第五章繼代培養(yǎng)ppt課件

1、第五章第五章 繼代培育繼代培育一、細胞脫分化與愈傷組織一、細胞脫分化與愈傷組織: : 培育條件下使一個已分化的細胞回復到培育條件下使一個已分化的細胞回復到原始無分化形狀或分生細胞形狀的過程就是原始無分化形狀或分生細胞形狀的過程就是細胞脫分化。細胞脫分化。 脫分化后的細胞，經(jīng)過細胞分裂，產生脫分化后的細胞，經(jīng)過細胞分裂，產生無組織構造、無明顯極性的、松散的細胞團無組織構造、無明顯極性的、松散的細胞團稱為愈傷組織。稱為愈傷組織。愈傷組織的特征愈傷組織的特征: : 愈傷組織細胞大而不規(guī)那么，高度液泡化、沒愈傷組織細胞大而不規(guī)那么，高度液泡化、沒有次生細胞壁和胞間連絲。愈傷組織從其外表向內有次生細胞壁

2、和胞間連絲。愈傷組織從其外表向內5-105-10個細胞是分生中心，細胞體積明顯的小，有胞個細胞是分生中心，細胞體積明顯的小，有胞間連絲和果膠質。這一分生中主是愈傷組織增殖的間連絲和果膠質。這一分生中主是愈傷組織增殖的主要部位。主要部位。二、愈傷組織構成的條件二、愈傷組織構成的條件: : 愈傷組織誘導的成敗關鍵主要不是外植體愈傷組織誘導的成敗關鍵主要不是外植體的來源和種類的來源和種類, ,而是培育條件而是培育條件, ,其中激素的種其中激素的種類和濃度最為重要類和濃度最為重要. . 誘導愈傷組織常用的生長素是誘導愈傷組織常用的生長素是2,4-D,IAA 2,4-D,IAA 和和 NAA.NAA.常

3、用的細胞分裂常用的細胞分裂素是素是KTKT和和6-BA.6-BA. 在禾谷類植物中，多數(shù)情況下只用在禾谷類植物中，多數(shù)情況下只用2,4-D2,4-D就能勝利地誘導愈傷組就能勝利地誘導愈傷組織，但假設以織，但假設以NAANAA替代替代2,4-D 2,4-D ，外植體那么只會生根，而不愈傷化。，外植體那么只會生根，而不愈傷化。 當以煙草莖髓、胡蘿卜貯藏根和馬鈴薯塊莖組織作外植體時，誘當以煙草莖髓、胡蘿卜貯藏根和馬鈴薯塊莖組織作外植體時，誘導愈傷組織那么既需求生長素，也需求細胞分裂素。導愈傷組織那么既需求生長素，也需求細胞分裂素。三、愈傷組織構成的過程三、愈傷組織構成的過程 細胞脫分化過程中細胞構造

4、會發(fā)生急劇變化。細胞脫分化過程中細胞構造會發(fā)生急劇變化。這些變化總體上包括：這些變化總體上包括： 細胞質顯著變濃，大液泡消逝，核體積添加細胞質顯著變濃，大液泡消逝，核體積添加并逐漸移位至細胞中央，細胞器添加。液泡蛋白并逐漸移位至細胞中央，細胞器添加。液泡蛋白體的出現(xiàn)和質體轉變?yōu)樵|體被以為是細胞脫分體的出現(xiàn)和質體轉變?yōu)樵|體被以為是細胞脫分化的重要特征。化的重要特征。 根據(jù)愈傷組織構成過程的時空順序，可分為根據(jù)愈傷組織構成過程的時空順序，可分為三個階段：三個階段：第一階段為誘導期細胞分裂的預備期：第一階段為誘導期細胞分裂的預備期： 表現(xiàn)為細胞質增生，出現(xiàn)活潑的原生質流動，表現(xiàn)為細胞質增生，出現(xiàn)

