免疫組化技術(shù)在婦科的臨床應(yīng)用

1、免疫組化技術(shù)在婦科的臨床應(yīng)用免疫組化的根本原理免疫組化是免疫組織化學(xué)技術(shù)的簡稱. 它是應(yīng)用抗原、抗體特異 性結(jié)合的原理,使用的抗體在病理切片上與相應(yīng)的抗原結(jié)合, 然 后把結(jié)合產(chǎn)物應(yīng)用組織化學(xué)的方法顯現(xiàn)出來, 使之可以在顯微鏡下觀 察得以確認.通常使用的顯色劑為聯(lián)苯胺,結(jié)合的抗體顯示為棕色顆 粒,所以把免疫組化成為“棕色革命.組成人體細胞分為假設(shè)干種,如：上皮細胞、神經(jīng)細胞、肌肉細胞、 血細胞等,每種細胞都有其特殊的結(jié)構(gòu)物質(zhì),每種細胞都有其特異功 能,每種功能又有其物質(zhì)根底.如：鱗狀上皮細胞通過角化物可以防 止機體水份的蒸發(fā)和外界病原體的侵入, 肌肉可以通過肌動蛋白使自 己收縮.突觸素可以傳導(dǎo)神

2、經(jīng)興奮,某些器官借以實現(xiàn)其功能的激素 受體,載有遺傳物質(zhì)的DNA全段一一基因等.現(xiàn)在人們都可以把這 些物質(zhì)純潔的別離出來,并把它們作為抗原免疫大鼠和家兔, 使之產(chǎn) 生相應(yīng)的抗體,人們再把每種抗體別離純化,就得到我們免疫組化應(yīng) 用的抗體.我們把這些抗體作用于病理切片,然后再通過染色,如果 切片上有這種抗體對應(yīng)的抗原,就會在切片上出現(xiàn)棕色顆粒,如果沒 有棕色顆粒,就說明沒有這種抗體的抗原,在顯微鏡下就一目了然.免疫組化標記在婦科腫瘤的應(yīng)用及其意義免疫組化以它的特異性和敏感性,結(jié)合組織學(xué)上的定位性已成為 多種腫瘤病理形態(tài)學(xué)診斷的新手段.這里需要說明的是雖然目前具有 診斷價值的腫瘤標記物有數(shù)百種之多,

3、但至今還沒有發(fā)現(xiàn)人體腫瘤的 特異性抗原,也就是說還沒有任何一種抗體能 100 %地確診一種腫 瘤.盡管如此,人們正是得到了一些與腫瘤相關(guān)的抗原, 存在于腫瘤 細胞的胞核、胞漿和胞膜上,它的存在或量變可以提升腫瘤的性質(zhì), 借以了解腫瘤的組織發(fā)生,細胞分化、細胞功能,以有助于腫瘤的診 斷,鑒別診斷、分類,判斷預(yù)后和指導(dǎo)臨床治療.目前具有診斷價值的腫瘤標記物雖已有數(shù)百種,但在臨床病理診斷常用的有50余種,其標記物有以下類型：一、腫瘤相關(guān)抗原這種抗原只存在腫瘤組織中,正常組織內(nèi)沒有或含量甚微.或其 為幾種類型腫瘤所共有,故又稱為腫瘤群體抗原,對判斷腫瘤的良、 惡性和起源均有一定幫助CA125對卵巢上皮

4、性腫瘤都有一定的表達,但主要對漿液性腫瘤陽性表達,卵巢粘液性腺癌CA125不表達.可以用于這兩種腫瘤的鑒別診 斷.CA125對子宮內(nèi)膜樣腫瘤透明細胞癌,未分化癌上皮成份也 是陽性表達.CEA癌胚抗原廣泛存在于各種上皮性腫瘤,大多數(shù)卵巢漿液性腫瘤不表達,而 卵巢粘液性腫瘤表達,在子宮內(nèi)膜樣腺癌,透明細胞癌,勃勒納氏瘤CEA都有不同程度的表達,在胃腸道惡性腫瘤中CEA也為陽性表達,所以卵巢庫肯勃氏瘤CEA也是陽性表達.AFP甲胎蛋白是胚胎卵黃囊細胞,胚胎肝細胞和胎兒腸道細胞合成的一種糖 蛋白,主要用于肝癌的診斷,在卵巢內(nèi)胚竇瘤、胚胎性癌,惡性畸胎 瘤都為陽性表達.二、細胞結(jié)構(gòu)抗原這種抗原可存在于正

