放線菌抗生素的發(fā)酵及目的產(chǎn)物的提取試驗(yàn)報(bào)告要點(diǎn)

1、放線菌抗生素的發(fā)酵及目的產(chǎn)物的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 、熟悉掌握土壤中分離抗生素及培養(yǎng)方法2、了解和掌握種子制備和搖瓶發(fā)酵技術(shù)和方法3、了解抗生素發(fā)酵的一般規(guī)律和代謝調(diào)控理論4、了解小型發(fā)酵罐的基本結(jié)構(gòu)5、熟悉掌握小型發(fā)酵罐的使用方法和保養(yǎng)6掌握抗生素生物效價(jià)測(cè)定的原理和方法；7.掌握管碟法測(cè)定抗生素生物效價(jià)相關(guān)的操作方法。8掌握放線菌次級(jí)代謝物的初步純化及牛津杯實(shí)驗(yàn)的基本原理和操作技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理 發(fā)酵罐是進(jìn)行液體發(fā)酵的特殊設(shè)備。生產(chǎn)上使用的發(fā)酵罐容積 大，均用鋼板或不銹鋼板制成；供實(shí)驗(yàn)室使用的小型發(fā)酵罐，其容積 可從約IL至數(shù)百升或稍大些。一般來(lái)說(shuō)，5L以下是用耐壓玻璃制作 罐體，5L以上用不

2、銹鋼板或鋼板制作罐體。發(fā)酵罐配備有控制器和 各種電極，可以自動(dòng)地調(diào)控試驗(yàn)所需要的培養(yǎng)條件，是微生物學(xué)、遺 傳工程、醫(yī)藥工業(yè)等科學(xué)研究所必需的設(shè)備。 抗生素(antibiotics )是由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線 菌屬)或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性 的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。現(xiàn)臨床常用的抗生素有轉(zhuǎn)基因工程菌培養(yǎng)液液中提取物以及用化學(xué)方法合成或半合成的化合物。 放線菌發(fā)酵結(jié)束后，次級(jí)代謝物可能與菌體結(jié)合，工業(yè)上常采 用草酸或磷酸等酸化劑處理，釋放與菌體結(jié)合的次級(jí)代謝物，并采用 加熱發(fā)酵液70 C, 2 min使蛋白凝固，所得酸性濾液，在

3、經(jīng)堿處理， 進(jìn)一步去除蛋白?？股氐男r(jià)常采用微生物學(xué)方法測(cè)定，它是利用抗生素對(duì)特定 的微生物具有抗菌活性的原理來(lái)測(cè)定抗生素效價(jià)的方法，如管碟法。 管碟法是目前抗生素效價(jià)測(cè)定的國(guó)際通用方法，我國(guó)藥典也采用此 法。管碟法是根據(jù)抗生素在瓊脂平板培養(yǎng)基中的擴(kuò)散滲透作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品和檢品兩者對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌圈大小來(lái)測(cè)定供試品的效價(jià)。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性試驗(yàn)菌的瓊脂平板上放置小鋼管（內(nèi)徑6.0 士 0mm，外徑8.0 士 0mm，高10士 0. lmm ）,管內(nèi)放 人標(biāo)準(zhǔn)品和檢品的溶液，經(jīng)1618小時(shí)恒溫培養(yǎng)，當(dāng)抗生素在菌層培 養(yǎng)基中擴(kuò)散時(shí)，會(huì)形成抗生素濃度由高到低的自然梯度， 即擴(kuò)散中心

4、濃度高而邊緣濃度低。因此，當(dāng)抗生素濃度達(dá)到或高于MIC （最低抑制濃度）時(shí)，試驗(yàn)菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明的無(wú)菌生長(zhǎng) 的區(qū)域，常呈圓形，稱為抑菌圈。根據(jù)擴(kuò)散定律的推導(dǎo)，抗生素總量 的對(duì)數(shù)值與抑菌圈直徑的平方成線性關(guān)系， 比較抗生素標(biāo)準(zhǔn)品與檢品 的抑菌圈大小，可計(jì)算出抗生素的效價(jià)。常用的管碟法有：一劑量法、二劑量法、三劑量法。后二法已經(jīng) 列入藥典。二劑量法系將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品各稀釋成一定濃度比例(2:1或4:1 )的兩種溶液，在同一平板上比較其抗藥活性，再根 據(jù)抗生素濃度對(duì)數(shù)和抑菌圈直徑成直線關(guān)系的原理來(lái)計(jì)算供試品效 價(jià)。取含菌層的雙層平板培養(yǎng)基，每個(gè)平板表面放置4個(gè)小鋼管，管內(nèi)分別

