復(fù)方玉泉丸保護(hù)DNA損傷有效部位研究

1、復(fù)方玉泉丸保護(hù)DNA損傷有效部位研究 作者：吳鳳琪，陳茂勇，李磊，柳艷 吳倩，張良【摘要】 目的探討復(fù)方玉泉丸保護(hù)DNA損傷活性部位及作用機(jī)制。方法用不同極性的提取劑熱回流序貫提取復(fù)方玉泉丸有效成分。在二苯代苦味酰肼自由基（DPPH）和OH自由基模型上探討各提取物清除能力，并用CuSO4-Phen-Vit C-H2O2-DNA 化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定DNA損傷保護(hù)作用。結(jié)果各提取部位均能使DPPH自由基體系在517 nm處吸光度明顯降低，且在30 min內(nèi)持續(xù)下降。濃度為0.625 mg/ml時(shí)，70乙醇提取物對(duì)DPPH的清除率為93.6，比同濃度下甲醇、丙酮提取物清除能力分別高48.1和159.3

2、。無(wú)DNA發(fā)光反應(yīng)體系中，乙醇提取物濃度達(dá)0.333，0.5，1 mg/ml時(shí)，其發(fā)光強(qiáng)度分別降低33.8，54.3和74.5。有DNA存在時(shí)，70%乙醇、丙酮和甲醇提取部位在濃度為0.625 mg/ml時(shí)，對(duì)DNA損傷抑制率分別為84.3，31.5和51.5，受損時(shí)間分別延長(zhǎng)17.4，2.3 min和12.1 min。結(jié)論70%乙醇提取物能有效降低DNA損傷程度，并使DNA氧化損傷延遲，其機(jī)制與清除DPPH及OH自由基活性有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 復(fù)方玉泉丸 DNA損傷 有效部位 化學(xué)發(fā)光 糖尿病是一種常見(jiàn)的多病因、有遺傳傾向的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，其發(fā)病率正在逐年增長(zhǎng)。經(jīng)典的糖尿病并發(fā)癥的多元醇

3、途徑、糖基化終末產(chǎn)物途徑、蛋白激酶C途徑和氨基己糖途徑，均是高糖環(huán)境下，線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過(guò)多導(dǎo)致的結(jié)果1。由于自由基具有很高的反應(yīng)活性，它將在分子、細(xì)胞乃至器官水平給機(jī)體造成損傷，誘導(dǎo)多種并發(fā)癥25。因此，在糖尿病、尤其是并發(fā)癥防治中，重視體內(nèi)自由基的清除和阻止自由基引起的損傷具有十分重要的意義。 玉泉丸是我國(guó)治療糖尿病的中藥驗(yàn)方，具有生津止渴、清熱除煩、養(yǎng)陰滋腎、益氣和中之功能，特別是在糖尿病并發(fā)癥防治方面療效確切69。但是，長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)玉泉丸的研究和開(kāi)發(fā)較少，其降血糖作用及具有防治糖尿病并發(fā)癥的物質(zhì)基礎(chǔ)不清、標(biāo)準(zhǔn)不嚴(yán)、劑型單一。本研究針對(duì)糖尿病并發(fā)癥的危害，以清除DPPH自由基活

4、性及防止OH自由基引起的DNA損傷為指標(biāo)，初步篩選玉泉丸藥效作用的有效部位，為糖尿病并發(fā)癥的防治和玉泉丸新劑型的開(kāi)發(fā)提供參考。1 器材1.1 儀器德國(guó)Orion微孔板發(fā)光檢測(cè)儀；DU600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；北京長(zhǎng)風(fēng)8002型電熱恒溫水箱；LDZ5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。1.2 材料二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)、抗壞血酸(AsA)、小牛胸腺DNA和鄰-菲羅啉(Phen)購(gòu)自Sigma公司；二丁基羥基甲苯(BHT)購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司(化學(xué)純)。硫酸銅、過(guò)氧化氫、醋酸、乙醇、甲醇、石油醚、乙醚、丙酮、鹽酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。復(fù)方玉泉丸原料由南京大中華藥店購(gòu)買。

