RNAi技術(shù)及其實驗操作

1、RNAi技術(shù)及其實驗操作 標簽: RNAi技術(shù) siRNA 頂7 分享到 發(fā)表評論(0) 編輯詞條 騰訊微博 開心001 人人網(wǎng) 新浪微博 目前對RNAi (RNA interference)的定義有很多種，不同的資料對其定義的側(cè)重點也不盡相同，如果將RNAi看作一種生物學(xué)現(xiàn)象，可以有以下定義： RNAi是由dsRNA介導(dǎo)的由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。 RNAi是有dsRNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異性的自我防御機制，是一種當外源基因?qū)牖虿《救肭趾?，細胞中與轉(zhuǎn)基因或入侵病毒RNA同源

2、的基因發(fā)生共同基因沉默的現(xiàn)象。 如果將其作為一門生物技術(shù)，則定義為： RNAi 是指通過反義RNA與正鏈RNA 形成雙鏈RNA 特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象,它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA 和反義RNA) ,從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA 降解,達到阻止基因表達的目的。 RNAi是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）在細胞內(nèi)特異性的將與之同源的 mRNA降解成21nt23nt 的小片段，使相應(yīng)的基因沉默。 RNAi是將與靶基因的mRNA 同源互補的雙鏈RNA(dsRNA ) 導(dǎo)入細胞,能特異性地降解該mRNA ,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失, 屬于轉(zhuǎn)錄后水

3、平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。 各種不同定義雖然說法不同，但所描述事實是大體相同的，簡單地可以說，RNAi就是指由RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象。也就是說，RNAi技術(shù)是利用RNAi為原理，在體外利用化學(xué)或酶促合成siRNA，也可構(gòu)建在體內(nèi)合成siRNA的質(zhì)?；虿《颈磉_載體，然后利用傳統(tǒng)微注射磷酸鈣法、電穿孔轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等方法轉(zhuǎn)染細胞從而致使靶基因沉默的技術(shù)。RNA干擾有很多方法：化學(xué)合成法：應(yīng)用最廣泛但成本昂貴，體外合成的長21nt、3端帶有2個游離核苷酸的siRNA較其它形式合成的RNA具有更大效率的降解目的mRN

4、A的效果。 siRNA表達載體：在質(zhì)?；虿《据d體中，利用RNA聚合酶啟動因子U6或T7分別控制正義鏈和反義鏈的合成并退火形成雙鏈siRNA，或在啟動子下游設(shè)計帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)的表達單位，自身退火形成雙鏈siRNA。dsRNA表達載體：多用于果蠅、線蟲等低等生物，在體內(nèi)表達后被Dicer切割成21-23nt的siRNA；或在體外利用Dicer、RNaseIII切割dsRNA產(chǎn)生siRNA，純化后使用。最近由于RNA干擾（RNA interference，RNAi）的發(fā)現(xiàn)使反義領(lǐng)域的研究增多。這種自然發(fā)生的現(xiàn)象最早是在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的，是序列特異性地使轉(zhuǎn)錄后的基因沉默的有力機制。RNA干擾是由長的雙鏈R

5、NA分子發(fā)動的，該分子可以被Dicer enzyme加工成長度為21-23個核苷酸的RNA。RNaseIII蛋白被認為是作為一個二聚體發(fā)揮作用，它對雙鏈RNA的兩個鏈都進行切割，酶切的產(chǎn)物3末端互相重疊。然后這種小的干擾RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引導(dǎo)核酸酶降解靶RNA。這種保守的生化機制可用于研究多種模式生物的基因功能，但是它在哺乳動物細胞中的應(yīng)用受到阻礙，因為長的雙鏈RNA分子會引起干擾素應(yīng)答。因此Tuschi及其同事表明長度為21nt的siRNA

6、可以特異性的抑制哺乳動物細胞基因表達是一個革命性的突破。這個發(fā)現(xiàn)激發(fā)了大量利用RNAi技術(shù)對哺乳動物細胞的研究，因為與傳統(tǒng)的反義技術(shù)比，RNAi的性能明顯較高。有趣的是，除了短雙鏈RNA，短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如莖環(huán)結(jié)構(gòu)在細胞內(nèi)經(jīng)過加工后也可以變成siRNA，從而產(chǎn)生RNA干擾。這使得構(gòu)建表達干擾RNA的載體，從而使哺乳動物細胞內(nèi)基因表達長期沉默成為可能。shRNA可以利用RNA聚核酶III啟動子轉(zhuǎn)錄，在正常情況下，該啟動子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6或者RNaseP的組分H1 RNA轉(zhuǎn)錄的。另外一種辦法是兩

7、段短RNA分子分別用U6啟動子轉(zhuǎn)錄出來。載體介導(dǎo)的siRNA表達使對功能缺失（loss-of-function）表型進行長期分析成為可能。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)，兩個月后仍可觀察到沉默現(xiàn)象。另外一種延長siRNA抑制基因表達時間的方法是對化學(xué)合成的RNA進行核苷酸修飾。盡管未經(jīng)修飾的短雙鏈RNA在細胞培養(yǎng)物或者體內(nèi)的穩(wěn)定性出乎意料的高，然而有些情況下，需要對siRNA的穩(wěn)定性進行進一步提高。因此，可以在兩條鏈的末端都引入經(jīng)過修飾的核苷。一個5端為兩個2-O-甲基RNA、3端為4個甲基化核苷的siRNA與序列相同但是未經(jīng)修飾的siRNA比活性相同，但是在細胞培養(yǎng)物中引起的基因沉默現(xiàn)象的時間延長。然而