5、放入供試品高、低劑量和標(biāo)準(zhǔn)品高、低劑量溶液。先測(cè)量出四 點(diǎn)的抑菌圈直徑，按下列公式計(jì)算出檢品的效價(jià)。(1) 求出 W和 V： W=(SH+UH- (SL+UL ( 式 2.10-1)V=( UH+U)-(SH+SL (式 2.10-2)式中：UH供試品高劑量之抑菌圈直徑;UL:供試品低劑量之抑菌圈直徑;SH:標(biāo)準(zhǔn)品高劑量之抑菌圈直徑;SL:標(biāo)準(zhǔn)品低劑量之抑菌圈直徑;(2) 求出 B :0 =D antilog(IV/W)( 式 2.10-3)式中:0 :供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)比;:標(biāo)準(zhǔn)品高劑量與供試品高劑量之比，一般為1:高低劑量之比的對(duì)數(shù)，即log2或log4。PrPrAr X 0(式 2.1

6、0-4)Ar式中:Pr:供試品實(shí)際單位數(shù);:供試品標(biāo)示量或估計(jì)單位 甲醛滴定法測(cè)定氨基氮含量：水溶液中的氨基酸為兩性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。用甲醛處理氨基酸 ，甲醛與氨基結(jié)合，可形成羥甲基衍生物，使NH3+上的H+游離出來(lái)，這樣就可用堿滴定NH3+放出的H+，從而計(jì)算出氨基氮含量。如樣品中只含 有某一種已知氨基酸，由甲醛滴定的結(jié)果即可算出氨基氮的含量。如果樣品是多種氨基酸的混合物（如蛋白質(zhì)水解物），則滴定結(jié)果不能 作為氨基酸的定量依據(jù)。甲醛滴定法常用于測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度，隨著水解程度的增加，滴定值增加，當(dāng)水解完全后，滴定值保持恒定。甲基紅的變色范圍是PH4.46.2,意思是說(shuō)

7、：1. 其pH值在4.46.2區(qū)間時(shí)，呈橙色，2. 其pH值三4.4時(shí)，呈紅色，因是靠近酸性強(qiáng)的一邊時(shí)的顏色， 故又稱之為酸色。3. 其pH值三6.2時(shí)，呈黃色，因是靠近堿性強(qiáng)的一邊時(shí)的顏色， 故又稱之為堿色二、儀器與材料（一）培養(yǎng)基咼氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20.0g NaCI 0.5g KNO3 1.0gK 2HPO0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO 4.7H2O 0.01g蒸餾水 1000ml , PH 7.4 ,發(fā)酵瓶培養(yǎng)基：淀粉3%,葡萄糖2%,黃豆餅粉2.5%,蛋白胨0.5% ,酵母粉 0.5%, MgSO4 0.1%,（NH4）2SO4 0.3%, KH2PO4

8、, 0.03%,CaCQ 0.4%, PH 6.0。黃豆餅粉4g,淀粉10g,酵母粉0.25 g ,蛋白胨1.5g,MgS04 0.025 g, CaCO? 0.4g, (NH4)2SO4 0.3 g,a 淀粉酶(105u/ml)0.01ml.100mlPH7.4-7.6可溶性淀粉 2.0g, NaCl 0.05g, KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05g,MgSO4.7H2O 0.05g, FeSO4.7H2O 0.001g,加蒸餾水至100ml, PH 7.4,牛肉膏蛋白胨牛肉膏(5.0g),蛋白胨(10.0g), NaCl (5g),蒸餾水(1000mL), pH 7.27.4發(fā)

9、酵罐培養(yǎng)基(2L):黃豆餅粉80g淀粉200g酵母粉5 g蛋白胨30gMgSO40.5 gCaCO38g(NH4) 2SO6 g?-淀粉酶（105u/ml)0.2ml（二）流加補(bǔ)料碳源：葡萄糖（10% 300ml,控制 1% 2000*1%=20g,200ml氮源：硫酸銨（10% 250ml,控制16%調(diào) PH值：0.1MHCI 0.1MNaOH（三）分析指標(biāo)及方法所用試劑及溶液測(cè)殘?zhí)?DNS法1. 3，5二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）：將6.3g的3, 5二硝基水楊酸和2molNaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸鉀鈉的熱 水溶液中，再加5g結(jié)晶苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸

10、餾水定容到1000ml2. 1.0mg/ml葡萄糖溶液：稱取1g葡萄糖，加蒸餾水定容到1L。3. 6mol/l氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉24g,加蒸餾水定容到100ml。4. 6mol/l的鹽酸：取濃鹽酸49.68ml，加蒸餾水定容到100ml。測(cè)殘氮的方法-甲醛法1. 甲基紅：0.1g甲基紅，用95臨醇定容100ml。2. 0.3mol/LHCL:取濃鹽酸2.48ml,加蒸餾水定容到100ml。3. 0.02858mol/L NaOH :稱 0.11432g,定容 100ml。4. 1% 酚酞指示劑：稱取1g酚酞指示劑粉末。溶于100ml 95% 乙醇溶液中。5. 95% 乙醇：取乙醇96m