5、活潑的原生質流動，貯藏物質淀粉等消逝；細胞內核糖體添加并構成貯藏物質淀粉等消逝；細胞內核糖體添加并構成大量多聚核糖體；大量多聚核糖體；RNARNA迅速合成和累積。迅速合成和累積。 此階段長短的決議要素：植物種類；同種植此階段長短的決議要素：植物種類；同種植物不同生理狀。如開場第一次細胞分裂所需時間：物不同生理狀。如開場第一次細胞分裂所需時間：菊芋塊莖未經(jīng)貯藏需菊芋塊莖未經(jīng)貯藏需22h,22h,貯藏后需貯藏后需40h40h；胡蘿卜；胡蘿卜- -96h.-96h.第二階段為分裂期細胞從開場分裂到繼續(xù)分裂的第二階段為分裂期細胞從開場分裂到繼續(xù)分裂的時期：時期： 細胞數(shù)目添加、體積變小、核和核仁變大、

6、細胞數(shù)目添加、體積變小、核和核仁變大、RNARNA含量繼續(xù)上升。從培育外植體的形狀變化來含量繼續(xù)上升。從培育外植體的形狀變化來看，表現(xiàn)為外層細胞迅速分裂。當細胞體積最小，看，表現(xiàn)為外層細胞迅速分裂。當細胞體積最小，細胞核和核仁最大，細胞內無大液泡細胞核和核仁最大，細胞內無大液泡,RNA,RNA含量最含量最高時，標志著細胞處于分裂頂峰時期。高時，標志著細胞處于分裂頂峰時期。第三階段為構成期：第三階段為構成期： 外植體細胞經(jīng)過誘導期和分裂期后構成了無外植體細胞經(jīng)過誘導期和分裂期后構成了無序構造的愈傷組織的時期序構造的愈傷組織的時期. . 生化變化生化變化-各種酶活性加強、淀粉的累積、各種酶活性加強

7、、淀粉的累積、RNARNA和組蛋白合成速度加快。和組蛋白合成速度加快。 構成期的特征構成期的特征-細胞形狀大小堅持相對穩(wěn)細胞形狀大小堅持相對穩(wěn)定，體積不再減小，愈傷組織不再增殖。定，體積不再減小，愈傷組織不再增殖。 優(yōu)良的愈傷組織通常必需具備以下優(yōu)良的愈傷組織通常必需具備以下4 4個特性中個特性中的的2-32-3個特性：個特性： A A 高度的胚性或再分化才干，以便從這些高度的胚性或再分化才干，以便從這些 愈傷組織中得到再生植株。愈傷組織中得到再生植株。 B B 容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu)容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu) 良的懸浮系，并且在需求時能從中分別良的懸浮系，并且在需求時能從

8、中分別 出全能性原生質體。出全能性原生質體。C C 旺盛的自我增殖才干，以便用這些愈傷旺盛的自我增殖才干，以便用這些愈傷 組織建立大規(guī)模的愈傷組織無性系。組織建立大規(guī)模的愈傷組織無性系。 D D 經(jīng)過長期繼代保管而不喪失胚性，以便經(jīng)過長期繼代保管而不喪失胚性，以便 能夠對它們進展各種遺傳操作。能夠對它們進展各種遺傳操作。四、四、 誘導愈傷組織時通常采用的戰(zhàn)略：誘導愈傷組織時通常采用的戰(zhàn)略：A A 選擇適當?shù)幕蛐秃瓦m當?shù)耐庵搀w。選擇適當?shù)幕蛐秃瓦m當?shù)耐庵搀w。B B 選擇正確的培育基，特別是正確的植物激選擇正確的培育基，特別是正確的植物激 素的種類和濃度，以及在需求配合運用生素的種類和濃度，以

