血小板聚集儀中文操作手冊(cè)

1、血小板聚集儀中文操作手冊(cè)血小板聚集儀中文操作手冊(cè)第一章 原理和功能介紹、綜述血管損傷后，血小板黏附于血血管的損傷處，聚集、合成前列腺素，釋放5-羥色氨、ADP、ATPo前列腺素的合成與釋放產(chǎn)物會(huì)引起更進(jìn)一步的聚集。同時(shí)血漿凝固開始、凝血酶產(chǎn)生、纖維蛋白形成和血小板栓子堵塞損傷的血管。由于細(xì)胞膜糖蛋白、細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)顆粒、血小板酶血漿凝血因子缺乏常引起過量出血，常 見的臨床 表現(xiàn)為：鼻血、損傷、擦傷失血過多。另外，外科手術(shù)的患者盡管經(jīng)常存在血小板功能障礙，但經(jīng)常 到出血不止或術(shù)后出血不止才能發(fā)現(xiàn)。在1962年，Born描述了用ADP誘導(dǎo)的血小板聚集并改革用比濁計(jì)測(cè)量富血小板血漿的聚集過 程。這種改變

2、包括：預(yù)溫37度，攪拌和用記錄筆記錄一定時(shí)間內(nèi)透過光的變化。在1977年，F(xiàn)ein man設(shè)計(jì)了一臺(tái)儀器，同時(shí)測(cè)量血小板聚集和 ATP釋放。這臺(tái)儀器利用 紫外光測(cè)量聚集，在聚集光路的的右側(cè)放置敏感的光度計(jì)，通過熒光的產(chǎn)生測(cè)量ATP的釋放。在1980年，Cardinal和Flower設(shè)計(jì)了電阻法測(cè)量全血中的聚集，非常小的電流通過兩個(gè) 電極， 當(dāng)電極剛與血接觸時(shí)，在其表面會(huì)附著一層血小板，當(dāng)聚集劑加入后，更多的血小板 會(huì)聚集在其表 面，引起電阻增加。電阻法的測(cè)量又構(gòu)成了一臺(tái)全血熒光聚集儀。在1984年，Wojenman和Slier設(shè)計(jì)了一種快速的方法去進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的操作。這種方 法就是 同時(shí)測(cè)量

3、聚集和ATP的釋放，用血量為5ml, 30分鐘內(nèi)完成檢測(cè)。這種方法避免富血 小板血漿的準(zhǔn) 備時(shí)間。在1985年johnson創(chuàng)造了一種方法去檢測(cè)洗滌血小板的鈣流，這種方法有利于研究鈣離 子在血 小板聚集中的作用。血小板聚集儀的功能-一定量血小板的功能缺陷:粘附缺陷von Willebrand disease一定量或定性血漿內(nèi) vWF 因子的缺乏，Bernard-Soulier Syndrome-伯白-蘇 綜合癥（BBS）亦稱巨血小板綜合癥缺乏血小板膜糖蛋白lb （GPIb）聚集缺陷Afibri nogen emia-纖維蛋白原缺乏血癥Glanzmann s Thrombasthenia格茨曼血

4、小板功能不全缺乏膜糖蛋白Hb-llla血小板顆粒釋放缺陷儲(chǔ)存池缺陷（SPD）-致密顆粒內(nèi)容物缺陷Gray platelet syn drome-a顆粒內(nèi)容物缺陷PF4、vWF、血小板反應(yīng)素、促血小板生長(zhǎng)因子PDGF）花生四稀酸代謝異常血小板膜花生四稀酸釋放缺陷 環(huán)氧化酶缺陷 血栓素酶合成缺陷正常顆粒內(nèi)容物和花生四稀酸代謝途徑釋放異常胞內(nèi)鈣流缺陷早期反應(yīng)缺陷肌球蛋白輕鏈磷酸化，磷脂酰肌醇代謝對(duì)特異誘導(dǎo)劑的受體缺陷或受體受阻（包括巨血小板綜合癥和血小板無(wú)力癥）腎上腺素受體缺乏脊髓增生混亂（MPD）膠原受體 缺乏 U46, 619藥物缺陷.血栓素A2類似物 血小板凝集活性缺陷血小板構(gòu)成凝塊的骨架二、

