成骨細(xì)胞骨形成促進(jìn)藥藥效實(shí)驗(yàn)

1、第 1 頁 共 4 頁成骨細(xì)胞骨形成促進(jìn)藥藥效實(shí)驗(yàn)成骨細(xì)胞骨形成促進(jìn)藥藥效實(shí)驗(yàn)體外抗骨質(zhì)疏松藥物的試驗(yàn)討論模型是應(yīng)用體外培養(yǎng)的骨細(xì)胞（成骨細(xì)胞、 破骨細(xì)胞） 模型對(duì)抗骨質(zhì)疏松癥藥物的藥效和藥理特點(diǎn)舉行初步討論， 為臨床前體內(nèi)藥效和臨床藥效討論提供參考依據(jù)。 對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分離舉行骨形成促進(jìn)作用和骨汲取抑制作用討論，是抗骨質(zhì)疏松癥藥效討論的重要內(nèi)容之一。 自 1964 年 peck 由胚胎和新生大鼠頭蓋骨應(yīng)用酶消化法體外培養(yǎng)出顯示高活性堿性磷酸酶( alkalinephosphatase, alp）的成骨細(xì)胞（osteoblasts, ob）和 1984年 boyde 等建立體外

2、培養(yǎng)破骨細(xì)胞（osteoclasts, oc）及其骨汲取功能測(cè)定等技術(shù)以來， 試驗(yàn)技術(shù)得到快速進(jìn)展， 不僅促進(jìn)了骨重建耦聯(lián)分子機(jī)制討論、 骨代謝基礎(chǔ)討論和代謝性骨病病理機(jī)制討論的發(fā)展外， 還有力地推進(jìn)了骨質(zhì)疏松癥防治藥物討論的進(jìn)展。雌激素、降鈣素、活性維生素 d 和甲狀旁腺激素等一些藥物對(duì)骨質(zhì)疏松癥防治的有效性和作用機(jī)制討論均與骨細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)討論疏遠(yuǎn)相關(guān)。 在評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松癥防治藥物的有效性中，觀看所討論藥物對(duì)成骨細(xì)胞骨形勝利能的促進(jìn)作用和對(duì)破骨細(xì)胞骨汲取功能的抑制作用是藥效評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容之一，因而建立規(guī)范的骨細(xì)胞體外培養(yǎng)和骨細(xì)胞藥效討論技術(shù)在骨質(zhì)疏松癥防治藥物開發(fā)中非常重要。一、成骨細(xì)胞骨

3、形成促進(jìn)藥藥效試驗(yàn)【原理和目的】成骨細(xì)胞的主要生物學(xué)功能是形成類骨質(zhì)和礦化形成新骨質(zhì)。成骨細(xì)胞是骨形成細(xì)胞，在骨重建中生成類骨質(zhì)和促進(jìn)類骨質(zhì)礦化，形成的新骨質(zhì)可修補(bǔ)破骨細(xì)胞骨汲取形成的陷窩。成骨細(xì)胞功能減退導(dǎo)致新骨形成量削減，對(duì)骨汲取陷窩的修補(bǔ)能力削弱。因此，成骨細(xì)胞骨形成的促進(jìn)藥物是防治骨質(zhì)疏松癥的主要途徑之一。而促進(jìn)骨形成的藥效表現(xiàn)在骨形成細(xì)胞數(shù)量增強(qiáng)、分化合勝利能和礦化功能上調(diào)。【材料】1動(dòng)物 新生大鼠（sd 或 wistar，清潔級(jí)合格）10 只。2試劑（1）70；(2) pbs 磷酸緩沖液；(3)0.25%溶液；(4) 0.1% ii 型膠原酶溶液；(5) 10% ncs-mem 培

