振搖

6、3060min,誘導(dǎo)Tc抗性基因表達(dá)。取100L涂LB平板(含Tc2040g/mL),存的噬菌體展示文庫,37緩慢振搖20min,倒入50mLLB(含Tc0.2g/mL)中,37劇烈振搖45min,添加Tc至20g/mL,37振蕩過夜。離心(4,5536000r/min,10min),保存上清,再離心(4,10000r/min,10min),保存上清。加入0.15倍體積PEG/Na2Cl,混勻,冰浴4h以上,離心(4,10000r/min,30min),棄上清,再離心(4,10000r/min,1min),去盡上清。沉淀溶于2mLTBS中,加入0.15倍體積的內(nèi)皮細(xì)胞融合成單層后,用ox-LD

7、L(終濃度為100g/mL)作用4h,鏡下觀察細(xì)胞間邊界清楚,胞體變小,細(xì)胞收縮變圓,表明細(xì)胞明顯損傷,以這樣損傷的內(nèi)皮細(xì)胞作為研究靶細(xì)胞。將40L噬菌體6肽及15肽文庫(約1010TU/mL)與3mL含0.1%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基混合,混合液與靶細(xì)胞于37溫育1h。TBS洗滌除去未結(jié)合的噬菌體,甘氨酸-HCl洗脫液(pH2.2)洗下結(jié)合的噬菌體,立即用1mol/LTris-HCl(pH9.1)恢復(fù)洗脫液pH至7.0。洗下的噬菌體與正常內(nèi)皮細(xì)胞37溫育1h。沉淀噬菌體。沉淀溶于100LTE(pH8.0)中,加50LTris-HCl(pH8.0)平衡酚,振蕩30s,室溫放置1min。離心(4

8、,12000r/min,1min),取上層水相并加入250L乙醇和10L3mol/L乙酸鈉(pH5.2)溶液,略加振蕩,室溫靜置15min。離心(4,12000r/min,10min),回收噬菌體單鏈DNA沉淀,70%乙醇洗滌,離心,吸去上清,揮干乙醇,50LTE溶解沉淀,貯存于-20。序列,均由上海生物工程公司測序部測定,其測序引物為5-TGAATTTTCTGTATGAGG-3。噬菌體展示的FUSE5隨機(jī)6肽及15肽文庫含編碼6肽和15肽DNA序列為:5-ACTCGGCCGACGGGGCT(NNK)6,15GGGGCCGCTGGGGCCG-3,其中N代表A、T、C、G4種堿基,K代表G、T2

9、種堿基,(NNK)6,15分別為編碼隨機(jī)6肽和15肽部分。2結(jié)果2.1細(xì)胞淘選效率(Efficiencyofcellpanning)細(xì)胞淘選應(yīng)用于篩選細(xì)胞表面抗原特異性抗體,噬菌體文庫中一些模擬內(nèi)源性活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的多肽能與受損內(nèi)皮細(xì)胞相應(yīng)的受體(或分子)結(jié)合,經(jīng)過3輪篩選,逐步淘汰非特異性及結(jié)合率低的短肽,得到的噬菌體克隆具有較高的特異性和較強(qiáng)的親和力。淘選結(jié)果用每一輪篩選(Roundofscreening)獲得每毫升噬菌體的感染單位(TU/mL)來表示。如圖1所示。2.2DNA電泳分析第3輪洗脫液中隨機(jī)挑選10個(gè)單克隆,擴(kuò)增,提取單鏈DNA。經(jīng)電泳分析,均可見到FUSE5的DNA條帶(922

10、5bp或9252bp),證實(shí)提取的是FUSE5的DNA。見圖2。2.3測序結(jié)果從第3輪洗脫的噬菌體中隨機(jī)挑選并擴(kuò)增了10個(gè)克隆,提取噬菌體的單鏈DNA,經(jīng)測序確定插入序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn):8個(gè)克隆含6肽,2個(gè)克隆含15肽,且具有較好特異性。見圖3及表1。圖1三輪篩選結(jié)果圖2DNA電泳分析1泳道:標(biāo)準(zhǔn);2泳道:Kank91;39泳道:FUSE5圖3測序圖譜(下劃線部分為插入多肽的互補(bǔ)序列)表110個(gè)克隆的插入序列插入序列6肽(8個(gè)克隆)氨基酸序列插入序列15肽(2個(gè)克隆)氨基酸序列5TGGTCGCGGCAGTATTCG35WSRQYS35TGGACGTCGGGTCCGTTTGGGCGTTCTAATTT

