靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠腎組織TGFβ1和COⅣ表達(dá)的阻礙

1、靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠腎組織TGF-B1和CO-IV表達(dá)的阻礙毛春譜，李小毅，張紅梅，林桂芬，李偉【摘要】目的觀(guān)看轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Bl(TGF-81)及IV型膠原(C0-IV)在糖尿病大鼠腎組織中的表達(dá)及靈芝多糖干與后的阻礙。方式腹腔注射鏈胭佐菌素(STZ)誘導(dǎo)大鼠造成糖尿病模型，分組予不同劑量靈芝多糖(GLP)進(jìn)行醫(yī)治性灌胃。8周后，用免疫組化方式和RT-PCR方式檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)TGF-8、-八/的蛋白和由皿人表達(dá)。結(jié)果糖尿病組大鼠腎小球TGF-3一、CO-IV蛋白和mRXA表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高(PO；靈芝多糖各組較糖尿病組表達(dá)降低(POo結(jié)論靈芝多糖可能通過(guò)下調(diào)糖尿病大鼠腎臟中TGF-P

2、1和CO-N的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚，起到對(duì)糖尿病大鼠腎臟愛(ài)惜作用?！娟P(guān)鍵詞】靈芝多糖；糖尿病腎?。晦D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子81；N型膠原Abstract：ObjectiveToinvestigatetheexpressionsoftransforminggrowthfactor-Betal(TGF-P1)andtypeIcollagen(CO-IV)inthekidneyofdiabeticratsandtheeffectsofGanodermalucidumpolysaccharides(GLP)onsuchratmodelwasinducedbystreptozocin(60mg/kg)andth

3、eratsweredividedinto5groupsrandomlyandtreatedwithdifferentdoseweekslater,theexpressionofTGF-P1andCO-IVinkidneytissuewasdeterminedbyimmunohistochemistryandRT-PCRwithgroupC，theexpressionsofproteinandmRNATGF-B一、CO-Isignificantlyincreasedinglomeruli(P<).Theabnormalexpressionsoftheseproteins>mRNAwe

4、redramaticallyimprovedindiabeticratsbyGLPtreatment(P<).ConclusionGLPhassomerenalprotectiveeffectondiabeticrats,throughinhibitionofexcessivedepositionofglomeruliextracellularmatrixbyinhibitingtheexpressionofTGF-P1anddecreasingthesynthesisofCO-IV.Keywords：Ganodermalucidumpolysaccharides；Diabeticnep

5、hropathy；Transforminggrowthfactor-P1；TypeIVcollagen隨著人們生活水平的提高和人口的老齡化，糖尿病的發(fā)病率逐年升高。糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最重要的慢性微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病要緊的死亡緣故之一。目前,單純西藥尚不能有效阻止糖尿病腎損害的自然進(jìn)程，靈芝是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，為滋補(bǔ)強(qiáng)壯，扶正固木的珍品，它的有效成份超級(jí)豐碩，要緊有靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharides,GLP)、三葩類(lèi)化合物、靈芝酸、腺甘等，其中GLP是最有效的活性成份之一。靈芝的藥理活性大多和

6、GLP有關(guān)，其具有普遍的藥理活性1,能提高機(jī)體免疫力，提高機(jī)體耐缺氧能力，排除自由基，抗氧化2,抗輻射和降低血脂3等作用，但對(duì)DN的作用報(bào)導(dǎo)很少。本研究采納免疫組化和RT-PCR方式觀(guān)看靈芝多糖不同劑量組對(duì)糖尿病大鼠腎組織的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Bl（transforminggrowthfactor-P1,TGF-Bl）和IV型膠原（typeNcollagen,CON）的表達(dá)轉(zhuǎn)變，旨在探討GLP對(duì)DN的愛(ài)惜機(jī)制41材料與儀器清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180220g（徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。STZ（美國(guó)Sigma公司），靈芝多糖（河北保定施達(dá)科生物工程技術(shù)，批號(hào)：RM051215）。一抗別離為兔抗

7、大鼠TGF-13一、CO-IV抗體、SP-6001試劑盒及DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)）,TotalRNA提取試劑、RT-PCR試劑盒（大連寶生物）。LEICAQwin圖像處置與分析系統(tǒng)（德國(guó)），羅氏血糖儀（上海羅氏公司），日立7600型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)（日今日立公司）。2方式糖尿病模型的成立和實(shí)驗(yàn)分組將50只SD大鼠隨機(jī)分為：正常對(duì)照組（C組，n=10）,糖尿病組未醫(yī)治組（DM組，n=10）,靈芝多糖低劑量組（GLP-1組，n=10）,靈芝多糖中劑量組（GLP-2組,n=10）,靈芝多糖高劑量組（GLP-3組，n=10）,分籠飼養(yǎng)。DM組和GLP一、GLP-二、GLP-3組大鼠在禁