11、l,倒入100ml容量瓶中定容值100ml。6. 18%中性甲醛：取48ml 38%的甲醛加入小于100ml容量瓶，往溶液中加兩滴酚酞用氫氧化鈉滴定剛好變紅，定容到100ml。（四）器材玻璃試管、試管架、吸管（1ml，2ml，10ml）、吸耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶（250 ml，500ml）、量筒（250ml，500ml，1000ml）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、振蕩培養(yǎng) 箱、恒溫箱、臺(tái)秤、5L-發(fā)酵罐，無(wú)菌室、培養(yǎng)皿（直徑 9 cm）、陶 瓦蓋、鋼管、鋼管放置器、恒溫培養(yǎng)室、滅菌刻度吸管、玻璃容器、稱量管、毛細(xì)滴管、天平、直尺或游標(biāo)卡尺、超凈工作臺(tái)，無(wú)菌培養(yǎng)皿，酒

12、精燈，牛津杯，鑷子，移液器等等（五）生物效價(jià)測(cè)定所需材料6（1）菌種:大腸桿菌（Escherichia coli），菌液濃度約為10個(gè)/mL。菌株保存的時(shí)間過(guò)久，影響其對(duì)抗生素的敏感度，導(dǎo)致抑菌圈變大、 模糊或者出現(xiàn)雙圈。如若菌株不純，也會(huì)造成這樣的結(jié)果。因此，菌 液在使用一段時(shí)間后，可以重新配制純化或者減小原來(lái)菌液在使用中 的稀釋倍數(shù)。（2）抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品：頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)品和供試品。（3）培養(yǎng)基：效價(jià)檢定用培養(yǎng)基1號(hào)。（4）無(wú)菌緩沖液：稱取磷酸氫二鉀5.59g，磷酸二氫鉀0.41g，加水1000mL即為pH 7.8的磷酸鹽緩沖液。制備緩沖液的試劑應(yīng)為分析 純，配制后的緩沖液應(yīng)澄清，分裝于

13、玻璃容器內(nèi)，經(jīng)121 C蒸氣滅菌30 min備用。（5）草酸，10 M NaOH四、實(shí)驗(yàn)步驟篩選高產(chǎn)放線菌從土壤里篩選出高產(chǎn)放線菌，于斜面培養(yǎng)基中保藏接種在超凈工作臺(tái)上，將長(zhǎng)好的斜面孢子用無(wú)菌接種針挖塊約0.5 X1cm2，接種于滅過(guò)菌的高氏一號(hào)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)將接種好的種子搖瓶于28 C恒溫室搖床上，轉(zhuǎn)速為200r/min ,培養(yǎng)48小時(shí)左右。實(shí)罐滅菌1 、將冷凝水管路斷開，拔下電極，打開罐蓋，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝 入發(fā)酵罐及補(bǔ)料瓶，易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基盡量不要超過(guò)兩升。2 、連接管路：取樣管路連接，補(bǔ)料管路連接；空氣過(guò)濾器用硅 膠管與罐蓋空氣管連接，并用彈簧夾夾緊；排氣口與過(guò)濾器用硅膠管 連接；安裝

14、溫度電極、pH電極、溶氧電極，pH電極用們帽蓋緊電極 上端口，溶氧 電極用鋁鉑紙包裹電極上端口，防止受潮。蓋緊其它 罐蓋接口。3、提起玻璃罐體及補(bǔ)料瓶放入滅菌鍋，蓋好牛皮紙，蓋好鍋蓋， 確定發(fā)酵溫度及時(shí)間。4、滅菌結(jié)束后，盡快將罐放回原位并盡快通入空氣。發(fā)酵操作1 、將滅菌后的罐體放回原位，連接冷凝水管路，通入冷凝水， 連接通氣管路，調(diào)整通氣量至 35L/min。2 、將溫度電極、pH電極、溶氧電極與控制器連接。3 、補(bǔ)料管連接：打開補(bǔ)料蠕動(dòng)泵防護(hù)蓋，搬開進(jìn)出口處的白色 管夾，將硅膠管嵌入入口處的管夾并夾緊，用手轉(zhuǎn)動(dòng)泵頭，將硅膠管 沿凹槽安裝直至出口處，開手動(dòng)開關(guān)約十秒后夾緊出口處管夾， 關(guān)手

