MGB探針設(shè)計(jì)原則

1、總體原則? 先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針。? 所選序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段一一這是因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響反應(yīng)效率，而且還會(huì)阻礙酶的擴(kuò)增。建議先進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)，如果不能避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，那么就要 相應(yīng)提高退火溫度。? 擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)不超過400bp，理想的最好能在100-150bp內(nèi)，擴(kuò)增片段越短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容 易獲得。較短的擴(kuò)增片段也容易保證分析的一致性。? 保持GC含量在20%和80%之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低，以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號(hào)。? 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核甘酸序列，尤其是 G （不能

2、有4個(gè)連續(xù)的G）? 將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。引物設(shè)計(jì)原則? 序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段? 避免引物自身或與引物之間形成 4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)? 典型的引物18到24個(gè)核昔長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核昔的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。? Tm值在55-65 C （因?yàn)?0c核酸外切酶活性最高）,GC含量在40%-60%? 引物之間的TM相差避免超過2 c? 引物的3端避免使用堿基

3、A,引物的3端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基? 為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子。? Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在 50bp150bp? 引物末端（最后5個(gè)核昔酸）不能有超過 2個(gè)的G和C。探針設(shè)計(jì)原則? 探針位置盡可能地靠近上游引物? 探針長(zhǎng)度應(yīng)在15-45bp （最好是20-30bp）,以保證結(jié)合特異性? 檢測(cè)探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)? Tm值在65-70 C ,通常比引物 TM 值高5-10 C （至少要 5） , GC含量在40%- 70%? 探針的5端應(yīng)避免使用G鳥嗯吟一一因?yàn)?G會(huì)有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會(huì)存在淬 滅作用。? 整條探針中，堿基

4、C的含量要明顯高于 G的含量一一G含量高會(huì)降低反應(yīng)效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配 對(duì)的另一條鏈作為探針。? 為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在 blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)， 建議重新設(shè)計(jì)引物探針。Taqman MGB 探針設(shè)計(jì)? 探針的5端避免出現(xiàn)G,即使探針?biāo)鉃閱蝹€(gè)堿基，與報(bào)告基團(tuán)相相連的G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號(hào)。? Tm 值應(yīng)為 65-67 C。? 盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長(zhǎng)度不少于 13bp。? 盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn) 4個(gè)或4個(gè)以上的G重復(fù)出現(xiàn)。? 原則上MGB探針只要有一個(gè)堿基突變，MGB探針就會(huì)檢測(cè)到（MGB探針將

5、不會(huì)與目的片段雜交， 不產(chǎn)生熒光信號(hào)）。因此，在進(jìn)行 SNP檢測(cè)時(shí)，為了檢測(cè)到突變子，即 Taqman MGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號(hào)檢測(cè)將探針的突變位點(diǎn)盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的 4個(gè)條件，探針的突變位點(diǎn)可向3端移動(dòng)，但突變位點(diǎn)至少在離3端2個(gè)堿基的前方（即必須確保探針的后兩個(gè)堿基是絕對(duì)的保守），以進(jìn)行SNP檢測(cè)。反過來，若要進(jìn)行同類檢測(cè)，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點(diǎn)。若探針即便是只有13個(gè)bp,探針仍不完全保守。有幾個(gè)突變，突變位點(diǎn)也應(yīng)靠近探針的5端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號(hào)。另一種方法是設(shè)計(jì)

6、簡(jiǎn)并探針，也可達(dá)到即使是突變，仍可檢測(cè)到突變。第三步：尋找一家信賴的公司合成引物和探針，一般引物合成大家比較熟悉，而且價(jià)格也比較便宜（特別是這兩年便宜了許多），而探針則相對(duì)來說貴了許多，一般Taqman探針合成在1000到5000元不等（不同的合成要求價(jià)錢不同）一一而這只是標(biāo)記價(jià)錢，序列合成基本上和引物合成價(jià)錢相似。第四、五、六步：一般的定量PCR反應(yīng)體系與普通PCR其實(shí)也差不了多少,只是要加入Taqman探針，另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是：?擴(kuò)增酶最好選用熱啟動(dòng)酶?引物和探針的濃度需要進(jìn)行優(yōu)化，有人建議從50nM開始，在50nM900nM之間優(yōu)化，一般為200nM （注意探針需要避光保存。? 同樣Mg+和酶量也需要進(jìn)行優(yōu)化，酶的推薦反應(yīng)濃度是1.25-1.5U （50ul）? DNA模板的添加量通常在 100 ng以下，因不同種類的 DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同， 必要時(shí)可進(jìn)行梯度稀釋，確定最佳的DNA模板添加量。如果欲進(jìn)行2