8、，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將導(dǎo)致siRNA活性下降。RNA干擾在哺乳動物體內(nèi)的第一個研究是利用快速注射大量生理溶液的方法將一個編碼shRNA的質(zhì)粒注入老鼠的尾靜脈。在大多數(shù)器官中，報道基因（編碼于共轉(zhuǎn)染質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)基因小鼠上）的表達可以被有效地抑制。另外，F(xiàn)as基因被作為肝損傷治療相關(guān)的內(nèi)源靶標進行了RNA干擾實驗。注射siRNA之后，小鼠肝細胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保護小鼠免遭由注射競爭性Fas特異抗體引起的爆發(fā)性肝炎，82%用siRNA處理的小鼠活過了10天觀察期，而所有的對照小鼠在3天之內(nèi)死亡。上述研究中采用的

9、高壓導(dǎo)入技術(shù)是一種粗暴的方法，不適于治療用。因此，標準的基因治療所采用的方法被用于RNA干擾。一個反轉(zhuǎn)錄病毒載體被用于導(dǎo)入siRNA，以抑制人類胰腺腫瘤細胞中的癌基因K-ras等位基因。負調(diào)控癌細胞中K-ras基因的表達使得它們在注入無胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成腫瘤的能力。這項研究還表明siRNA的高度特異性，因為只有癌基因K-ras被沉默，而與之只有1個堿基對差異的野生型等位基因并沒有被沉默。另外，當在紋狀區(qū)注射表達siRNA的腺病毒之后，轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中GFP基因的表達可以被抑制。葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通過在小鼠尾靜脈注射重組腺病毒抑制。有趣的是，具

10、有CMV啟動子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表達元件被用于這個實驗，為設(shè)計組織特異性或者可誘導(dǎo)的siRNA載體打開了大門。總的來說，siRNA的第一個體內(nèi)實驗已經(jīng)進行，其他有重要意義的基因有望于很快作為靶標開展研究。至今為止的研究沒有觀察到任何應(yīng)用siRNA引起的毒性作用，但是在治療人類疾病的臨床試驗開始之前仍需小心，以排除長期使用RNA干擾引起的嚴重副作用。因為用siRNA使基因表達沉默與傳統(tǒng)的反義技術(shù)相似，研究者將從十多年來反義技術(shù)研究的教訓(xùn)中獲益，比如需要使用合適的對照以證明基因表達的敲除是特異性的，以及對免疫系統(tǒng)可能引起的意外影響進行詳細分析。l經(jīng)過長期盛衰沉浮，反義技術(shù)近年來

11、得到越來越多的注意。對能夠提高靶表親和性和生物穩(wěn)定性、降低毒性的修飾核苷的研究取得了重要進展。由于大多數(shù)新的DNA類似物不能激活RNaseH，對反義寡核苷酸的設(shè)計需要考慮靶mRNA是否需要保留，例如，是改變剪接方式，還是降解靶mRNA（這種情況下應(yīng)該使用gapmer技術(shù)）。可以通過有系統(tǒng)的修飾天然核酶或者通過體外選擇技術(shù)獲得具有高催化活性的穩(wěn)定核酶。一些反義寡核苷酸和核酶已經(jīng)進入臨床試驗研究，一個反義藥物已經(jīng)在1998年獲得批準。一個重要的突破是發(fā)現(xiàn)短的雙鏈RNA分子可用于哺乳動物細胞中特異性沉默基因表達。這個方法與傳統(tǒng)的反義技術(shù)比效率明顯更高，并且一些體內(nèi)實驗的數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)表。因此，反義技術(shù)有

12、望廣泛應(yīng)用于對未知功能基因的研究、藥物靶標的確認和治療。目錄 RNAi的發(fā)現(xiàn) RNAi的作用機制 RNAi的特點 RNAi的生物學(xué)意義及其應(yīng)用 RNAi相關(guān)術(shù)語 RNAi技術(shù)關(guān)鍵問題 RNAi抑制病毒研究技術(shù)路線 哺乳動物細胞的RNAi技術(shù)策略 RNAi實驗方法 設(shè)計siRNAs的方法 制備siRNAs的方法 siRNA的設(shè)計 siRNA的轉(zhuǎn)染的方法及其注意事項 siRNA對照解析 顯示部分顯示全部RNAi的發(fā)現(xiàn)編輯本段回目錄RNA干擾(RNAinterference，RNAi)現(xiàn)象是一種進化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機制。將與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補序列的雙鏈RNA(

13、doublestrandRNA，dsRNA)導(dǎo)入細胞后，能特異性地降解該mRNA，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失，這一過程屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(posttranscriptionalgenesiliencing，PTGS)范疇。RNAi廣泛存在于生物界，從低等原核生物，到植物，真菌，無脊椎動物，甚至近來在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)了此種現(xiàn)象，只是機制也更為復(fù)雜。早在1990年進行轉(zhuǎn)基因植物有關(guān)研究時偶然發(fā)現(xiàn)，將全長或部分基因?qū)胫参锛毎竽承﹥?nèi)源性基因不能表達，但這些基因的轉(zhuǎn)錄并無任何影響，并將這種現(xiàn)象稱為基因轉(zhuǎn)錄后沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS).199

14、6年在脈孢菌屬(Neurospora)中發(fā)現(xiàn)了相似現(xiàn)象，只不過將這種現(xiàn)象命名為基因表達的阻抑作用(quelling).首次發(fā)現(xiàn)dsRNA能夠?qū)е禄虺聊木€索來源于線蟲Caenorhabditiselegans的研究。1995年康乃爾大學(xué)的研究人員Guo和Kemphues嘗試用反義RNA去阻斷par1基因的表達以探討該基因的功能，結(jié)果反義RNA的確能夠阻斷par21基因的表達，但是奇怪的是，注入正義鏈RNA作為對照，也同樣阻斷了基因的表達。這個奇怪的現(xiàn)象直到3年后才被解開華盛頓卡耐基研究院的AndrewFire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的CraigMello首次將雙鏈dsRNA正義鏈和反義鏈的混合