4、養(yǎng)液；(6) 0.5% mtt(pbs 溶解配制，棕色瓶 4保存）；(7) 10%第 2 頁 共 4 頁sds(o.olmol/l hcl 配制）；(8）底物反應(yīng)液：pnpp-dea 溶液mgc126h20 101.7mg,12n hcl 1.95ml, dea 10m1 加蒸餾水至 50m1;臨用前與 3mmol/l pnpp 等量配制；(9）茜素紅。3其他材料 50m1燒杯；組織培養(yǎng)瓶；96 孔培養(yǎng)板；24 孔培養(yǎng)板；離心機(jī)；5% c02 培養(yǎng)箱； 酶標(biāo)儀， 光學(xué)顯微鏡。 【辦法】 1 成骨細(xì)胞的分別與制備(1)取新生大鼠 （sd 或 wistar， 清潔級(jí)合格） 10 只左右， 體表清洗

5、后置 70中浸泡 10 分鐘。(2）揭去頭皮，切下頭蓋骨，將頭蓋骨置于磷酸緩沖液（pbs)內(nèi)。清除骨膜、血管等結(jié)締組織，用 pbs 清洗 2 次后，將洗凈的頭蓋骨剪成 1 mm2 小片。(3)將骨小片移入 5 ml 0.25%溶液內(nèi)，37下預(yù)消化 20 分鐘，棄消化液。將骨片移入另一含 5ml 0.1 % ii型膠原酶溶液中，37振蕩消化分別細(xì)胞 60 分鐘。(4）將含細(xì)胞的消化液離心 10 分鐘，吸去上清液，沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，剩下的骨片用含 5 ml 0.1 % ii 型膠原酶溶液重復(fù)消化分別細(xì)胞60 分鐘。將 2 次消化獲得的細(xì)胞懸液混勻，計(jì)數(shù)。(5)按需要密度接種于培養(yǎng)

6、瓶中，置 5% co2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 小時(shí)左右換液一次，去除不貼壁的死亡細(xì)胞，以后每 23 天換液一次。2成骨細(xì)胞骨形成促進(jìn)藥藥效的測(cè)定(1)增殖率測(cè)定： 將培養(yǎng)呈半?yún)R集狀態(tài)的成骨細(xì)胞經(jīng) 0.25%胰蛋白酶消化后傳代，10% ncs-mem 培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)，以相同細(xì)胞密度（1x1032x103孔）接種于 96 孔培養(yǎng)板，容積為 200250 微升孔，常規(guī)培養(yǎng) 24 小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后換入含藥物或含溶劑對(duì)比培養(yǎng)液培養(yǎng),72 小時(shí)后用 mit 法測(cè)定。測(cè)定前 4 小時(shí)用 pbs 沖洗后更換無血清 mem 培養(yǎng)液 100ul，同時(shí)加入 10ul 0.5 % mtt (pbs 溶解配制， 棕色瓶

7、 4保存） ， 培養(yǎng)箱孵育 4 小時(shí)， 加 100ul 10% sds (0.01mol/l hcl 配制）37下孵育 2 小時(shí)。孵育后肉眼己可見不同數(shù)量的細(xì)胞展現(xiàn)不同深淺的紫色，冷至室溫后在酶標(biāo)儀上（波長(zhǎng) 570nm 處）測(cè)定吸光度值（a)。(2) alp 活性的測(cè)定：將培養(yǎng)呈半?yún)R集狀態(tài)的成骨細(xì)胞經(jīng) 0.25胰蛋白酶消化傳代，10% ncs-mem 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞、計(jì)數(shù)，以相同細(xì)胞密度（1x1032x103孔）接種于 96 孔培養(yǎng)板，容第 3 頁 共 4 頁積為 200250 微升孔， 常規(guī)培養(yǎng) 24 小時(shí)， 待細(xì)胞貼壁后換入含藥物或含藥物溶劑對(duì)比培養(yǎng)液培養(yǎng) 72 小時(shí)后用 pnpp 法測(cè)定