5、常組織和腫瘤組織中,為某些組織細胞群所 特有,對判斷腫瘤起源有重要意義CK7:主要標記腺上皮和移行上皮.卵巢、肺、乳腺上皮CK7陽性表達.而結(jié)腸,前列腺和胃腸道上皮 CK7陰性表達.可用于卵巢癌與 胃腸道癌的鑒別診斷.CK20:主要標記胃腸道上皮、尿道上皮.卵巢粘液性囊腺癌CK20為陽性表達.子宮內(nèi)膜腺癌、宮頸鱗癌、乳腺癌、肺癌和卵巢非粘液 性腫瘤CK20均不表達.desmin 結(jié)蛋白為中間絲蛋白之一,分布于正常平滑肌細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞和 肌上皮細胞及其腫瘤中.結(jié)蛋白在良性肌源性腫瘤是強陽 性表達,而在平滑肌肉瘤中表達率僅為50%,另外在平滑肌瘤中結(jié)蛋白與波形蛋白Vimentin 是表

6、達間葉組織來源的腫瘤,上皮來源 腫瘤不含此蛋白,用于癌與肉瘤的鑒別,惡黑與癌的鑒別等的表達 呈反向關(guān)系,分化越好結(jié)蛋白陽性反響越強, 波形蛋白陽性反響弱或 陰性；反之,分化越差,結(jié)蛋白反響弱或陰性,而波形蛋白反響越強. 另外含有肌源成份的癌肉瘤,惡性中胚葉混合瘤,畸胎瘤中也存在結(jié) 蛋白S-100是一種可溶性酸性蛋白,主要存在于神經(jīng)組織、垂體、唾液腺等 組織,是神經(jīng)性腫瘤的主要標記.在惡黑及脂肪肉瘤為陽性表達 SMA肌動蛋白是一種標記平滑肌瘤的蛋白,主要用于診斷平滑肌瘤、血管平 滑肌瘤,平滑肌肉瘤以及肌上皮細胞.在乳腺腫瘤中以此抗體檢測導(dǎo) 管上皮肌上皮細胞陽性與否來判斷乳腺腫瘤的良、惡性.三、可

7、用于某些生殖細胞來源的腫瘤和妊娠有關(guān)的腫瘤的診斷,常用的有：內(nèi)分泌激素及其受體抗原包括肽類激素和類固醇激素兩種,以肽類激素抗原應(yīng)用較多,常用有胰島素、高血糖素、胃泌素、生長抑素、降鈣素等.類固醇激素有雌激素、孕酮、睪酮等.但此類激素在組織切片中保存困難,且在組織內(nèi)有多種結(jié)構(gòu)類似的激素前體, 不僅染色效果不 好,且難以正確判斷.所以多檢測其激素受體.如： ER 雌激素受 體、PR 孕激素受體四、腫瘤中病毒抗原HPV 人乳頭狀瘤病毒特別是 HPV16、18是宮頸癌主要致病病 毒,亦可用于頭頸部癌、前列腺癌和食管癌的研究HIV 人類免疫缺陷病毒即艾滋病病毒,表達于淋巴細胞、單核細 胞、巨噬細胞、濾泡

8、樹突狀細胞和 HIV感染的神經(jīng)膠質(zhì)細胞,主要 用于艾滋病的研究.另外還有HSV 單純性皰疹病毒等五、作為判斷預(yù)后的標記抗體C-erbB-2是一種癌基因蛋白質(zhì),存在于細胞膜上,該蛋白可加速細胞的運 動,參與細胞浸潤和轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié).在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi) 膜癌、胃癌陽性表達提示預(yù)后差.特別是乳腺癌陽性表達具有獨特的 預(yù)后價值,陽性表達者復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高,無瘤生存期及總生存期短. 宮頸腺癌C-erbB-2 陽性表達者盆腔淋巴轉(zhuǎn)移率和宮頸深肌層侵犯 率高于陰性組.P53 腫瘤抑制基因P53蛋白也是現(xiàn)代分子生物學(xué)中研究最多的蛋白質(zhì)之一,P53蛋白除具有細胞生長阻滯作用外,同時還參與細胞DNA的損傷

9、與修復(fù)、細胞生長與分化、誘導(dǎo)細胞調(diào)亡的過程,目前認為 P53是 生命科學(xué)領(lǐng)域中最重要的蛋白質(zhì)分子.P53是腫瘤抑制因子,但由于失活、突變使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,這在許多惡性腫瘤中可以見到 P53基因的突變,特別是結(jié)腸癌、直 腸癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、宮體癌、食道癌、胃癌、肝癌、乳腺 癌及膀胱癌尤為常見.另外對骨肉瘤、軟組織肉瘤、淋巴瘤及白血病 等惡性腫瘤細胞中也可見到.研究證實,P53突變與腫瘤大小正相關(guān),與分化程度、病人的總生存期和無瘤生存期呈負相關(guān).P53突變腫瘤復(fù)發(fā)率和死亡率明顯高于陽性者.且 P53突變與腫瘤血管侵 襲呈明顯相關(guān).在多種惡性腫瘤中突變性P53蛋白表達水平升高,用免疫組化

