液_液雙水相萃取分離_淀粉酶研究

1、 第29卷第4期2000年8月貴州工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版 JOURNAL OF GU IZHOU UN IV ERSIT Y OF TECHNOLO GY(Natural Science Edition Vol. 29No. 4August. 2000文章編號(hào):100920193(2000 0420083205液液雙水相萃取分離淀粉酶研究邱樹毅(貴州工業(yè)大學(xué)輕工系, 貴州摘要:研究了PEG /-, 對(duì)PEG 分子量、p H 、相濃度、NaCl 濃度、關(guān)鍵詞:液-; ; -磷酸鹽中圖分類號(hào)文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A0前言雙水相萃取技術(shù)是分離純化蛋白質(zhì)混合物等生物大分子的有效方法。雙水相系統(tǒng)通常是由水溶性的

2、兩種聚合物組成或一種水溶性聚合物與一種鹽組成, 與一般分離純化技術(shù)相比, 雙水相技術(shù)具有處理容量大、能耗低、易連續(xù)化操作和工程放大等優(yōu)點(diǎn), 在蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離純化等方面受到廣泛重視, 是一種有發(fā)展?jié)摿Φ囊子诠I(yè)化應(yīng)用的生物分離1技術(shù)。生物大分子在雙水相上相和下相的濃度比被定義為分配系數(shù)(K =Ct/Cb 。在雙水相系統(tǒng)中有許多因素影響分配系數(shù), 包括系統(tǒng)本身的因素如系統(tǒng)組成、聚合物分子量、聚合物濃度、鹽和離子強(qiáng)度、p H 等, 以及目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)如疏水作用、電荷、分子量等, 盡管目前對(duì)聚合物溶液熱力學(xué)引起的生物大分子在兩相間不規(guī)則擴(kuò)散的機(jī)理還不清楚, 還沒有相應(yīng)的理論指導(dǎo)設(shè)計(jì)

3、特定蛋白質(zhì)和生物大分子的分配系統(tǒng), 但是利用雙水相技術(shù), 通過大量實(shí)驗(yàn)研究, 是可以獲得特定蛋白質(zhì)和生物大分子的最適宜分離的相系統(tǒng)和最優(yōu)分配的2。-淀粉酶是廣泛應(yīng)用的生物酶類, B. S ubtilis 細(xì)菌-淀粉酶是研究和應(yīng)用較多的-淀粉酶, 其分子量為48000道爾頓, PI 約為5, 最適p H 5. 3-6. 4, 在p H 4. 8-8. 5之間穩(wěn)3定。實(shí)驗(yàn)研究了-淀粉酶在聚乙二醇(PEG /磷酸鹽雙水相系統(tǒng)中的分配, 對(duì)PEG 分子量、PEG 濃度、p H 、添加NaCl 和酶濃度等因素對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響進(jìn)行了研究。1材料和方法1. 1材料PEG:分子量為400,1000,4

4、000和6000, 進(jìn)口分裝。-淀粉酶:貴州啤酒廠提供。收稿日期:2000203220基金項(xiàng)目:貴州省自然科學(xué)基金(黔基合計(jì)字198號(hào) 84貴州工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版 2000年其他試劑均為市售分析純。1. 2實(shí)驗(yàn)方法1. 2. 1PEG /磷酸鹽雙水相系統(tǒng)相圖將不同分子量的PEG 和無機(jī)鹽制成一定濃度原液, 準(zhǔn)確稱量一定量PEG 原液, 加入試管中, 然后加入無機(jī)鹽原液, 混合, 直至試管開始出現(xiàn)混濁為止, 稱量加入無機(jī)鹽量, 算出PEG 和無機(jī)鹽在系統(tǒng)中的重量百分濃度, 再加入適量水, 使體系變澄清, 計(jì)量加入的水, 并繼續(xù)加入無機(jī)鹽, 使系統(tǒng)再次變混濁, 如此反復(fù)操作, 計(jì)算達(dá)到混濁時(shí)