5、2 方法2.1 玉泉丸制備與提取2.2 DPPH自由基清除活性稱取5.9 mg DPPH自由基，用乙醇溶解后定容到25 ml，此為儲(chǔ)備液。應(yīng)用前稀釋10倍，使其濃度為610-5mol/L。 向1 ml 的610-5mol/ L DPPH 溶液中加入0.1 ml試樣(空白用等量無(wú)水乙醇代替)，總體積為1.1 ml 。搖勻后，測(cè)定DPPH 混合液在517 nm 處的吸光度（OD）值，每2分鐘測(cè)定1次，持續(xù)測(cè)定30 min。用1 ml 乙醇與0.1 ml 試樣提取液調(diào)儀器零點(diǎn)，以扣除試樣本身顏色的影響。取其第30 min時(shí)的吸光度計(jì)算其清除率： 清除率(%)=(A0-A樣)/A0100% 其中A樣、

6、A0分別為DPPH與樣品和無(wú)水乙醇在30 min時(shí)的吸光度。由于DPPH在光照下吸光度會(huì)下降，操作中應(yīng)注意避光，保證每次DPPH反應(yīng)液的吸光度基本一致。2.3 OH自由基清除及DNA損傷保護(hù)在1 ml離心管中加入230 l醋酸緩沖液(pH=5.5)、100 l待測(cè)液(空白用100 l緩沖液代替)，30 l硫酸銅(50 000 mol/L)、200 l Vit C (28 000 mol/L)、100 l Phen (35 000 mol/L)、140 l濃度為750 mol/L DNA (空白用240 l緩沖液代替)，最后加入200 l 30%H2O2啟動(dòng)反應(yīng)。吸取混合溶液200 l加入微孔板

7、中，測(cè)定其發(fā)光強(qiáng)度，每2 min測(cè)定1次并持續(xù)1 h。以其峰高最大值計(jì)算抑制率： 抑制率(%)=(CP0-CP樣)/CP0100% 其中CP0 、CP樣分別為空白和加樣品后的發(fā)光度最大值。 本體系除DNA與樣品外，所有溶液均用pH=5.5的緩沖液配制，目的是為了保證反應(yīng)體系的pH為最佳(pH 5.5)。加入H2O2后要盡快測(cè)定其發(fā)光度值，以防錯(cuò)過(guò)最大發(fā)光強(qiáng)度時(shí)間。3 結(jié)果3.1 玉泉丸不同極性部位與DPPH自由基的反應(yīng)DPPH自由基分析法是一種研究天然有機(jī)化學(xué)成分自由基清除能力，反映抗氧化損傷的簡(jiǎn)便方法10。用6種不同極性的提取溶劑序列提取玉泉丸中的化學(xué)成分，然后在DPPH模型中進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果

8、表明，6種提取部位的成分均能使DPPH自由基在517 nm處的吸光度降低。 玉泉丸不同極性部位的化學(xué)成分與DPPH自由基反應(yīng)后，其吸光度值隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)曲線不同，同一提取部位在不同濃度下反應(yīng)曲線也有差異。圖1給出了70乙醇提取部位引起DPPH反應(yīng)體系吸光度值隨時(shí)間的變化關(guān)系。DPPH與樣品反應(yīng)后，其吸光度明顯下降且隨濃度的增大反應(yīng)曲線呈明顯的下滑趨勢(shì)，表明該樣品與DPPH反應(yīng)能力較強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間較久，清除自由基的能力較強(qiáng)，并有一個(gè)平衡穩(wěn)定過(guò)程。通過(guò)考察每個(gè)樣品與DPPH的反應(yīng)曲線可明確其清除DPPH自由基的能力及時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。 不同極性部位物質(zhì)均具有清除DPPH活性，但清除作用強(qiáng)弱不同（見(jiàn)表

9、1）。與石油醚提取部位相比，相同濃度的乙醚提取物具有更高強(qiáng)度的清除率。在0.625 mg/ml濃度下，70乙醇提取物清除率（93.6）最高，比同濃度下甲醇、丙酮提取物清除DPPH能力分別高出48.1和159.3。最后的殘?jiān)盟崛『?，其提取物的自由基清除能力仍然比石油醚和乙醚提取部位?qiáng)。分析可知，同一種提取物的不同濃度對(duì)DPPH自由基清除率也有較大差異。隨著提取物濃度的增大，自由基清除率增高。以乙醇提取物為例，濃度為0.312 mg/ml時(shí)對(duì)DPPH的清除率（83.1）比濃度0.156 mg/ml時(shí)增加70.3。推測(cè)復(fù)方玉泉丸中存在的清除DPPH自由基活性的物質(zhì)可能是中等極性物質(zhì)，存在于中等極