15、物注入線蟲，結(jié)果誘發(fā)了比單獨注射正義鏈或者反義鏈都要強得多的基因沉默。實際上每個細胞只要很少幾個分子的雙鏈RNA已經(jīng)足夠完全阻斷同源基因的表達。后來的實驗表明在線蟲中注入雙鏈RNA不單可以阻斷整個線蟲的同源基因表達，還會導(dǎo)致其第一代子代的同源基因沉默。他們將這種現(xiàn)象稱為RNA干擾。過去認為，哺乳動物細胞中不存在RNAi現(xiàn)象，因為較長的dsRNA在哺乳動物細胞中能誘導(dǎo)IFN(干擾素)生成，并激活STAT途徑參與的PKR(dsRNA依賴性激酶)的轉(zhuǎn)錄，同時dsRNA本身與PKR結(jié)合也能令其激活，繼而磷酸化翻譯起始因子eIF2a使之失活，導(dǎo)致非特異性的蛋白質(zhì)合成障礙；另一方面，dsRNA又能誘導(dǎo)細胞

16、產(chǎn)生多種抗病毒蛋白的2，5腺苷合成酶，生成2，5腺苷酸，激活非特異性的RNA酶L，發(fā)生非特異性的RNA降解效應(yīng)。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，只要dsRNA短于30bp，就不會促發(fā)干擾素效應(yīng)，同時又能特異性地降解mRNA，引起基因沉默，說明dsRNA在哺乳動物細胞中也能發(fā)揮一定作用，為以后的基因治療等RNAi應(yīng)用領(lǐng)域提供了新的研究方向。RNAi的詳細機制和過程還不十分清楚，目前大致分為以下幾個階段進行：siRNA的形成階段：此階段需要Rde-1,Rde-4和dsRNA特異性的核酸內(nèi)切酶Dicer等共同參與。Rde-1,4編碼的蛋白識別外源dsRNA，引導(dǎo)dsRNA與Dicer結(jié)合，然后，Dicer將dsRNA解旋

17、，再將其裂解為21-25 nt大小的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。Dicer定位于胞漿中，但核內(nèi)mRNA剪切修飾后在向核外運輸過程中也存在RNAi現(xiàn)象，可能有其他類似功能的酶發(fā)揮作用?，F(xiàn)認為21-25nt大小并在3端帶有2-3個堿基懸端且5端磷酸化的siRNA誘導(dǎo)的RNAi效應(yīng)最強。Dicer家族在進化上非常保守，有5個組成部分：N-端RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域、1個PAZ結(jié)構(gòu)域(Piwi，augonaute，Zwille/pinehead，PAZ)、2個 RNaseIII結(jié)構(gòu)域和C端dsRNA結(jié)合基序。Dicer在體內(nèi)一般是以二聚體的形式發(fā)揮作用的，由于不同

18、種族Dicer分子大小不一樣，所以dsRNA被切割成的siRNA大小具有種族差異。 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silicencing complex，RISC）形成階段：生成的siRNA和RNAi特異性酶如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶結(jié)合形成RISC，具有序列特異性核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶和解旋酶活性，能特異地降解與siRNA同源的靶mRNA。效應(yīng)階段： siRNA引導(dǎo)RISC與同源性的mRNA結(jié)合，在ATP及解旋酶（如qde-3，mut-6，mut-14）的作用下使siRNA鏈解離，并使RISC由250kD大小的前體形式變成約100

19、kD左右活性形式，同時解旋酶催化同源mRNA與siRNA的正義鏈相互交換，核酸酶在mRNA與反義RNA所形成的雙鏈區(qū)的5起始端下游7-10個核苷酸處切斷mRNA，起到特異的抑制基因表達的效果。擴增階段：該反應(yīng)以siRNA中的一條鏈為引物，以靶mRNA為摸板，在RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，擴增靶mRNA，產(chǎn)生新的二級siRNA，而這些siRNA又能繼續(xù)反作用于靶mRNA。RdRP不僅能增加siRNA的拷貝數(shù)，而且能將異常的單鏈RNA轉(zhuǎn)變dsRNA。RdRP還是一個重要的“sensor”，它能識別正常和異常的RNA。轉(zhuǎn)基因R

20、NA和病毒RNA都是在RdRP的識別下啟動RNAi的反應(yīng)過程。此外，RNAi的擴增效應(yīng)還可能存在另外兩種機制：Dicer將長dsRNA切成初級siRNA ，這一放大水平取決于dsRNA的長度；siRNA在酶的作用下可以多次應(yīng)用，產(chǎn)生進一步的放大效應(yīng)。RNAi的作用機制編輯本段回目錄干擾性小RNA(smallinterferingRNA，或shortinterferingRNAs，siRNA)是RNA干擾作用(RNAi)賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子.siRNA是一類長約2125個核苷酸(nt)的特殊雙鏈RNA(dsRNA)分子，具有特征性結(jié)構(gòu)，即siRNA的序列與所作用的靶mRNA序列具有同源性；

21、siRNA兩條單鏈末端為5端磷酸和3端羥基.此外，每條單鏈的3端均有23個突出的非配對的堿基RNAi的主要過程是，dsRNA被核酸酶切割成2125nt的干擾性小RNA(siRNA)，由siRNA介導(dǎo)識別并靶向切割同源性靶mRNA分子.細胞中dsRNA的形成是RNAi的第一步.細胞中dsRNA可通過多種途徑形成，如基因組中DNA反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；同時轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA；病毒RNA復(fù)制中間體；以及以細胞中單鏈RNA為模板由細胞或病毒的RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)催化合成dsRNA等.在線蟲(C.elegans)可以直接注射dsRNA或把線蟲浸泡在含dsRNA溶液中等方式引入外源dsR

22、NA，還可以通過喂養(yǎng)表達正義和反義RNA的細菌獲得dsRNA.現(xiàn)已初步闡明RNAi的作用機制.RNAi的第一步是，dsRNA在內(nèi)切核酸酶(一種具有RNase樣活性的核酸酶)作用下加工裂解形成2125nt的由正義和反義序列組成的干擾性小dsRNA，即siRNA.果蠅中RNaseIII樣核酸酶稱為Dicer.Dicer含有解旋酶(helicase)活性以及dsRNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域.已發(fā)現(xiàn)在Arabidopsis，C.elegans，Schizosaccharomycespombe以及哺乳動物中也存在Dicer同類物.RNAi的第二步是，由siRNA中的反義鏈指導(dǎo)形成一種核蛋白體，該核蛋白體稱