11、GCCTGGTCTTAGG35WTSGPFGRSNLPGLR33討論血管內(nèi)皮受損是心血管疾病的病理基礎(chǔ),是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)的始動(dòng)環(huán)節(jié),ox-LDL是As最重要的致病因子,它首先作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,使內(nèi)皮功能障礙,分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子,導(dǎo)致單核細(xì)胞粘附、聚集、內(nèi)移、脂質(zhì)沉積及泡沫細(xì)胞形成。噬菌體隨機(jī)短肽文庫中具有與某些細(xì)胞因子和粘附分子受體部分結(jié)構(gòu)相似的短肽,它們與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合,拮抗相應(yīng)因子和粘附分子活性,阻斷537單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附,阻止As進(jìn)程。PDT是篩選生物活性多肽的新方法10,篩到的短肽具有活性高、免疫副反應(yīng)低、分子量小、合成費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。

12、我所在開展PDT技術(shù)與藥物篩選研究中,已完成構(gòu)建8肽文庫1及確定單抗識(shí)別表位4等工作。在本所現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上,利用同一載體的兩個(gè)肽庫(6肽和15肽)來進(jìn)行混合篩選,增加篩選的容量,便于得到相似的陽性結(jié)果。經(jīng)過3輪篩選及測序分析,我們初步獲得一個(gè)6肽和一個(gè)15肽序列,表明受損內(nèi)皮細(xì)胞上與之相結(jié)合的受體或分子表達(dá)高、親和力強(qiáng),這些短肽的靶向性和生物活性有待進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)1劉革修,王華,張彤,等.噬菌體表面表達(dá)隨機(jī)8肽4王芳宇,宋嵐,何淑雅,等.噬菌體隨機(jī)肽庫在確定單抗識(shí)別表位中的應(yīng)用J.南華大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版,2001,29(1):1-35吳曉琳,吳自榮,呂學(xué)洗,等.從噬菌體短肽庫中篩選模擬乳腺

13、血清抗原表位J.上海免疫學(xué)雜志,1999,19(4):234-2366TangWG,GaoX,ChenFY,etal.PotentialGM-CSFantago2nistsselectedfrompeptidephagedisplaylibraryJ.ActaBio2chinicaetBiophysicaAainica,1999,31(4):463-4657李家大,王克夷.從噬菌體多肽文庫中篩選-葡萄糖苷酶的抑制劑J.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào),2001,33(5):513-5188KajiM,IkariM,HashiguchiS,etal.Peptidemimicsofmono2cytechem

14、oattractantprotein-1(MCP-1)withanantagonisticactivityJ.JBiochem,2001,129:577-5839MazzucchelliBL,BurrittJB,JesaitisAJ,etal.Cell-specificpeptidebindingbyhumanneutrophilsJ.Blood,1999,93(5):1738-174810BarryMA,DowerWJ,JohnstonSA.Towardcell-targetinggenetherapyvectors:selectionofcell-bindingpeptidefromran

15、dompeptide-presentingphagelibrariesJ.NatureMed,1996,2:299文庫的構(gòu)建J.中國病理生理雜志,2000,16(3):243-2462RodiDJ,MakowskiL.Phage-displaytechnologyfindinganee2dleinavastmolecularhaystackJ.CurrOpinBiotechnol,1999,10(1):87-93(收稿時(shí)間:2001-09-06)湖南醫(yī)學(xué)更名啟事湖南醫(yī)學(xué)在廣大讀者、作者的關(guān)愛和兄弟雜志的支持下,走過了18年的歷程。在新年之際,特向您們表示衷心的感謝。歷年來湖南醫(yī)學(xué),曾獲得“湖南省優(yōu)秀科技期刊”“、湖南省一級期刊”“、全國優(yōu)秀科技期刊”、“中國科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊”。2001年又進(jìn)入國家科技部(國科發(fā)財(cái)字2