5、PEG 含量, 得出PEG 和磷酸鹽的雙節(jié)線相圖(圖1 。1. 2. 2雙水相萃取分配平衡實(shí)驗(yàn)相系統(tǒng)用原液冰箱放置, 20平衡后, K 2HPO 4和24, p H 。在系, , 相體積比R (R =V t/V b 用離心刻度試管測(cè)定, 上、下相樣品中分別分析酶活力, 實(shí)驗(yàn)在20條件下進(jìn)行。-淀粉酶活性的測(cè)定1. 2. 3參照文獻(xiàn)4的方法進(jìn)行。2結(jié)果與討論2. 1PEG 分子量對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響表1給出了-淀粉酶在PEG /磷酸鹽系統(tǒng)的分圖1PEG -K 3PO 4雙水相相圖配系數(shù)。分配系數(shù)受PEG 分子量影響較大, -淀粉酶的分配系數(shù)隨PEG 分子量的增加而降低, 在低PEG 時(shí), -

6、淀粉酶的分配系數(shù)高, -淀粉酶主要集中在上相; 而隨著PEG 分子量的增加, 分配系數(shù)K 值降低, 甚至-淀粉酶分配到下相。其主要原因可能是隨著PEG 分子量的增加, 其端基數(shù)目減少, 疏水性增加, 而-淀粉酶是疏水蛋白分子, 故主要向下相集中。5在PEG /葡聚糖系統(tǒng)中其他蛋白的分離純化亦有類似現(xiàn)象。由于小分子量的PEG 選擇性差, 雜蛋白質(zhì)分離能力低6, 不適合作進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)選用PEG 4000作為研究對(duì)象。-淀粉酶在PEG /磷酸鹽系統(tǒng)的分配系數(shù)表1系統(tǒng)PEG 400(13. 2%w /w 磷酸鹽(16. 8%w /w PEG 1000(11. 5%w /w 磷酸鹽(13. 4%w

7、/w PEG 4000(10%w /w 磷酸鹽(11. 5%w /w PEG 6000(7. 5%w /w 磷酸鹽(10%w /w K 20. 4217. 621. 750. 352. 2相濃度對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響相圖中的系線長(zhǎng)度是由相組成的總濃度決定的, 在臨界點(diǎn)附近, 系線長(zhǎng)度趨向于零, 上相和下相的組成相同, 因此, 分配系數(shù)應(yīng)為1。隨著PEG 和成相鹽濃度增大, 系線長(zhǎng)度增加, 上相和下相相對(duì)組成的差別就增加, 酶在兩相中的分配系數(shù)會(huì)受到極大的影響。實(shí)驗(yàn)研究了 第4期邱樹毅:液-液雙水相萃取分離-淀粉酶研究85PEG 濃度變化對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響, 所得結(jié)果見圖2。在磷酸鹽濃度

8、固定不變條件下, 改變PEG 濃度, 對(duì)-淀粉酶的分配系數(shù)影響較大。PEG 濃度增加, 有利于酶在上相的分配, 在20%(w /w PEG濃度時(shí), 分配系數(shù)達(dá)到最大, 繼續(xù)增加PEG 濃度,-淀粉酶的分配系數(shù)略有下降。實(shí)驗(yàn)對(duì)磷酸鹽濃度對(duì)-淀粉酶的分配系數(shù)亦進(jìn)行了研究, 增加磷酸鹽濃度, -淀粉酶的分配系數(shù)增加, 致; 當(dāng)鹽濃度過高時(shí), 淀, 因此一般取鹽濃度在12/。2. 3pH 對(duì)表2PEG /磷酸鹽雙水相中-淀粉酶的分配系數(shù)的影響。335. 35. 66. 17. 17. 8圖2PEG 濃度對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響表2pH 對(duì)-淀粉酶在PEG /磷酸鹽雙水相中分配系數(shù)的影響3K 0. 50

9、. 71. 21. 753. 653:體系為PEG 4000(10%w /w /磷酸鹽(11. 5%w/w 33:pH 變化通過調(diào)節(jié)H 2PO 4-和HPO 42-緩沖液實(shí)現(xiàn)隨著p H 值增加, -淀粉酶的分配系數(shù)增加, 分配系數(shù)隨p H 增加而增加的現(xiàn)象在雙水相7萃取技術(shù)分離其他蛋白質(zhì)中亦有觀察到。分配系數(shù)的改變是因?yàn)槟繕?biāo)蛋白質(zhì)電荷的變化8引起, 其原因是帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)更優(yōu)先選擇上相, 而帶正電荷的蛋白質(zhì)通常分配到下相,-淀粉酶的等電點(diǎn)PI 約為5, 在較高p H 時(shí), 蛋白質(zhì)電荷呈負(fù)電性, -淀粉酶和PEG 分子之間的作用增強(qiáng), 故-淀粉酶的分配系數(shù)增加。2. 4N aCl 濃度對(duì)-淀粉