23、為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)，由RISC介導(dǎo)切割靶mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域，從而達到干擾基因表達作用.RISC由多種蛋白成分組成，包括內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA鏈搜索活性等.線蟲C.elegans中的MUT7(一種RNaseD樣蛋白)可能是一種35外切核酸酶.此外，PAZPPiwi蛋白家族成員可能是RISC中的構(gòu)成組分，如Arabidposis中的AGO1；N.Crassa中的QDE；C.elegans中的RDE1等，以上這些蛋白與翻譯因子eIF2C同源.研究進一步揭示，ATP在siRNA介導(dǎo)的RN

24、Ai中具有重要作用.較長dsRNA向siRNA的轉(zhuǎn)變要有ATP參與.siRNA與蛋白因子形成一個無活性的約360kD的蛋白PRNA復(fù)合體；隨之，siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋并形成有活性的蛋白PRNA復(fù)合體(RISC)，此步具有ATP依賴性.RISC活性復(fù)合體對靶mRNA的識別和切割作用，這一步可能不需ATP參與.此外，ATP使siRNA5端帶上磷酸分子，且對siRNA的功能具有重要作用.上述過程中siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋很可能是一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)改變，因為siRNA雙鏈體與細胞裂解物、ATP等孵育后再除去ATP及其它輔助因子，含有siRNA的活性復(fù)合體仍能識別和切割靶mRNA分子siRNA可作為一種特殊引

25、物，在RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)作用下以靶mRNA為模板合成dsRNA，后者可被降解形成新的siRNA；新生成的siRNA又可進入上述循環(huán).這種過程稱為隨機降解性多聚酶鏈反應(yīng)(randomdegradativePCR).新生的dsRNA反復(fù)合成和降解，不斷產(chǎn)生新的siRNA，從而使靶mRNA漸進性減少，呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象.RdRp一般只對所表達的靶mRNA發(fā)揮作用，這種在RNAi過程中對靶mRNA的特異性擴增作用有助于增強RNAi的特異性基因監(jiān)視功能.每個細胞只需要少量dsRNA即能完全關(guān)閉相應(yīng)基因表達，可見RNAi過程具有生物催化反應(yīng)的基本動力學(xué)特征.miRNA與siRNA的區(qū)別：（1

26、） miRNA是單鏈的，而siRNA則是雙鏈的；（2） miRNA參與正常情況下生長發(fā)育基因調(diào)控，而siRNA不參與動物體的正常生長，只有在病毒或其它dsRNA誘導(dǎo)情況下才產(chǎn)生siRNA，作為miRNA的完善和補充；（3） miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，推測在翻譯水平也起作用，而siRNA為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達調(diào)控；（4） Dicer酶對兩類RNA的加工過程，miRNA為不對稱性，僅來自含莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA前體的一側(cè)臂，剩余部分很快降解，而這種不對稱性不存在于而siRNA加工過程中。RNAi的特點編輯本段回目錄高度特異性：有時siRNA一個堿基改變就會大大降低封閉靶基因的效果。Brumme

27、lkamp4等利用載體表達的小發(fā)夾RNA （small hairpin RNA，shRNA）來封閉人MCF-7細胞的CDH1基因，shRNA上僅一對堿基的突變就不能抑制CDH1基因的表達。其中siRNA的中央位置堿基位點和3末端倒數(shù)第二個堿基起了格外重要的作用。高效率：在細胞內(nèi)RNAi途徑一旦被啟動，反應(yīng)信號就被放大。在低等動物中靶基因表達抑制效率大于90%，甚至有人認為每個細胞一份拷貝的dsRNA就可以封閉基因的效果。高成功率：RNAi已被用于線蟲全基因組的功能分析，其中有50%-80%序列選擇有效，12.9%-27%的基因封閉產(chǎn)生了明顯的異常表型。種屬時-效性：Irie等人發(fā)現(xiàn)，在低等生物

28、中RNAi可持續(xù)存在，但RNAi在哺乳動物細胞中只能維持一段時間，一般注入dsRNA后的2-3天，RNAi的作用最明顯，爾后1-2天內(nèi)，靶mRNA的豐度就能恢復(fù)到注射RNAi之前的水平。這可能是由于RNA依賴的核苷脫氨酶脫氨基活性的逐步增高導(dǎo)致siRNA的生成減少而受到抑制。dsRNA的長度限制性：引發(fā)有效RNAi的dsRNA最短不得短于21nt，Dicer能與200-500nt范圍內(nèi)的dsRNA結(jié)合，底物片段越短，Dicer酶的活性也就越弱，提示RNAi具有dsRNA片段長度限制性。RNAi的遺傳性：1998年Fire等就發(fā)現(xiàn)在線蟲中RNAi可以傳代，以后Worby等人在果蠅的培養(yǎng)細胞中也發(fā)

29、現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。線蟲中的RNAi遺傳性需要de-1和de-2來啟動。傳播性：RNAi效應(yīng)可以在細胞間擴散，dsRNA可在果蠅細胞群落之間傳播，在線蟲局部注射dsRNA也可傳播到整個機體。Van等研究發(fā)現(xiàn)sid-1基因編碼一種具有十一次跨膜蛋白可能與此現(xiàn)象有關(guān)。ATP依賴性：在去除ATP的樣品中RNAi現(xiàn)象降低或消失，顯示RNAi是一個ATP依賴的過程，可能與Dicer和RISC的酶切反應(yīng)必須由ATP提供能量有關(guān)。模板選擇性：RNAi只有效作用于外顯子，而對內(nèi)含子無影響。dsRNA序列是某個基因的啟動子序列時也沒有明顯的效應(yīng)。另外，RNAi 對穩(wěn)定并豐富表達的靶基因抑制效率也不高。RNAi的生物