15、 動(dòng)開關(guān)；將酒精棉球放在罐蓋補(bǔ)料口內(nèi)，將針頭插入并穿透密封蓋； 打開蠕動(dòng)泵手動(dòng)開關(guān)，使輸液管中充滿料液，置于自動(dòng)狀態(tài)。接種將培養(yǎng)48小時(shí)的搖瓶種子接種于發(fā)酵罐中，使用接種圈放置酒精 棉點(diǎn)燃，進(jìn)行無(wú)菌接種，接入100ml種子。接種后立即進(jìn)行第一次取 樣。發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程的測(cè)定：發(fā)酵液狀態(tài)觀察：粘度、顏色、氣味、菌絲形態(tài)發(fā)酵中殘?zhí)堑臏y(cè)定-DNS法：1取1.0mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按下表加入試劑。沸水浴加熱5min,冷水冷卻定容至25ml搖勻，在520nm按波長(zhǎng)測(cè)吸光度編號(hào)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液丿/ml水 /ml溶液糖含量/mgDNS試劑/ml00201.510.21.80.21.520.41.60.4

16、1.530.61.40.61.540.81.20.81.551.01.01.01.561.20.81.21.571.40.61.41.581.60.41.61.52取發(fā)酵液0.5ml置于50ml容量瓶中，加6mol/l的鹽酸溶液2ml，在沸水溶液中加熱15min水解，冷水冷卻后及時(shí)6mol/l氫氧化 鈉溶液1.8ml，并定容到50ml的總糖水解液。3取總糖水解液2ml于25ml比色管中，加入 DNS試劑1.5ml 沸水浴中加熱5min，冷水冷卻后定容至25ml搖勻，以空白作對(duì)照在 520nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度。氨基酸氮的測(cè)定：甲醛法（陳鈞鳴和徐玲娣，1991）。取2ml發(fā) 酵液濾液于三角瓶?jī)?nèi)，加蒸餾

17、水10ml,甲基紅指示劑2滴,用0.3MHCI 調(diào)節(jié)pH至溶液呈紅色，再用0.02858MNaOI溶液調(diào)pH至溶液呈橙色 （中性）,加18%性甲醛溶液4ml,搖勻,靜置10min,加1%酚酞指示劑 8滴，用0.02858NNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。氨基氮的計(jì)算 公式為：氨基氮（mg/IOOml）=滴定體積*20。放線菌次級(jí)代謝物的初步純化及牛津杯實(shí)驗(yàn)的1 、配制培養(yǎng)基咼壓火菌。2 、倒平板。3 、涂布指示菌。4 、以無(wú)菌操作在培養(yǎng)基表面直接垂直放上牛津杯，輕輕加壓， 使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙。5 、收集發(fā)酵液，緩緩加入草酸將發(fā)酵液酸化至pH 1.4- 3.0左右，70 C, 2 min

18、 , 以 10000 rpm 離心 20 min。6 、取上清加入水稀釋20%r右，在4C,用10 M NaOH中和至 pH6.4- 6.8 。7 、吸取中和液100卩L加入牛津杯中，37C培養(yǎng)16hr，觀察效價(jià)測(cè)定1. 稱量稱量前，將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品從冰箱取出， 使與室溫平衡， 供試品應(yīng)放于干燥器內(nèi)至少 30 min方可稱取。供試品與標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用 同一天平；吸濕性較強(qiáng)的抗生素在稱量前 12小時(shí)更換天平內(nèi)干燥 劑。標(biāo)準(zhǔn)品稱量不可少于20 mg,取樣后立即將稱量瓶或適宜的容器 及被稱物蓋好，以免吸水稱樣量的計(jì)算 W=V*C/P （式2.10-4）式中：W需稱取標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的重量（mV:溶解標(biāo)

19、準(zhǔn)品或供試品制成濃溶液時(shí)用容量瓶的體積量（mLC:標(biāo)準(zhǔn)品或供試品高劑量的濃度（U/mL, a g/mL）P:標(biāo)準(zhǔn)品的純度或供試品的估計(jì)效價(jià)（U/mg, a g/mg）2. 稀釋從冰箱中取出的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，必須先在室溫放置，使其溫度達(dá)到 室溫后，方可量取。標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液的稀釋應(yīng)采用容量瓶，每步 稀釋，取樣量不得少于 2 mL,稀釋步驟一般不超過(guò) 3步。每次吸取 溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管 23次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度 開始放溶液。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與供試品用的緩沖液應(yīng)同一批和同瓶，（預(yù) 計(jì)不夠時(shí)，應(yīng)事先與另一瓶混勻后再用），以免因pH或濃度不同影響 預(yù)定結(jié)果。稀釋時(shí)，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶 壁的液體完全流下，再準(zhǔn)確補(bǔ)加至刻度。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品高低濃度之 比為2:1或4:1，但所選用的濃度必須在劑量反應(yīng)直線范圍內(nèi)。3. 雙碟制備在超凈工作臺(tái)上，用滅菌大口吸管（20 mL）,取已融化的培養(yǎng) 基20