10、性溶劑提取部位中。3.2 玉泉丸不同極性部位對(duì)羥基自由基的清除和對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用CuSO4-Phen-Vit C-H2O2-DNA 化學(xué)發(fā)光體系中，Phen 在金屬離子的催化下與H2O2 作用,生成OH自由基, 產(chǎn)生最大發(fā)射在445450 nm 范圍內(nèi)的化學(xué)發(fā)光。OH 自由基引起DNA 損傷，能產(chǎn)生一延遲于Phen 本身氧化發(fā)光信號(hào)的慢化學(xué)發(fā)光。最大發(fā)光波長(zhǎng)范圍在380420 nm，此為鳥(niǎo)嘌呤的特征反應(yīng)。在有抗氧化劑或自由基清除劑存在時(shí)，發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線會(huì)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為發(fā)光峰值下降(抑制效應(yīng))或發(fā)光峰位的后移(延遲效應(yīng))。 圖2反映了70%乙醇提取物致無(wú)DNA發(fā)光體系發(fā)生強(qiáng)度和峰值發(fā)

11、光時(shí)間的變化。在沒(méi)有加入玉泉丸提取物時(shí)，CuSO4-Phen-Vit C-H2O2發(fā)光體系在9 min時(shí)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大值。在反應(yīng)體系中加入70乙醇提取物使其濃度達(dá)到0.333 mg/ml，0.5 mg/ml，1 mg/ml時(shí)，其發(fā)光強(qiáng)度分別降低了33.8，54.3和74.5，發(fā)光峰值出現(xiàn)時(shí)間分別延長(zhǎng)了2，6 min和19 min。該提取物能大幅度降低OH反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度，并隨著濃度的升高，對(duì)體系OH發(fā)光效應(yīng)淬滅的強(qiáng)度越大。說(shuō)明復(fù)方玉泉丸70%乙醇提取物部位具有顯著地清除該發(fā)光體系中產(chǎn)生的OH自由基能力，并呈現(xiàn)一定的濃度相關(guān)性。 在有DNA存在的CuSO4-Phen-Vit C-H2O2-D

12、NA 反應(yīng)體系中，不同部位的玉泉丸提取物測(cè)試液抑制DNA損傷的效果見(jiàn)表1。同DPPH清除能力相似，10 mg/ml石油醚和乙醚提取部位對(duì)DNA損傷的抑制率較低。70%乙醇、丙酮和甲醇提取部位對(duì)DNA損傷的抑制率較高。當(dāng)濃度達(dá)0.625 mg/ml時(shí)，乙醇提取物對(duì)DNA損傷的抑制率為84.3，并使DNA受損時(shí)間延遲了17.4 min。綜合分析表1可知，6種提取部位均有一定的抑制DNA損傷、并延緩受損時(shí)間的作用，但其強(qiáng)度因不同的提取部位和作用濃度而不同。相比較而言，作為抗氧化劑，70%乙醇提取物的作用強(qiáng)于其它提取物。表1 不同部位樣品清除自由基能力和抑制DNA損傷效果（略）4 結(jié)論 復(fù)方玉泉丸提取

13、物對(duì)自由基導(dǎo)致的DNA損傷有保護(hù)作用，是天然的抗氧化劑和自由基清除劑，能有效清除DPPH自由基和羥基自由基，抑制自由基對(duì)DNA的損傷，并延緩其受損時(shí)間。其中70%乙醇提取物的清除能力明顯高于其它幾種提取物。相對(duì)于其它提取溶劑而言，乙醇對(duì)人體毒害較小，且提取制備程序相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低。因此，乙醇提取物具有良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。至于各種提取部位在清除活性氧和抗氧化作用中的貢獻(xiàn)和機(jī)理有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。本研究從自由基生物學(xué)角度為復(fù)方玉泉丸在食品、醫(yī)藥和保健食品等開(kāi)發(fā)利用方面提供了重要依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Tania Bose, Abhay Sankar Chakraborti. Fructose-in

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