30、學(xué)意義及其應(yīng)用編輯本段回目錄RNAi的生物學(xué)意義主要是維持基因組穩(wěn)定、抑制轉(zhuǎn)基因表達和保護基因組免受外源核酸侵入。研究證實RNAi缺陷可引起內(nèi)源性轉(zhuǎn)座子的移動。轉(zhuǎn)座子沉默與DNA甲基化、H3mK9(histone H3 lysine-9 methylation)和RNAi有關(guān)，大多數(shù)轉(zhuǎn)座子沉默與met1(DNA methyltransferase)、ddm1(decrease in DNA methylation 1)和sil1(Streptomyces subtilisin inhibitor-like 1)有關(guān)，而很少的轉(zhuǎn)座子沉默需要KRYPTONINE（H3K9 methyltransf

31、erase）、ARGONAUTE1（RNAi gene）和CHROMOMETHYLASE3（CXG methyltrasferase）。Hall等研究表明，著絲粒同源重復(fù)序列和RNAi組分一起正負調(diào)節(jié)著異染色質(zhì)的形成并且共同促使異染色質(zhì)組裝成核。最近研究發(fā)現(xiàn)，RNAi需要的一種 AGO蛋白TbAGO2與細胞有絲分裂和染色體分離有關(guān)。dsRNA還出現(xiàn)在許多病毒（包括單鏈RNA病毒）感染的細胞內(nèi)，誘發(fā)RNAi而封閉病毒生存和繁殖所必需的基因或激發(fā)干擾素誘導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)。RNAi還可能在胚胎發(fā)育過程中具有重要功能，也可能參與了生物體正常的基因表達調(diào)控，同時與基因印跡也有關(guān)。RNAi是一種高效的特異性

32、強的基因阻斷技術(shù)，近年來發(fā)展迅速，很快就成為功能基因組研究的有力工具。通過實驗手段將dsRNA分子導(dǎo)入細胞內(nèi)，特異性地降解細胞內(nèi)與其序列同源的mRNA，封閉內(nèi)源性基因表達，從反向遺傳的角度研究人類或其他生物基因組中未知基因的功能。早期就有人應(yīng)用此項技術(shù)分離了果蠅胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通路中的各種成分。近來也有實驗報道通過RNAi研究細胞內(nèi)脂質(zhì)平衡過程中涉及的各條途徑。在這之前，曾利用反義RNA與靶mRNA序列互補的特性來抑制其表型的發(fā)生，但由于反義RNA對內(nèi)源性表達的基因抑制作用較弱，往往會產(chǎn)生一些過渡表型，易造成對基因功能判斷錯誤，目前已通過審批認為臨床上具有治療作用的僅有一種藥物Vitrave

33、ne。RNAi技術(shù)與之相比，特異性更高，作用更迅速，副反應(yīng)小，在有效地沉默靶基因的同時，對細胞本身的調(diào)控系統(tǒng)也沒有影響。最近在人類體細胞里已經(jīng)成功地對近20種基因功能進行了“敲除”，尤其是因此而了解了人類空泡蛋白Tsg101對HIV在人體內(nèi)增殖的作用，進一步深化了對HIV的研究。Leonid等以脊髓灰質(zhì)炎病毒為模型，利用RNAi來誘導(dǎo)細胞的胞內(nèi)免疫，產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)，尤其是針對RNA病毒。對于易突變的病毒，可設(shè)計多種靶向病毒基因保守序列的dsRNA，減少它對dsRNA的抵抗。Maen等也應(yīng)用RNAi技術(shù)成功地阻斷了MCF7乳腺癌細胞中一種異常表達的與細胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因Sp21的功能

34、。RNAi技術(shù)的應(yīng)用，不僅能大大推動人類后基因組計劃(蛋白組學(xué))的發(fā)展，還有可能設(shè)計出RNAi芯片，高通量地篩選藥物靶基因，逐條檢測人類基因組的表達抑制情況來明確基因的功能，并且它還將應(yīng)用于基因治療、新藥開發(fā)、生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域，用RNAi技術(shù)來抑制基因的異常表達，為治療癌癥、遺傳病等疾病開辟了新的途徑。具體可用于以下幾個方面：1 基因功能分析基因敲除技術(shù)需要較長時間去永久性的關(guān)閉某個基因的表達，而RNAi技術(shù)則可在一周內(nèi)、甚至2天內(nèi)可控性的關(guān)閉10個基因。RNAi技術(shù)還具有一個優(yōu)勢，能同時封閉多個基因或基因家族，用于研究mRNA差別剪接形成的異構(gòu)體，甚至在基因組水平上構(gòu)建針對基因組的RNAi

35、表達載體，用于研究基因之間的相互作用和進行基因功能的高通量篩查。使用RNAi技術(shù)在那些低等生物中基因組功能測定都已基本結(jié)束。在哺乳動物和人類基因的功能研究中，Harborth等利用脂質(zhì)體及質(zhì)粒分別將編碼核纖層蛋白1或2、NUP153、GAS41、ARC21、胞質(zhì)動力蛋白、蛋白激酶cdk1、或肌動蛋白以及非必須結(jié)構(gòu)基因emerin和zyxin的siRNA轉(zhuǎn)染到Hela、SS6細胞和大鼠F5、FR成纖維細胞內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述基因的功能表現(xiàn)與以往使用基因剔除法獲得的信息一致。Sui等應(yīng)用DNA載體體外構(gòu)建目的基因的siRNA，包括外源綠色熒光蛋白、內(nèi)源Lamin-A、Lamin-C、cdk-2和dnm

36、t-1基因，轉(zhuǎn)染Hela、H1229、C-33A、U-2OS細胞，結(jié)果顯示siRNA對目的基因的抑制作用均在86%以上。2 研究信號傳導(dǎo)通路的新途徑聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)，RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系，Clemens等應(yīng)用RNAi研究了果蠅細胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑，取得了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路完全一致的結(jié)果，在此基礎(chǔ)上分析了DSH3PX1（Docksrc homology 3 phox 1）與DACK（Drosophila activated Cdc42 tyrosine kinase）之間的關(guān)系，證實了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激