8、。 取培養(yǎng)液 20ul于 96 孔板，加底物反應(yīng)液 90ul，37水浴 10 分鐘，加 0.1mol/l naoh90u1 終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上（波長(zhǎng) 405nm）測(cè)定吸光度值（a)。調(diào)零孔為 90 u1 反應(yīng)液+90ul 終止液+20 ul 培養(yǎng)液。(3）礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)：培養(yǎng)細(xì)胞以 5x103/cm2 密度接種于 24 孔培養(yǎng)板，次日換入含藥物或含藥物溶劑對(duì)比培養(yǎng)液培養(yǎng)，23 天換液一次，10 天左右添加維生素 c 和-誘導(dǎo)礦化，普通以溶劑對(duì)比組浮現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)為準(zhǔn)終止培養(yǎng)，茜素紅染色，40 倍光鏡下做形態(tài)計(jì)量分析（圖 11-25）?！窘Y(jié)果與分析】1增殖率測(cè)定孵育后肉眼已可見不同數(shù)量的細(xì)胞展現(xiàn)不同

9、深淺的紫色，冷至室溫后在酶標(biāo)儀上（波長(zhǎng) 570nm 處）測(cè)定吸光度值（a) 。細(xì)胞量與 mtt a 值呈正相關(guān)。成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)率計(jì)算：（a 藥物組-a 對(duì)比組）/a 對(duì)比組 x100(）。增殖率采納 mtt 法測(cè)定含藥物培養(yǎng)液、溶劑對(duì)比培養(yǎng)液培養(yǎng) 72 小時(shí)后的成骨細(xì)胞增殖率，并繪制生長(zhǎng)曲線，可比較藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。2. alp 活性的測(cè)定樣品a 值在 alp 標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取酶活性值 （u/l) (pnp 濃度梯度 5 umol/l,10umol/l, 20umol/l , 40umol/l 相當(dāng)于 alp20u/l,40u/l,80u/l,160u/l)。分化促進(jìn)率計(jì)算辦法：（z

10、藥物組alp-z 對(duì)比組 alp)/z 對(duì)比組 alpxl00（）。分化能力應(yīng)用對(duì)硝基苯磷酸鹽法（pnpp)檢測(cè)含藥物培養(yǎng)液、溶劑對(duì)比培養(yǎng)液培養(yǎng) 72 小時(shí)后的培養(yǎng)液中的 alp 含量，以其與對(duì)應(yīng)樣品蛋白的比值分析成骨細(xì)胞的分化活性，計(jì)算藥物成骨細(xì)胞分化促進(jìn)率。3礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù) 以礦化結(jié)節(jié)數(shù)（n)或礦化面積（a）作為指標(biāo)。計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)：以2um2/個(gè)為標(biāo)準(zhǔn)。礦化促進(jìn)率計(jì)算：（n 藥物組-n 對(duì)比組）/n 對(duì)比組 x100(）或（a 藥物組-a 對(duì)比組）/a 對(duì)比組 x100（）礦化能力應(yīng)用礦化誘導(dǎo)法和茜素紅法，對(duì)含藥物培養(yǎng)液、溶劑對(duì)比培養(yǎng)液培養(yǎng)約 10 天后浮現(xiàn)的礦化結(jié)節(jié)列入計(jì)數(shù)，舉行形態(tài)計(jì)量，計(jì)算藥物成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)促進(jìn)率。終于結(jié)合這三種指標(biāo)，可分析抗骨質(zhì)疏松藥物藥效表現(xiàn)為以第 4 頁 共 4 頁促進(jìn)增殖為主， 或是以促進(jìn)分化和礦化能力為主。 可綜合推斷藥物的骨形成促進(jìn)藥效?！咀⒅厥马?xiàng)】1普通實(shí)行酶消化法或組織塊培養(yǎng)法（細(xì)胞移行生長(zhǎng)法）。前者可獲得大量細(xì)胞，但如消化酶的量或效價(jià)不足則不能獲得抱負(fù)的細(xì)胞數(shù)量， 另外假如酶的濃度、 溫度以及消化時(shí)光把握不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷、 膜受體的走失， 對(duì)細(xì)胞的貼壁和成活率也有一定影響；后者辦法比較簡(jiǎn)便、試驗(yàn)成本較低且細(xì)胞損傷小，細(xì)胞較純，但細(xì)胞產(chǎn)出率比較少。2原代分別的成骨細(xì)胞多含有其他細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)