10、酶分配系數(shù)的影響在雙水相體系中離子強(qiáng)度對(duì)目標(biāo)蛋白的分配系數(shù)有較大影響。實(shí)驗(yàn)研究了在相組成為PEG 4000(15%w /w 磷酸鹽(10%w /w 時(shí), 改變NaCl 濃度, 對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響, 所得結(jié)果見圖3。實(shí)驗(yàn)表明, 在較低NaCl 濃度時(shí), -淀粉酶的分配系數(shù)隨NaCl 濃度增加而減小, 在1%w /w NaCl 時(shí)達(dá)到最低, 繼續(xù)增加NaCl 濃度, -淀粉酶的分配系數(shù)隨NaCl 濃度增加而增加, 在7. 8%w /w 時(shí)達(dá)到最大。繼續(xù)增加NaCl 濃度, -淀粉酶的分配系數(shù)又趨下降。這是由于9Na +和Cl -在兩相分配情況不同, 從而引起兩相電位差的變化所致。2. 5酶濃

11、度對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響酶濃度在雙水相分配中是一個(gè)重要的影響因素。一般來說, 只有在蛋白質(zhì)濃度較低時(shí), 才可能出現(xiàn)純粹的分配行為, 隨著蛋白質(zhì)濃度增加, 蛋白質(zhì)的溶解度限制和出現(xiàn)飽和, 純粹的分 86貴州工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版 2000年配行為就出現(xiàn)偏差。因此在研究目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化時(shí), 不能只考慮分配系數(shù), 還要考慮回收率?；厥章识x為酶提純的質(zhì)量與總酶質(zhì)量之比Y (Y =M 酶/M 總 。表3酶濃度對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響酶濃度ku/ml1. 052. 55. 511. 2K 回收率(% 99. 899. 989. 67. 17. 2512. 517. 8表3給出了3%w /w -。,

12、 淀粉酶的分配系數(shù)近似于常數(shù), 但回收率較高, 隨著-淀粉酶酶濃圖3Nacl 濃度對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響度的增加, 分配系數(shù)K 值提高, 但酶的回收率下降。因此, 選擇合適的酶濃度在雙水相分離純化生物大分子時(shí)是重要的, 這樣既可得到較高的分配系數(shù), 又可獲得高的回收率。3結(jié)論對(duì)B. S ubtilis 細(xì)菌-淀粉酶在PEG /磷酸鹽雙水相中的分離純化進(jìn)行了研究, 認(rèn)為:-淀粉酶的分配系數(shù)在PEG /磷酸鹽雙水相中受PEG 分子量和PEG 濃度的影響, 分子量低, 分配系數(shù)高, 但低分子量則對(duì)目標(biāo)蛋白的選擇性差。PEG 濃度增加有利于酶富集到上相。p H 對(duì)-淀粉酶的分配有重要影響, 隨p H

13、 增加, -淀粉酶的分配系數(shù)增加。添加NaCl 可大大影響-淀粉酶在PEG /磷酸鹽中的分配系數(shù)。-淀粉酶的分配系數(shù)在低濃度時(shí)接近常數(shù), 隨酶濃度增加, 分配系數(shù)增加。但酶的回收率下降。參考文獻(xiàn):1P A Albertsson. Partition of cells and Macromolecules 3rd M .New Y ork :JohnWiley and S ons , 1986.2J N Baskir , T A Hatton and U W Suter. Protein Partitioning in Two -Phase Aqueous Systems J.Biotechno

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18、tions of NaCl and enzyme concetration on the partitioncoefficient K was studied.K ey w ords :aqueous two -phase ;partition ;extrace ; -amylase ; PEG;phosphate(本文責(zé)編:周曉南(上接51頁4S Limyingcharoen. Fuzzy logic based unified power slow controllers for transient stability improvement J.IEEProceedings Online ,No. 19982000:225-232.The Self -Organization Fuzzy N eutralN et w ork Control for UPFCGU Guo -chen 1,XIA Zheng -yong 2,FU Guo -geng 2(1. Hua Dian Company ,Wuhan High Voltage Institute ,Wuhan 430070,China ;2. Department of Electrical Engineering , GU T , Guiyang 550003,China Abstr