37、酶。3 新藥物的研究和開發(fā)RNAi還可以作為尋找新的藥物靶標的工具，可以高通量地發(fā)現(xiàn)藥物靶基因，幫助新藥物的研究和開發(fā)，了解藥物作用的生化模式等。Makimura等利用RNAi技術(shù)減少了丘腦下部AGRP（agouti-releted peptide）50%的表達量，AGRP使代謝率提高而不減少攝食量，從而減輕肥胖，為肥胖的治療提供了一個靶點。美國Genetica公司已將RNAi技術(shù)作為高通量藥物靶標識別和確認的工具。4 基因治療RNAi只抑制致病基因，而不影響正常等位基因的功能，具有較高的選擇性和特異性，能減少非特異作用引起的副作用。4.1 治療病毒感染可將RNAi視為一種與免疫系統(tǒng)類似的防御

38、機制，利用RNAi技術(shù)進行病毒感染的干擾實驗已在植物及低等生物中取得滿意的結(jié)果，但在人體細胞內(nèi)的實驗才剛剛起步。已有研究表明，用siRNA抑制HIV的某些基因，如p24、vif、nef、tat或rev可阻礙HIV在細胞內(nèi)復(fù)制；抑制HIV的受體CD4和CD8a或輔助受體CXCR4或CCR5或病毒結(jié)構(gòu)Gag蛋白表達可阻礙HIV感染細胞。所以應(yīng)用siRNA可能成為防止HIV-1感染的一種有效手段。Hamasaki等構(gòu)建的siRNA特異性表達載體與HBV病毒DNA共轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HuH7和HepG2，降低了RNA及其復(fù)制中間體的水平，并引起HBeAg分泌的下降。最近，Song等通過RNAi技術(shù)使Fas

39、基因沉默，成功地在自身免疫性肝炎小鼠模型中預(yù)防了肝衰竭和肝纖維化。4.2 治療腫瘤腫瘤發(fā)生是多基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計針對這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個基因同時沉默的效應(yīng)，也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關(guān)的基因同時沉默。Cioca等利用粒細胞白血病細胞系研究了Raf-1 和bcl-2基因在白血病中的作用，表明RNAi能誘導(dǎo)細胞凋亡并能提高腫瘤細胞對化學(xué)治療的敏感性。Zhang等將針對鼠源VEGF

40、（Vascular Endothelial Growth Factor）各亞型基因的siRNA構(gòu)建成的RNAi表達載體，均特異性抑制了各亞型VEGF的表達，有效的抑制了腫瘤細胞的生長。-連環(huán)蛋白和APC基因是Wnt信號通路中的重要組分，突變后引起細胞異常增殖，在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。Verma等利用RNAi技術(shù)使這兩個基因表達降低，在細胞和裸鼠中都能抑制腫瘤細胞的增殖。以erbB1、端粒酶為靶點，利用RNAi技術(shù)抑制腫瘤的研究也取得了滿意結(jié)果。5 其它應(yīng)用RNAi還可用于細胞周期調(diào)控、代謝、膜轉(zhuǎn)運以及DNA損傷反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄或甲基化等多種方面的基因功能研究。最新研究發(fā)現(xiàn)，用RNAi技術(shù)阻斷rdp

41、1(為ErbB3成員)、BRUCE（為一個530kDa的膜相關(guān)凋亡蛋白抑制因子）、Chk1、Wee1和Myt1等進一步解釋了細胞凋亡的機制，其中BRUCE通?？梢种频蛲?，而rdp1在凋亡初始階段起到特別重要的作用。RNAi相關(guān)術(shù)語編輯本段回目錄1.RNAi ：（RNA interference）RNA干擾一些小的雙鏈RNA可以高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi ，也譯作RNA干預(yù)或者干涉）。它也是體內(nèi)抵御外在感染的一種重要保護機制。2.siRNA：(small interfering

42、RNAs)小干擾RNA一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾途徑（RNA interference pathway）。3.shRNAsRNA-Short hairpin RNAs)短發(fā)夾RNA是設(shè)計為能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小RNA分子，短發(fā)夾RNA能夠通過RNA干擾來抑制基因的表達。Thomas Rosenquists group和Greg Hannons group聯(lián)合研究了在哺乳動物種系細胞中shRNAs的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致基因長時間穩(wěn)定沉默的機制。4.bpBase Pair)堿基對兩個堿基（A和T，或者C和G）之間靠氫鍵結(jié)合在一起

43、，形成一個堿基對。DNA的兩條鏈就是靠堿基對之間的氫鍵連接在一起，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。5.Base sequence:堿基序列DNA分子中堿基的排列順序。6.Base Sequence Analysis:堿基序列分析分析出DNA分子中堿基序列的方法（這種方法有時能夠全自動化） cDNA：參見互補DNA。7.cDNA：互補DNA以信使RNA為模板合成的DNA，常常采用互補DNA的一條鏈作為繪制物理圖譜時的探針。8.Complementary sequence：互補序列以一條核苷酸鏈為模板，根據(jù)堿基互補規(guī)則形成的互補鏈，稱為該模板的互補序列。9.Genomic Library：基因組文庫對某個染色體，

44、制備隨機產(chǎn)生的、相互之間有重疊部分的片段的克隆。10.RISC：（RNA-induced silencing complex）RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物在RNAi 效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物。激活RISC需要一個ATP依賴的將siRNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3端12個堿基的位置切割mRNA(3, 18, 27, 29)。盡管切割的精確機制現(xiàn)在還是未知，研究表明每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。11.Dicer：Dicer酶RNaseIII家族中特異識別雙鏈R