8、食12h后，于左下腹腔一次性注射STZ（溶于mmol/L檸檬酸緩沖液,pH）60mg/kg,72h后,尾靜脈采血測(cè)隨機(jī)血糖2mmol/L,持續(xù)3d以上作為模型納入本實(shí)驗(yàn)。C組僅予以等量檸檬酸緩沖液腹腔注射。40只大鼠經(jīng)檢測(cè)均造模成功。模型成立3d后GLP-一、GLP-二、GLP-3組別離給予靈芝多糖水溶液100,200,400mg/kg劑量進(jìn)行醫(yī)治性灌胃，C組和DM組用等體積生理鹽水灌胃。所有大鼠實(shí)驗(yàn)期間自由飲水進(jìn)食，不利用胰島素及其他降糖藥物。每隔1周測(cè)量體質(zhì)量（BodyWeight,BW）以調(diào)整用藥量。標(biāo)本搜集持續(xù)觀(guān)看8周后搜集標(biāo)本。代謝籠中搜集24h尿,離心保留于一20的冰箱待測(cè)尿微量白

9、蛋白（UAER）o稱(chēng)量體質(zhì)量后,用10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血測(cè)血糖（BG）、糖化血紅蛋白（HbAlc）、尿素氮（BUN）、血肌酎（Ser）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）0用4冰涼生理鹽水灌洗后摘除雙腎，去包膜濾紙吸干血跡后稱(chēng)重左腎，左腎重（KW）和體質(zhì)量的比值作為腎臟指數(shù)（KI）的指標(biāo)。取腎皮質(zhì)置于10%中性福爾馬林中固定，以備光鏡、免疫組織化學(xué)研究；余腎皮質(zhì)置DEPC水處置過(guò)的EP管，液氮凍透后保留于-70C的冰箱待測(cè)RT-PCRo生化指標(biāo)的測(cè)定BG采納葡萄糖氧化酶法檢測(cè)，UAER采納膠體金雙抗體夾心法檢測(cè)，HbAlc采納親和層析法檢測(cè)，BUN、Scr、TC、TG由日立7600型

10、全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。常規(guī)光鏡檢測(cè)腎組織經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水、包埋，切片厚4um,行HE染色和免疫組化。免疫組化研究采納SP二步法，石蠟切片厚4Um后常規(guī)脫蠟至水，3%H202阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，微波加熱暴露抗原，滴加一抗TGF-B1（1：100）、CO-IV（1：120）,4冰箱留宿，PBS洗片后滴加二抗，37孵育lh,DAB顯色操縱在35min,復(fù)染、脫水、透明、封片。以吸光度值（A）表示，顯色強(qiáng)度用LEICAQwin圖像處置與分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野的腎小球進(jìn)行半定量分析。RT-PCR研究由基因庫(kù)別離查得大鼠TGF-B、C0-IV及3-actin的mRN

11、A核甘酸序列，PCR引物用PrimerPremier引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)效勞合成（見(jiàn)表1）。表1大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-Bl（TGF-P1）、CO-IV及B-actin引物序列（略）取腎皮質(zhì)100mg,加液氮研碎后，用Trizol（大連寶生物工程）提取總RNA。提取的總RNA測(cè)0D值：0D260/0D280值在之間。別離取1Ug總RXA以AMV1（大連寶生物工程）為逆轉(zhuǎn)錄酶作逆轉(zhuǎn)錄反映，cDNA產(chǎn)物保留于-20。優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，使PCR擴(kuò)增在對(duì)數(shù)期內(nèi)進(jìn)行。別離進(jìn)行TGF-Bl、CO-IV與B-actin擴(kuò)增。在DA擴(kuò)增儀(EppendorfMastercylergradien

12、t)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。TGF-P1的反映參數(shù)為942min,9445s、6245s、7245s共35個(gè)循環(huán)；CO-IV的反映參數(shù)942min,9445s、6445s、7245s共35個(gè)循環(huán)；B-actin反映參數(shù)為942min»9445s、5745s、7245s共35個(gè)循環(huán)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5u1在%瓊脂糖中電泳，ImagemasterVDS成像系統(tǒng)攝影存盤(pán)后應(yīng)用運(yùn)算機(jī)圖像分析軟件(TotallabV1.01)行灰度掃描分析。以目的基因與-actin的PCR產(chǎn)物條帶灰度Volume之比作為反映目的基因mRXA水平的相對(duì)指標(biāo)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處置計(jì)量資料用土s表示，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分

