堿裂解法提質(zhì)粒原理詳解

1、從質(zhì)粒提取談起(2022-12-2211:18:37)轉(zhuǎn)載標(biāo)分類：積累小常識簽：雜談從質(zhì)粒提取談起為了方便理解,這里羅列一下堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：溶液 I,50mM 葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA,pH8.0;溶液 II,0.2NNaOH/1%SDS;溶液 III,3M 醋酸鉀/2M 醋酸.讓我們先來看看溶液 I 的作用.任何生物化學(xué)反響,首先要限制好溶液的 pH,因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng) pH 值的 Tris-Cl 溶液,是再自然不過的了.那么 50mM 葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議,加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部.因此,如果溶液

2、 I 中缺了葡萄糖其實對質(zhì)粒的抽提本身而言,幾乎沒有任何影響.所以說溶液 I 中葡萄糖是可缺的.那么 EDTA 呢？大家知道 EDTA 是 Ca2+和 Mg2+等二價金屬離子的螯合劑,配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制 DNase 的活性,和抑制微生物生長.在溶液 I 中參加高達(dá) 10mM 的 EDTA,無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉.如果不加 EDTA,其實也沒什么大不了的,只要不磨洋工,只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提,就不用怕 DNA 會迅速被降解,由于最終溶解質(zhì)粒的 TE 緩沖液中有 EDTA.如果哪天你手上正好缺了溶液 I,可不可以抽提質(zhì)粒呢？實話告訴你,

3、只要用等體積的水,或 LB 培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了.有一點不能忘的是,菌體一定要懸浮均勻,不能有結(jié)塊.輪到溶液 II 了.這是用新鮮的 0.4N 的 NaOH 和 2%的 SDS 等體積混合后使用的.要新從濃 NaOH 稀釋制備 0.4N 的 NaOH,無非是為了保證 NaOH 沒有吸收空氣中的 CO2 而減弱了堿性.很多人不知道其實破細(xì)胞的主要是堿,而不是 SDS,所以才叫堿法抽提.事實上NaOH是最正確的溶解細(xì)胞的試劑,不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞,碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解,這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從 bilayer雙層膜結(jié)構(gòu)向 micelle微囊結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致.用了不新鮮的0.4

4、NNaOH,即便是有 SDS 也無法有效溶解大腸桿菌不妨可以自己試一下,自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒.如果只用 SDS 當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒,由于 SDS 也是堿性的,只是弱了點而已.很多人對 NaOH 的作用誤以為是為了讓基因組 DNA 變性,以便沉淀,這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān) DNA 變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致.有人不禁要問,既然是 NaOH 溶解的細(xì)胞,那為什么要加 SDS 呢？那是為下一步操作做的鋪墊.這一步要記住兩點：第一,時間不能過長,千萬不要這時候去接,由于在這樣的堿性條件下基因組 DNA片斷會慢慢斷裂；第二,必須溫柔混合象對待女孩子一樣,不然基因組 DNA 也會斷裂.基因

5、組 DNA 的斷裂會帶來麻煩,后面我再詳細(xì)說明.每個人都知道,溶液III參加后就會有大量的沉淀,但大局部人卻不明白這沉淀的本質(zhì).最容易產(chǎn)生的誤解是,當(dāng) SDS 碰到酸性后發(fā)生的沉淀.如果你這樣疑心,往 1%的 SDS 溶液中加如 2M 的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了.大量沉淀的出現(xiàn),顯然與 SDS 的參加有關(guān)系.如果在溶液 II 中不加 SDS 會怎樣呢,也會有少量的沉淀,但量上要少得多,顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì).既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀,那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在 1%的 SDS 溶液中慢慢參加 5N 的 NaCl,你會發(fā)現(xiàn) SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的.因此高濃度

6、的鹽導(dǎo)致了 SDS 的沉淀.但如果你參加的不是 NaCl 而是 KCl,你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多.這其實是十二烷基硫酸鈉sodiumdodecylsulfate遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀potassiumdodecylsulfatePDS,而 PDS 是水不溶的,因此發(fā)生了沉淀.如此看來,溶液 III 參加后的沉淀實際上是鉀離子置換了 SDS 中的納離子形成了不溶性的 PDS,而高濃度的鹽,使得沉淀更完全.大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合,平均兩個氨基酸上結(jié)合一個 SDS 分子,鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大局部蛋白質(zhì)沉淀了,讓人快樂的是大腸桿菌的基因組 DNA 也一起被共沉

7、淀了.這個過程不難想象,由于基因組 DNA 太長了,長長的DNA 自然容易被 PDS 給共沉淀了,盡管 SDS 并不與 DNA 分子結(jié)合.那么 2M 的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH,由于長時間的堿性條件會打斷DNA,所以要中和之.基因組 DNA 一旦發(fā)生斷裂,只要是 50-100kb 大小的片斷,就沒有方法再被 PDS 共沉淀了.所以堿處理的時間要短,而且不得劇烈振蕩,不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組 DNA 混入,瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總 DNA 條帶.很多人誤認(rèn)為是溶液 III 參加后基因組 DNA 無法快速復(fù)性就被沉淀了,這是天大的誤會,由于變性的也好復(fù)性的也

8、好,DNA 分子在中性溶液中都是溶解的.NaOH本來是為了溶解細(xì)胞而用的,DNA分子的變性其實是個副產(chǎn)物,與它是不是沉淀下來其實沒有關(guān)系.溶液 III 參加并混合均勻后在冰上放置,目的是為了 PDS 沉淀更充分一點.不要以為 PDS 沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了,其實還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀,因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提,然后進行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒 DNA,不然時間一長就會由于混入的 DNase 而發(fā)生降解.這里用 25/24/1 的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的,這里做個全面的介紹.酚Phenol對蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿,按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉,但是

9、水飽和酚的比重略比水重,碰到高濃度的鹽溶液比方 4M 的異硫氟酸瓜,離心后酚相會跑到上層,不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但參加氯仿后可以增加比重,使得酚/氯仿始終在下層,方便水相的回收；還有一點,酚與水有很大的互溶性,如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中,而酚會抑制很多酶反響比方限制性酶切反響,應(yīng)此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除,而用酚/氯仿的混合液進行抽提,跑到水相中的酚那么少得多,微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必?fù)?dān)憂酶切等反響不能正常進行.至于異戊醇的添加,其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清楚,也方便了水相的回收.回收后的水相含有足夠多的鹽,因此只要

10、參加 2 倍體積的乙醇,在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒 DNA 沉淀出來.這時候如果放到-20C,時間一長反而會導(dǎo)致大量鹽的沉淀,這點不同于普通的DNA酒精沉淀回收,所以不要過分小心了.高濃度的鹽會水合大量的水分子,因此 DNA 分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀.如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀,就用 70%的乙醇多洗幾次,每次在室溫放置一個小時以上,并用 tip 將沉淀打碎,就能得到好的樣品.得到的質(zhì)粒樣品一般用含 RNase50ug/ml的 TE 緩沖液進行溶解,不然大量未降解的 RNA 會干擾電泳結(jié)果的.瓊脂糖電泳進行鑒定質(zhì)粒 DNA 時,多數(shù)情況下你能看到三條帶,但千萬不要認(rèn)為你看到的是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶.堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性 DNA,不信的話你用 EcoRI 來線性化質(zhì)粒后再進行瓊脂糖電泳,就會看到線性質(zhì)粒 DNA 的位置與這三條帶的位置不一樣.其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序,分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體即沒有復(fù)制完全的兩個質(zhì)粒連在了一起.如果你不小心在溶液 II 參加后過度振蕩