45、NA的一員，能以一種ATP依賴的方式逐步（processive）切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為1921bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片斷的3端都有2個堿基突出(27, 28)。12.PTGS：(Post-transcriptional Gene Silencing ,PTGS)轉(zhuǎn)錄后基因沉默部分的植物中的基因沉默是在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生的。它是相對于部分植物中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄階段的基因沉默（TGS）而言的。13. TGS：（transcriptional gene silencing）轉(zhuǎn)錄階段基因沉默14.gene silence:基因沉默研究結(jié)果

46、發(fā)現(xiàn)有大量的轉(zhuǎn)基因植株不能正常表達，通常這并不是由于轉(zhuǎn)基因的缺失或突變引起的，而是基因失活的結(jié)果.這種失活的現(xiàn)象稱為基因沉默。15.RNA transfection：RNA轉(zhuǎn)染。16.Sense RNA：正義鏈RNA17.Antisense RNA：反義鏈RNA。18.19 2 2 nt siRNA：在細胞中雙鏈RNA一般都被切割成21-23小片段，這樣的RNA片段能達到更好的RNAi 作用。人工合成的siRNA也是依據(jù)這個原理，所合成的RNA就是19nt的堿基序列再加上兩端的識別序列如-GG，-TT等。19.SECssiRNA expression cassettes)siRNA表達框架一種

47、由PCR得到的siRNA表達模版，能夠直接導(dǎo)入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。20.Homologies：同源性指同種類不同個體或者不同種類個體之間的，染色體或者蛋白質(zhì)序列的相似性 21.Homologous Chromosome：同源染色體一對染色體，分別來自父本和母本，染色體上有著相同的線性基因序列。22.Recombinant Clone：重組克隆將不同來源的DNA片段合成在一個DNA分子中，這種技術(shù)稱為重組，得到的分子為重組克隆。23.Ribonucleic acid：核糖核酸RNA從細胞的細胞核和細胞質(zhì)部分分離出來的化學(xué)物質(zhì)。在蛋白質(zhì)合成和其他生化反應(yīng)中起著重要作用，RNA的結(jié)構(gòu)

48、和DNA的結(jié)構(gòu)類似，都是有核苷酸按照一定順序排列成的長鏈。RNA可以分為信使RNA、轉(zhuǎn)運RNA、核糖體RNA以及其他類型的RNA。 24.rRNA：（RNARibonsomal RNA，核糖體）存在于核糖體中的RNA。25.Ribonsome：核糖體細胞質(zhì)中含有rRNA和相關(guān)蛋白質(zhì)的細胞器，是蛋白質(zhì)的合成場所。 26.Transformation：轉(zhuǎn)化將外源DNA整合到某一細胞基因組中的過程。27.Entrez：美國國家生物技術(shù)信息中心所提供的在線資源檢索器。該資源將GenBank序列與其原始文獻出處鏈接在一起。28.NCBI：(National Center for Biotechnolog

49、y Information)美國國立生物技術(shù)信息中心為美國國家醫(yī)學(xué)圖書館（NLM）和國家健康協(xié)會（NIH）下屬部門之一，1988年設(shè)立。主要提供生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的信息學(xué)服務(wù)，如世界三大核酸數(shù)據(jù)庫之一的GenBank數(shù)據(jù)庫，PubMed醫(yī)學(xué)文獻檢索數(shù)據(jù)庫等。29.GenBank：NIH的基因序列數(shù)據(jù)庫是所有公開的DNA序列的集合 ( Nucleic Acids Research 1998 Jan 1;26(1):1-7). 截至1998年12月，GenBank大約收集了 2,162,000,000 個堿基、3,044,000 個序列。30.Ribosomal RNA：(核糖體RNA，簡寫為rRNA)

50、是一組存在于核糖體中的RNA分子。31.UniGene：美國國家生物技術(shù)信息中心提供的公用數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫將GenBank中屬于同一條基因的所有片斷拼接成完整的基因進行收錄。32.BLAST:(Basic Local Alignment Search Tool)基本的基于局部對準的搜索工具一種快速查找與給定序列具有連續(xù)相同片斷的序列的技術(shù)。是一個序列比對Alignment應(yīng)用程序。它可以在線選擇服務(wù)器上的數(shù)據(jù)庫進行序列比較包括DNA/DNARNA/DNA蛋白/蛋白序列比對序列比對的作用很多如同源核酸或蛋白序列的查找引物或探針特異性分析物種進化樹的構(gòu)建等等目前多數(shù)網(wǎng)站和軟件均提供免費的BLAST

51、的本地或在線檢索比較著名的提供序列比對服務(wù)有NCBI的BLAST檢索如果需要詳細了解這個程序可到/BLAST/去具體看一看幫助文件但是上NCBI需要國際代理國內(nèi)的朋友可通過上海生科院的生物信息中心進行BLAST網(wǎng)址:8888/blast/ 速度不錯 33.RT-PCR:逆轉(zhuǎn)錄PCRRT-PCR是以RNA為起始材料經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲取目的基因或檢測基因表達。34.DNA印跡雜交:（DNA blot hybridization）有兩種核酸印跡法： 將D

52、NA或RNA溶液直接點樣于硝酸纖維素膜或尼農(nóng)膜上（斑點或狹線印跡） 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將片段的DNA或RNA轉(zhuǎn)移到膜上（Southern和Northern印跡法）。DNA在電泳前先用限制性內(nèi)切酶消化。35.RNA印跡雜交:（RNA blot hybridization）RNA印跡雜交是一種檢測已固定在濾膜上的總RNA或mRNA特定靶序列的技術(shù)。36.RNA酶控制：在實驗中前期的質(zhì)粒的構(gòu)建和提取是要用到RNAse A這種酶的存在會降解后期要轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)的RNA 如果前期出現(xiàn)了這個酶的污染就會導(dǎo)致后期實驗的失敗，而后期轉(zhuǎn)錄是又要用到其他的RNA酶，如RNA 聚合酶3等，因此在實驗中嚴格控制好RNA酶是R