9、及在需求配合運用生 長素和細胞分裂素時，二者之間正確的配長素和細胞分裂素時，二者之間正確的配 比。比。C C 采用某些特殊的理化要素改動愈傷組織誘采用某些特殊的理化要素改動愈傷組織誘 導培育基和培育條件。導培育基和培育條件。 在玉米幼胚愈傷組織培育中，一些研討在玉米幼胚愈傷組織培育中，一些研討者經(jīng)過在培育基中添加者經(jīng)過在培育基中添加5mg/L5mg/L或或10mg/L AgNO310mg/L AgNO3，抑制愈傷組織內乙烯的作用，從而使類型抑制愈傷組織內乙烯的作用，從而使類型IIII愈傷愈傷組織的頻率顯著提高。組織的頻率顯著提高。類型類型I I： 構造致密，生長較慢，容易分化成苗，構造致密，生

10、長較慢，容易分化成苗，稱為保守分裂型稱為保守分裂型. .類型類型IIII： 構造松脆，生長旺盛，色澤艷麗，增殖構造松脆，生長旺盛，色澤艷麗，增殖很快，稱為亢進分裂型很快，稱為亢進分裂型. .類型類型IIIIII： 構造疏松，生長緩慢，色澤暗淡，稱為衰敗構造疏松，生長緩慢，色澤暗淡，稱為衰敗型型. . 生長素促使細胞進入亢進形狀生長素促使細胞進入亢進形狀. . 細胞分裂細胞分裂素促使細胞進入保守形狀素促使細胞進入保守形狀. . 復原態(tài)氮氨態(tài)氮復原態(tài)氮氨態(tài)氮促進細胞分裂促進細胞分裂. . 硝態(tài)氮抑制細胞分裂硝態(tài)氮抑制細胞分裂. .六、繼代培育六、繼代培育1、愈傷組織在培育基上生長一段時間以后，由于

11、營、愈傷組織在培育基上生長一段時間以后，由于營養(yǎng)物質枯竭，水分散失，以及代謝產物的積累，必養(yǎng)物質枯竭，水分散失，以及代謝產物的積累，必需轉移到新穎培育基上培育。這個過程收繼代。繼需轉移到新穎培育基上培育。這個過程收繼代。繼代培育是繼初代培育之后的延續(xù)數(shù)代的擴繁培育過代培育是繼初代培育之后的延續(xù)數(shù)代的擴繁培育過程。程。 2、經(jīng)過繼代培育，可使愈傷組織無限期地保管持在、經(jīng)過繼代培育，可使愈傷組織無限期地保管持在不分化的增殖形狀。不分化的增殖形狀。 假設讓愈傷組織留在原來的培育基假設讓愈傷組織留在原來的培育基上繼續(xù)培育而不繼代，它們那么不可防上繼續(xù)培育而不繼代，它們那么不可防止地發(fā)生分化。止地發(fā)生分

12、化。 1、種子無菌播種在簡單營養(yǎng)培育基通常不用附、種子無菌播種在簡單營養(yǎng)培育基通常不用附加生長調理物質上可萌生產生無菌實生苗，加生長調理物質上可萌生產生無菌實生苗，可提供無菌外植體，這對難以進展外表消毒的可提供無菌外植體，這對難以進展外表消毒的植物組織培育意義更大由于種子相對耐外表植物組織培育意義更大由于種子相對耐外表消毒。消毒。2、種子培育可將無胚乳種子如蘭花無菌萌生、種子培育可將無胚乳種子如蘭花無菌萌生成苗。成苗。七、以種子作為外植體進展培育有何運用？七、以種子作為外植體進展培育有何運用？3、種子和胚軸培育可誘導胚性愈傷組織。、種子和胚軸培育可誘導胚性愈傷組織。4、種子和胚軸還可以在適當?shù)?/p>