5、原理血小板聚集是指血小板相互粘附的過程。當(dāng)一定數(shù)量的誘導(dǎo)劑存在時(shí)，血小板在各種情況下均能發(fā)生聚集 現(xiàn)象。因此在富血小板血漿中或全血加入誘導(dǎo)劑即可檢測(cè)血小板的聚集功能。血小板的聚集依賴鈣離子、纖維蛋 白原、一個(gè)或多個(gè)血漿因子及誘導(dǎo)劑的存在，對(duì)于不同的誘導(dǎo)劑、不同的誘導(dǎo)劑濃度血小板聚集各異。在光學(xué)法 檢測(cè)血小板聚集時(shí)常用ADP、腎上腺素、膠原、瑞氏托酶素等誘導(dǎo)劑進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并為臨床診斷提供直接信息。 試劑選擇的理論基礎(chǔ)：血小板的儲(chǔ)存顆粒內(nèi)含有ADP和腎上腺素，在初級(jí)血栓形成時(shí)從儲(chǔ)存顆粒內(nèi)釋放，誘導(dǎo)進(jìn)一步的聚集。實(shí)驗(yàn)證明，體外血小板對(duì)誘導(dǎo)劑的反應(yīng)有助于診斷出血性疾患的本質(zhì)。 血小板內(nèi)無(wú)膠原的存在，但見

6、于血管壁的結(jié)締組織中，所以膠原被認(rèn)為是第一步聚集或?yàn)檠“迮c血管壁 接觸的前期因子。因此體外研究血小板對(duì)膠原的反應(yīng)具有重要意義。其他的試劑如：凝血酶、A23187鈣離子載體、花生四稀酸、瑞氏托酶素、皿因子、5羥色氨也應(yīng)用于不同目的。血小板聚集是目前能獲得檢測(cè)血小板功能最有效的實(shí)驗(yàn)。血小板聚集儀能幫助診斷、選擇正確治療方案。 血小板聚集儀在診斷遺傳性或獲得性血小板功能缺陷時(shí)具有重要意義。血小板對(duì)不同誘導(dǎo)劑的反應(yīng)是診斷血小板 功能缺陷的基礎(chǔ)。如下表；血小板功能缺陷聚集的研究缺陷ADP誘導(dǎo)聚集膠原誘導(dǎo)聚集瑞氏托酶素誘導(dǎo)聚集血小板無(wú)力癥減少減少正常血小板減少癥正常（1期）減少正常假性血友病正常正常異常

7、非類固醇抗炎藥正常（1期）減少異常威士達(dá)醫(yī)療有限公司VASTEC MEDICAL LTD.20-7-14 dinah9四、光學(xué)法聚集與電阻法聚集的比較PRP 富血小板血漿1、將靜脈血1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘， 獲得PRP。2、離心剩下紅細(xì)胞1500轉(zhuǎn)/分獲得PPP 3、用PPP調(diào)整PRP中血小板數(shù)為全血聚集1、用等量鹽水稀釋2、加入900 口 I稀釋的標(biāo)本到反應(yīng)杯45分鐘 3、所需時(shí)間5分鐘3X 108/mlA +in、 A ：A ri I 4-*-Zill CZ rtr+Tr+i 匚匚壬口共日總結(jié)1、電阻法聚集不但可應(yīng)用于全血，亦可應(yīng)用于PRP2、電阻法聚集不引起聚集波的震蕩，因?yàn)樵诠鈱W(xué)聚

8、集中磁棒會(huì)干擾光的透過3、電阻法聚集與光學(xué)法聚集具有一致性的結(jié)果4、在全血中聚集與PRP聚集相比應(yīng)較慢，這是由于紅細(xì)胞存在降低了血小板間的相互作用5、全血中血小板會(huì)保存更長(zhǎng)時(shí)間第二章血小板聚集試劑水用于復(fù)溶劑。要求無(wú)離子和其他保護(hù)劑，如：乙醇會(huì)抑制聚集和釋放生理鹽水用于復(fù)溶劑，要求無(wú)離子和其他保護(hù)劑，如：乙醇會(huì)抑制聚集和釋放CHRONO LUME Reage nt 熒光試劑貨號(hào)：395成份：0.2mg熒光素、22,000uNts熒光素酶、硫化鎂、血清白蛋白、穩(wěn)定劑和緩沖液儲(chǔ)存濃度：0.2mg熒光素加22,000units熒光素酶/1.25ml使用濃度：2 M/L熒光素/熒光素酶/1.25ml水