53、NA實驗的關(guān)鍵，具體的做法是做到DNA，RNA移液器的專用，DNA實驗室和RNA實驗室的物品和器械分開使用，將實驗室中的任務(wù)污染源減少至最低。RNAi技術(shù)關(guān)鍵問題編輯本段回目錄低等生物對dsRNA或siRNA導(dǎo)入的條件要求較低，成功率較高，但對較高級的哺乳動物和人類細胞株的轉(zhuǎn)染成功率卻不理想。哺乳動物的細胞對dsRNA的導(dǎo)入具有抗拒性，并且值得注意的是大于30bp 的dsRNA導(dǎo)入哺乳動物細胞可誘導(dǎo)干擾素的合成結(jié)果是非特異性的和全面的抑制基因表達，最終導(dǎo)致細胞凋亡；同時dsRNA具有濃度依賴性，dsRNA誘發(fā)的RNAi效應(yīng)的強度隨著其濃度的增高而增強，但是濃度過高RNAi效應(yīng)也會降低等。RNA

54、i在哺乳動物中的實驗遇到的另一問題是RNAi衰減現(xiàn)象，siRNA被導(dǎo)入細胞后RNAi效應(yīng)僅持續(xù)數(shù)天便逐漸消失。此外RNAi技術(shù)和反義RNA技術(shù)一樣，有一些如寡聚核酸合成困難、易被降解、導(dǎo)入困難等相似的缺點。(1)dsRNA序列的選擇dsRNA主要選自已知的cDNA的開放閱讀框架(ORF)中的基因區(qū)域。為防止mRNA調(diào)控蛋白對RISC與靶RNA結(jié)合的干擾，應(yīng)避免選擇包括:1)起始密碼子下游或終止密碼的50100核苷酸位置以內(nèi)的區(qū)域；2)5或3端的非翻譯區(qū)域；3)內(nèi)含子區(qū)域。此外，序列選擇時也應(yīng)避開多聚鳥苷酸序列區(qū)(3個)，因為這樣容易形成四聚體結(jié)構(gòu)，抑制RNAi作用。選擇與靶mRNA上序列互補的

55、2123個核苷酸長度的片段，以AA開頭為佳，因為此法能簡化dsRNA合成過程，降低成本，而且合成的dsRNA能更好地抵抗RNA酶的降解。另外，盡量使dsRNA序列中的GC含量接近50%(45%55%最佳)，高GC含量能明顯降低基因沉默的效應(yīng)。選擇前可以搜索BLAST數(shù)據(jù)庫，保證無其他與靶基因同源的基因存在，避免引起對其他相似基因的沉默作用。并不是所有的mRNA均對RNAi敏感。為確保靶基因表達的有效抑制，最好同時合成兩個或以上的針對同一基因的不同靶區(qū)域的dsRNA；而且，標記dsRNA正義鏈的3端對RNAi現(xiàn)象并沒有影響，現(xiàn)有的實驗尚未發(fā)現(xiàn)mRNA的二級結(jié)構(gòu)對RNAi有任何顯著的影響。目前，R

56、NAi技術(shù)主要以哺乳動物細胞為對象研究其基因的功能。但30bp的dsRNA在哺乳動物細胞中會引起干擾素樣效應(yīng)，導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。因而直接選用其下游的產(chǎn)物分子siRNA來代替，達到基因研究的目的。(2)dsRNA的導(dǎo)入方法不同的生物體可以選擇不同的方法。簡單生物，如單細胞生物等，可選用電穿孔的方法；較復(fù)雜生物可選用dsRNA微注射入生殖細胞或早期胚胎，線蟲也能采用腸道或假體腔注射的方法，與微注射相比，RNAi效率上并無顯著差別。還有浸泡法、工程菌喂養(yǎng)法、磷酸鈣共沉淀法等。若使用的是化學(xué)法人工合成的siRNA(正義鏈和反義鏈)，還要經(jīng)過退火過程，以雙鏈的形式導(dǎo)入靶細胞。有人提出了以質(zhì)?；虿《緸檩d體

57、，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染途徑，在細胞內(nèi)以DNA為模板，利用RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄為siRNA(直接形成雙鏈或通過回文序列折疊后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu))，也能產(chǎn)生較明顯的RNAi效應(yīng)。最近，又有一種新的導(dǎo)入方法，就是借助高壓水槍的外力將構(gòu)建的質(zhì)粒直接自小鼠的尾靜脈注入體內(nèi)，觀察RNAi在活體生物模型而不是培養(yǎng)細胞上的基因沉默效應(yīng)，但觀察到的siRNA的半衰期較短，而且由于使用了高壓的外力，過程較復(fù)雜，限制了其在人類疾病治療方面的應(yīng)用。而Pachuk等則提出了肌注的方法，將針對IL12的siRNA的質(zhì)粒表達載體導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，得到的RNAi效應(yīng)更持久。(3)發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的siRNA實驗證明，發(fā)夾樣siRNA能延長在細胞內(nèi)的

58、作用時間。此類結(jié)構(gòu)可由具有回文序列的核苷酸鏈形成。但通?；匚慕Y(jié)構(gòu)不易獲得，也可用頭碰頭的對稱序列來代替。轉(zhuǎn)錄發(fā)夾樣siRNA的模板必須與載體轉(zhuǎn)錄啟動子緊密相連，而且盡可能有最短的多聚腺苷酸尾巴，這樣才能誘導(dǎo)高效的RNAi效應(yīng)。Paddison等提出類似的結(jié)構(gòu)也可應(yīng)用于長片段dsRNA(500bp左右)，而不會引起RNA非特異性的降解。這為檢測哺乳動物細胞中經(jīng)過長期發(fā)育后的基因功能提供了新的途徑。RNAi抑制病毒研究技術(shù)路線編輯本段回目錄RNAi最主要的作用是一小段（大約21-23bp）的雙鏈RNA分子（double-strainded RNA,dsRNA）它介導(dǎo)細胞內(nèi)序列特異性基因表達阻斷或封閉，也就是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）,從而起到控制細胞的各種高級生命活動。1. RNAi的作用水平RNAi是在多重水平上發(fā)揮作用的。最先在華麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，dsR