13、培育基上、種子和胚軸還可以在適當?shù)呐嘤险T導腋發(fā)育，構成叢生芽。誘導腋發(fā)育，構成叢生芽。種子作為外植體的優(yōu)勢：種子作為外植體的優(yōu)勢：1、易獲得數(shù)量較多的外植體；、易獲得數(shù)量較多的外植體；2、耐消毒；、耐消毒； 3、操作簡單；、操作簡單；4、種子培育通常不受季節(jié)限制，如北方、種子培育通常不受季節(jié)限制，如北方冬季難以從野外進展枝條等外植體的采冬季難以從野外進展枝條等外植體的采集。集。缺乏之處：缺乏之處：1、許多植物種子為天然雜種，不同種子培育產生、許多植物種子為天然雜種，不同種子培育產生的后代能夠在基因型和表現(xiàn)型上存在較大差別，的后代能夠在基因型和表現(xiàn)型上存在較大差別，這對利用種子及實生苗進展微

14、繁有一定影響。這對利用種子及實生苗進展微繁有一定影響。2、不少熱帶亞熱帶種子為頑拗型種子，耐儲時間、不少熱帶亞熱帶種子為頑拗型種子，耐儲時間短，如芒果種子在自然情況下只需短，如芒果種子在自然情況下只需8天壽命。天壽命。一接種方式與生長察看一接種方式與生長察看1、普通外植體可將其一半或部分插入培育基中，、普通外植體可將其一半或部分插入培育基中，莖尖接種時應防止插入太多而引起缺氧；莖尖接種時應防止插入太多而引起缺氧；2、直生或斜向生長的植物資料離體培育時，應堅、直生或斜向生長的植物資料離體培育時，應堅持自然生長方向接種；有時為了促進側枝的構持自然生長方向接種；有時為了促進側枝的構成，莖尖接種時也可

15、以程度放置在培育基上；成，莖尖接種時也可以程度放置在培育基上；八、培育過程中出現(xiàn)的問題及其處理方法八、培育過程中出現(xiàn)的問題及其處理方法3、要定期對培育物進展察看和統(tǒng)計，根據(jù)培育物生、要定期對培育物進展察看和統(tǒng)計，根據(jù)培育物生長情況及時對培育基和培育條件做出調整；長情況及時對培育基和培育條件做出調整；4、培育過程中經(jīng)常會出現(xiàn)污染景象，要及時加以去、培育過程中經(jīng)常會出現(xiàn)污染景象，要及時加以去除；除；5、在繼代培育時一定要仔細檢查，防止將污染的資、在繼代培育時一定要仔細檢查，防止將污染的資料進展擴展增殖。料進展擴展增殖。二外植體褐變二外植體褐變 1、有些植物資料在接種后會從傷口處分泌出褐色、有些植物

16、資料在接種后會從傷口處分泌出褐色或黑色色素。這是由于外植體切割后，內部細胞與或黑色色素。這是由于外植體切割后，內部細胞與外界空氣直接接觸，組織中多酚氧化酶激活，多酚外界空氣直接接觸，組織中多酚氧化酶激活，多酚類化合物和單寧被氧化后主生醌類物質的緣故。類化合物和單寧被氧化后主生醌類物質的緣故。 2、當這些物質分散到培育基中時，會抑制外植體、當這些物質分散到培育基中時，會抑制外植體其他酶的活性，毒害外植體。其他酶的活性，毒害外植體。3、植物種類或基因型、外植體采集時間、采集部位及生理形、植物種類或基因型、外植體采集時間、采集部位及生理形狀、培育基成分、培育條件、繼代培育時間等都影響褐變的狀、培育基

17、成分、培育條件、繼代培育時間等都影響褐變的發(fā)生。發(fā)生。4、防止產生褐變的對策：、防止產生褐變的對策：1應盡能夠接種較大的外植體，采用鋒利的解剖刀并使切應盡能夠接種較大的外植體，采用鋒利的解剖刀并使切面垂直減少傷口面，防止對外植體切割損傷，或采用幼面垂直減少傷口面，防止對外植體切割損傷，或采用幼齡資料及分生部位或幼態(tài)部位外植體接種。齡資料及分生部位或幼態(tài)部位外植體接種。2盡能夠在初代培育中降低培育基中無機鹽和植盡能夠在初代培育中降低培育基中無機鹽和植物生長調理物質的濃度；物生長調理物質的濃度；3防止過高的溫度和過強的光照如采用散射防止過高的溫度和過強的光照如采用散射光；光；4在培育基中培育時間不