9、試劑保存：未開封：0C以下凍存至瓶上效期復(fù)溶后：20C保存30天 工作保存：28C避光8小時(shí)試劑準(zhǔn)備：加入1.25ml的蒸僧水，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混合，使用前至少放置20分鐘，直到試劑完全溶解使用方法：稀釋式全血樣本：加入 100 口 L的試劑到900 口 L的稀釋/全血標(biāo)本中測(cè)量ATP的釋放 PRP：加入50 L的試劑加入到450 L的PRP中檢測(cè)ATP的釋放CHRONO LUME ATP Standard ATP 標(biāo)準(zhǔn)品貨號(hào)：387成分：冰凍5、三磷酸酰甘儲(chǔ)存濃度：2 口 mol使用濃度：2nmol試劑保存：未開封：0C以下凍存至效期復(fù)溶后：20C凍存兩周工作中保存：28c 24小時(shí)試劑準(zhǔn)備：加入5

10、ml的生理鹽水得到濃度為2 mol標(biāo)準(zhǔn)中至穩(wěn)定使用使用方法：稀釋/全血：5 L試劑到1ml 標(biāo)本中，終濃度為2 nmolPRP： 5 L試劑到500 口 L的PRP中，終濃度為2 nmolThrombi n碾血酶貨號(hào):386儲(chǔ)存濃度：10U/ml使用濃度：1 Un it試劑保存：未開封：0C以下凍存至效期復(fù)溶后：70C保存3個(gè)月工作中保存：2-8 C 24小時(shí)試劑準(zhǔn)備：加入1毫升生理鹽水所獲得的濃度為10 U/ml使用方法：全血標(biāo)本：加100 口 L試劑到1ml樣本中，終濃度為1 U/mlPRP：力口 50 L試劑到500 口 L樣本中，終濃度1U/ml正常ATP釋放使用凝血酶的濃度為1U/m

11、lcollage n-膠原貨號(hào)： 385保存濃度：1mg/ml使用濃度：2(1 g/ml試劑保存：未開封28C保存至效期開封后的試劑分裝穩(wěn)定期為1個(gè)星期2-8C使用方法：全血標(biāo)本：2 iL的試劑到1ml的樣本中，終濃度為2 i g/MLPRP：力口 1 iL的試劑到500iL的樣本中，終濃度為2 i g/MLArachidonic Acid :花生四稀酸貨號(hào)：390成分：99%花生四稀酸和100mg白蛋白保存濃度：50Mm/L使用濃度：50Mm/L試劑保存：未開封白蛋白：28C保存至效期花生四稀酸：20C以下冰凍保存至效期復(fù)溶后：1、試劑需分裝在-70C,暗處保存3個(gè)月2、20C冰凍保存1個(gè)月

12、，在暗處工作中保存：在陰暗處28C保存8個(gè)小時(shí)使用方法：全血標(biāo)本：加10 口 L的試劑到1ml的樣本中，終濃度為0.5MmPRP：力口 5 L的試劑到500 口 L的樣本中，終濃度為0.5MmADP :二磷酸酰甘貨號(hào)：384成分：2.5mg的二磷酸酰甘保存濃度：1mM使用濃度：10uM試劑保存：未開封0C以下保存至效期復(fù)溶后：1、試劑需分裝在-70C,保存一年或至效期工作中保存：2-8C保存8個(gè)小時(shí)試劑準(zhǔn)備：加入3ml的生理鹽水得到ADP試劑瓶中，充分混合后，轉(zhuǎn)移至一較大玻璃容器內(nèi)，再加入2ml生理鹽水，充分混 勻。使用方法：全血標(biāo)本：加10 口 L的試劑到1ml的樣本中，終濃度為10uMPR