13、析，組間比較采納單因素方差分析。3結(jié)果一樣情形和常規(guī)生化指標(biāo)DM組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間多飲、多尿、多食、體質(zhì)量減輕、毛色無(wú)光澤、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等病癥十分明顯。8周時(shí)DM組與C組相較，BG,KI,HbAlc,UAER顯著升高，而KW明顯下降(P&lt;),Scr,BUN,TC,TG各組不同無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GLP各組醫(yī)治后BW增加，KI降低，UAER指標(biāo)明顯改善，尤以靈芝多糖高劑量組明顯(P&lt;),但BG、HbAlc不同無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表2。表2靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠血生化指標(biāo)、腎臟指數(shù)及尿微量白蛋白的阻礙（略）一樣形態(tài)學(xué)改變DM組大鼠較C組系膜細(xì)胞顯著增生，系膜基質(zhì)增多，腎小動(dòng)脈內(nèi)膜

14、增生，管壁增厚，毛細(xì)血管腔狹小，GLP各組較DM組上述病理改變有不同程度改善。免疫組化結(jié)果免疫組化染色顯示陽(yáng)性顆粒要緊定位于腎小球和腎小管：DM組較C組比較，TGF-B、CO-N棕黃色顆粒染色強(qiáng)度明顯升高，染色面積增多（P&lt;；GLP各組較DM組相較均不同程度降低（P&lt;。結(jié)果見(jiàn)表3及圖loRT-PCR結(jié)果8周時(shí)，與C組相較，DM組TGF-BlmRXA、C0-IVmRNA表達(dá)增多；與DM組相較，GLP各組TGF-BlmRXA.CO-JVmRXA表達(dá)減少（P&lt;，見(jiàn)表3及圖2。表3靈芝多糖對(duì)各組糖尿病大鼠TGF-P1和CO-IV表達(dá)的阻礙（略）4討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果

15、說(shuō)明STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，8周后大鼠顯現(xiàn)毛色無(wú)光澤、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等病癥，BG、KI、HbAlc、UAER顯著升高，病理上腎小球系膜細(xì)胞顯著增生，系膜基質(zhì)增多，腎小動(dòng)脈內(nèi)膜增生，管壁增厚，毛細(xì)血管腔狹小，提示已顯現(xiàn)DN初期表現(xiàn)。GLP給藥8周后糖尿病大鼠BW增加、KI降低，UAER指標(biāo)明顯改善，腎臟病理?yè)p害取得不同程度的改善，呈現(xiàn)劑量依托趨勢(shì)，尤以靈芝多糖高劑量組明顯。但對(duì)BUN、Scr、TC、TG無(wú)阻礙，這可能與糖尿病大鼠模型時(shí)刻較短，尚未顯現(xiàn)全面的代謝紊亂有關(guān)。【參考文獻(xiàn)】1林志彬.靈芝的藥理作用A.林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究,第2版M.北京:北京醫(yī)科大學(xué)出版社,2001：219.2You

16、YH,LineffectsofGanodermalucidumpolysaccharidespeptideoninjuryofmacrophagesinducedbyreactiveoxygenspeciesj.ActaPharmacolSin,2002,23:787.3陳偉強(qiáng)，羅少洪，李紅枝，等.靈芝多糖對(duì)高脂血癥大鼠血脂及脂質(zhì)過(guò)氧化的阻礙J.中國(guó)中藥雜志，2005,30(17):1358.4ZeisbergM,Ericksen叫HamanoY,etexpressionoftypeIVcollagenisofomlsinratglomerularendothelialandmesangial

17、cellsj.BioehenBiophysResCommun,2002,295(2):401.5WangSN,Ramundfactoruhrafihrationinexperimentaldiabeticnephropathycontributestointerstitialfibrosisj.AmJPhysiol(Renalphysiol),2000,278:554.6 OkudaofTGF-betaintheprogressionofrenalfibrosisJ.ContribNephrol,2003,139:44.7DanielsMC,McClainDA,Crookregulationo

18、ftransforminggrowthfactorbetalbyglucose:investigationintotheroleofthehexosaminebiosynthesispathwayJ.AmJMedSci,2000,319(3):138.8PantsulaiaofTGF-betainpathogenesisofdiabeticnephropathyJ.GeorgianMedNews,2006,131:13.9ChenS,JimB,ZiyadehFN,etnephmpathyandtransforminggrowthfactor-beta:transformingourviewofglomemlosclerosisandfibrosisbuil