18、宜過長，盡能夠及時轉在培育基中培育時間不宜過長，盡能夠及時轉接到新穎培育基上，有時為了防止褐變每隔數(shù)小時接到新穎培育基上，有時為了防止褐變每隔數(shù)小時就轉接一次；就轉接一次；5外植體采集后用流水沖洗外植體采集后用流水沖洗30分鐘以上，在接種分鐘以上，在接種前先將外植體在無菌水中浸泡處置或在無菌水中切前先將外植體在無菌水中浸泡處置或在無菌水中切割；割；6運用液體培育基；運用液體培育基；7在培育基中參與以下成分：在培育基中參與以下成分： 活性炭：參與量為活性炭：參與量為0.2%3.0% 聚乙烯吡咯烷酮：聚乙烯吡咯烷酮：PVP,參與量為參與量為510 g/L 檸檬酸：參與量為檸檬酸：參與量為0.05%

19、0.5% 蕓香苷：參與量為蕓香苷：參與量為50100mg/L 硫代硫酸鈉：硫代硫酸鈉：20%溶液，參與量為溶液，參與量為5ml/L維生素維生素CL-半胱氨酸半胱氨酸谷氨酸谷氨酸精氨酸精氨酸天冬酰氨天冬酰氨硫脲硫脲三玻璃化苗景象三玻璃化苗景象1、苗芽玻璃化是一種異常生理景象，是植物組、苗芽玻璃化是一種異常生理景象，是植物組織培育中出現(xiàn)的半透明狀、畸形的試管苗?？椗嘤谐霈F(xiàn)的半透明狀、畸形的試管苗。2、其解剖特點是：、其解剖特點是：1整株植物矮小腫脹，呈半透明狀。整株植物矮小腫脹，呈半透明狀。2有時發(fā)育出在量短而粗的莖，節(jié)間很短或有時發(fā)育出在量短而粗的莖，節(jié)間很短或幾乎沒有節(jié)間，輸導組織雖然可看到

20、，但導管和幾乎沒有節(jié)間，輸導組織雖然可看到，但導管和管胞木質化不完全。管胞木質化不完全。3葉片厚而狹長，有時基部較寬，葉片伸展或葉片厚而狹長，有時基部較寬，葉片伸展或縱向卷曲，脆弱易折易碎，葉表短少角質層或蠟縱向卷曲，脆弱易折易碎，葉表短少角質層或蠟質，或蠟質發(fā)育不完全，無功能性氣孔。玻璃化質，或蠟質發(fā)育不完全，無功能性氣孔。玻璃化葉片不具有柵欄組織，僅有海綿組織。葉片不具有柵欄組織，僅有海綿組織。 許多木本植物如蘋果、松、李、梨等和許多木本植物如蘋果、松、李、梨等和草本植物如菊花、甜瓜、香石竹等的組織培草本植物如菊花、甜瓜、香石竹等的組織培育都會遇到玻璃化苗景象。育都會遇到玻璃化苗景象。3、

21、玻璃化景象發(fā)生的緣由、玻璃化景象發(fā)生的緣由1運用瓊脂濃度低的培育基或液體培育基；運用瓊脂濃度低的培育基或液體培育基；2水勢或容器的相對濕度過高；水勢或容器的相對濕度過高；3培育基中培育基中BA濃度過高、培育基消毒時間過長；濃度過高、培育基消毒時間過長；4采用幼嫩植物資料等。采用幼嫩植物資料等。 總之，培育基和培育條件不適宜、不平衡是試總之，培育基和培育條件不適宜、不平衡是試管苗玻璃化發(fā)生的直接緣由。管苗玻璃化發(fā)生的直接緣由。 4、降低和減輕玻璃化景象發(fā)生可采取的措施、降低和減輕玻璃化景象發(fā)生可采取的措施1添加瓊脂和或糖濃度；添加瓊脂和或糖濃度；2改善培育容器的氣體交換；改善培育容器的氣體交換；