13、P:力口 5 L的試劑到500 口 L的樣本中，終濃度為10uM第三章標(biāo)本的收集全血標(biāo)本的要求：將將靜脈血與3.2%或3.8%的枸椽酸鈉按9: 1的比例混合（除腎上腺素外），若使用腎上腺素作為誘 導(dǎo)劑建議標(biāo)本的采集抗凝劑使用為1.5%的枸椽酸鈉和2U/ml肝素，比例9: 1o進(jìn)行聚集檢測(cè)的病人應(yīng)不吸煙、二周內(nèi)無(wú)服用抗血小板藥物史。采集后的標(biāo)本應(yīng)在3小時(shí)內(nèi)檢測(cè)完成。富血小板血漿的要求:將將靜脈血與3.2%或3.8%的枸檬酸鈉按9： 1的比例混合，進(jìn)行聚集檢測(cè)的病人應(yīng)不吸煙、二周內(nèi)無(wú)服用抗血小板藥物史。采集后的標(biāo)本應(yīng)在0.52.5小時(shí)內(nèi)檢測(cè)完成。富血小板血漿的準(zhǔn)備：1、抗凝劑與標(biāo)本輕輕顛倒混合。2

14、、準(zhǔn)備PRP將抗凝標(biāo)本按1500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液于塑料管內(nèi)。3、準(zhǔn)備PPP將剩余的標(biāo)本按3000轉(zhuǎn)/分離心20分，取上清于塑料管內(nèi)。4、調(diào)整PRP中的血小板數(shù)目為200, 000-300, 000/ul第四章操作步驟電阻法測(cè)量聚集1ml的生理鹽水并將電極插入首先取一個(gè)干凈的，編號(hào)為P/N367的反應(yīng)杯放于預(yù)溫孔內(nèi)，杯內(nèi)加入 其中，作為常規(guī)維護(hù)使用。同時(shí)可在預(yù)溫孔內(nèi)放入干凈的反應(yīng)杯以備檢測(cè)使用。1、將帶有磁棒的反應(yīng)杯插入預(yù)溫孔，預(yù)溫 10分鐘。2、加入0.5ml抗凝血和0.5ml生理鹽水充分混合，預(yù)溫5分鐘。3、設(shè)置儀器上Small/La rge/lmpedanee的開關(guān)于Imped

15、anee (阻抗)位置。4、打開檢測(cè)孔上的蓋子，將預(yù)溫好的標(biāo)本放入檢測(cè)孔內(nèi)，關(guān)閉蓋子。在Aggregoment菜單內(nèi)選擇Run test,屏幕出現(xiàn)運(yùn)行曲線。5、將電極插頭插進(jìn)插座，電極放入反應(yīng)杯內(nèi)，關(guān)閉反應(yīng)孔上蓋。6、使用儀器上Impedanee Zero Knob重新設(shè)置曲線的基線在90%或10%位置。7、按Calibraten鈕，使聚集曲線的電阻增加為標(biāo)準(zhǔn)20ohm,同時(shí)旋轉(zhuǎn)GAIN鈕使曲線位于50ohm的位置后，松開旋鈕，那么每40個(gè)小格為20ohm。8、打開蓋子加入試劑，關(guān)閉蓋子。讓曲線運(yùn)行 69分鐘。衣編號(hào)試劑名稱儲(chǔ)存濃度最終濃度全血試 劑量PRP試劑量全血標(biāo)本量PRP標(biāo)本量參考值

16、(ohm)386凝血酶10U nit/ml1Un it385膠原1 mg/ml2ug/ml390花生四稀酸50mM0.5mM396瑞氏托酶素125mg/ml1 .Omg/ml384ADP1mM10uM393腎上腺素10mM/1mM50uM/10uM299VWF試劑盒9、檢測(cè)完成后，將電極取出，用蒸僧水沖洗并擦干，放入下一個(gè)標(biāo)本中10、 電極不用時(shí)，請(qǐng)將沖洗干凈的電極放入干凈的檢測(cè)杯中。注意：如果電阻的增益按上述設(shè)置，貝V:一個(gè)大格是5ohm一個(gè)小格是0.5ohm斜率：代表單位時(shí)間聚集速度光學(xué)法聚集的操作步驟打開聚集儀的電源開關(guān)，等待儀器溫度指示為37 Co1、將反應(yīng)杯放于預(yù)溫孔，預(yù)溫5分鐘并加入磁棒。2、加入5003的檢測(cè)標(biāo)本在反應(yīng)杯中。3、在另一個(gè)反應(yīng)杯中