22、3改善培育基的大量鹽類；改善培育基的大量鹽類；4降低降低BA程度；程度；5加強光照，適當降低溫度；加強光照，適當降低溫度；6防止采用容易產生玻璃化景象的瓊脂種類；防止采用容易產生玻璃化景象的瓊脂種類；7采用液固兩相培育基。采用液固兩相培育基。實驗六實驗六 愈傷組織的繼代培育愈傷組織的繼代培育【目的】【目的】2分分 了解愈傷組織繼代培育的根本原理，學習愈傷了解愈傷組織繼代培育的根本原理，學習愈傷組織繼代培育的方法。組織繼代培育的方法?！驹怼俊驹怼?8分分 愈傷組織在培育基上生長一段時間以后，由于愈傷組織在培育基上生長一段時間以后，由于營養(yǎng)物質枯竭，水分散失，以及代謝產物的積累，營養(yǎng)物質枯竭，

23、水分散失，以及代謝產物的積累，必需轉移到新穎培育基上培育，這個過程收繼代。必需轉移到新穎培育基上培育，這個過程收繼代。將初代培育所得到的愈傷組織切成小塊后接種到新將初代培育所得到的愈傷組織切成小塊后接種到新穎培育上培育即可增殖。穎培育上培育即可增殖。 【資料】【資料】 2分分 水稻種子誘導構成的愈傷組織水稻種子誘導構成的愈傷組織【實驗用品】【實驗用品】 3分分 1試劑：試劑： (1) NAA、瓊脂、蔗糖、瓊脂、蔗糖、2,4-D、甘露醇等、甘露醇等 (2) 繼代培育基繼代培育基 MS培育基含培育基含2-4，D 0.5mg /L+NAA 0.2mg/L+1%甘露醇甘露醇+3%蔗糖蔗糖+0.7%瓊脂

24、瓊脂 2器具：各種接種工具、超凈任務臺。器具：各種接種工具、超凈任務臺?！緦嶒灢襟E】【實驗步驟】 15分分1、按照要求配制繼代培育基；、按照要求配制繼代培育基；2、培育基和接種器具的滅菌和消毒；、培育基和接種器具的滅菌和消毒；3、在酒精燈旁，小心從初代培育瓶中取出愈傷組織，、在酒精燈旁，小心從初代培育瓶中取出愈傷組織，放到滅菌的培育皿中，用手術刀切除胚乳、胚芽和放到滅菌的培育皿中，用手術刀切除胚乳、胚芽和胚根等非愈傷組織成分，并將分別好的愈傷組織接胚根等非愈傷組織成分，并將分別好的愈傷組織接種到繼代培育基中，接種完后封好培育瓶口，帖上種到繼代培育基中，接種完后封好培育瓶口，帖上標簽，注明接種日

25、期、外植體稱號和培育基成分。標簽，注明接種日期、外植體稱號和培育基成分。4、在培育室中培育，、在培育室中培育，7天后察看愈傷組生長情況。天后察看愈傷組生長情況?！窘Y果與分析】【結果與分析】50分分1、記錄愈傷組織繼代的生長情況；、記錄愈傷組織繼代的生長情況； 生長情況好的愈傷組織的特點是：細胞分裂生長情況好的愈傷組織的特點是：細胞分裂快，構造疏松，顏色淺而透明?？?，構造疏松，顏色淺而透明。 2、記錄愈傷組織繼代的污染情況；、記錄愈傷組織繼代的污染情況； 污染率污染率()=(污染的資料數(shù)污染的資料數(shù)/總接種資料總接種資料數(shù)數(shù))1003、假設愈傷組織生長情況不好，請分析其能夠的、假設愈傷組織生長情況不好，請