10、可以檢測到,所以我們?nèi)砸?P53陽性表達來預(yù)測患者的預(yù)后、術(shù)后 易復(fù)發(fā)等指標.P53陽性表達與癌前病變的關(guān)系也極為密切,在宮頸和食管非典 型增生中均可檢測出P53蛋白.PCNA 增殖細胞核抗原是一種僅在增殖細胞中合成或表達的核內(nèi)多肽. PCNA陽性 表達與細胞增殖活性有關(guān),可做為細胞增殖狀態(tài)的一個重要指標. 在 惡性腫瘤中PCNA陽性表達提示有腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后不佳.Ki-67是一種與細胞增殖有關(guān)的核抗原,位于胞核中.Ki-67增殖指數(shù)上下即陽性表達與許多腫瘤的分化程度、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān),因此被廣泛做為各種惡性腫瘤必檢工程之一. ER、PR是乳腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌、宮頸癌、卵巢癌等

11、必檢工程之一.ER、PR陽性與否與病人術(shù)后化療方案的選擇和內(nèi)分泌治療以至于腫 瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后都密切相關(guān).ER、PR陽性者,內(nèi)分泌、化療治療效果好,復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率少,緩解期長,生存率高.六、腫瘤多耐藥基因在臨床腫瘤治療中,經(jīng)常有這樣的情況：同一種腫瘤,使用同一 個治療方案,或同一個病人,化療之初和化療后期,其效果迥異.這 種情況決定性原因是腫瘤細胞內(nèi)是否存在或產(chǎn)生了多耐藥性.多耐藥性基因編碼蛋白可以把化療藥從細胞內(nèi)泵到細胞外,從而預(yù)防了化療藥對細胞的破壞.研究說明,癌細胞有六種耐藥途徑,通俗點說：化療藥物要制服、 殺滅癌細胞,而癌細胞有強大對抗方法,使化療藥物奈何不了它,這 樣,癌細胞仍可肆

12、無忌彈地增生,最后到達危及健康與生命的目的. 所以每一位化療病人在治療前都應(yīng)該檢查腫瘤的耐藥性,如果陽性, 可以使用逆轉(zhuǎn)劑,提升腫瘤細胞對化療物的敏感性 Pg糖蛋白它是多耐藥基因產(chǎn)物,作用“藥泵功能,引起癌細胞產(chǎn)生 耐藥.容易產(chǎn)生耐藥抗藥藥物主要有長春新堿、長春花堿、阿霉素、 柔紅霉素、表阿霉素、米托蔥釀、紫杉醇、VP16等.陽性表達+ 以上有意義,對腫瘤病人選擇化療方案和愈后判斷具有重要的臨床意 義.MRP3多耐藥相關(guān)蛋白,主要用于非 Pg糖蛋白腫瘤細胞系的腫瘤耐藥 性的研究.容易產(chǎn)生耐藥的抗藥藥物主要有阿霉素、柔紅霉素、表阿 霉素、長春新堿、長春花堿、VP16.常見婦科腫瘤免疫組化檢測應(yīng)用

13、舉例日常工作中根據(jù)每位病人,不同腫瘤類型從診斷、鑒別診斷、 探討組織來源、內(nèi)分泌治療及化療前腫瘤多耐藥基因及病人的愈后等 多方面選擇一組免疫組化抗體以到達輔助診斷的目的. 子宮內(nèi)膜腺癌ER、 PR、 Ki-67 、 P53 漿液性乳頭狀腺癌過表達、 PCNA、PTEN、MRP3、Pg 糖蛋白PTEN是一種腫瘤抑制基因,在維持細胞增殖、分化和調(diào)亡平 衡起著重要作用,該基因在許多腫瘤表現(xiàn)突變和喪失. 子宮內(nèi)膜腺癌 的發(fā)生一局部是與持續(xù)與過多雌激素有關(guān),病人有不排卵、不孕及子宮內(nèi)膜增生過長的病史.PTEN常為陽性表達,提示預(yù)后較好.有些 內(nèi)膜癌患者無雌激素增高,有正常排卵,卵巢功能正常.很多絕經(jīng)多

14、年的老年婦女,癌周內(nèi)膜多顯萎縮,說明無雌激素影響,這種內(nèi)膜腺 癌發(fā)生機制尚不清楚,PTEN的陰性表達提示腫瘤惡性程度高, 預(yù)后 差.子宮平滑肌肉瘤SMA、P53、結(jié)蛋白、 波形蛋白、PCNA、CD10、Ki-67、MRP3、Pg糖蛋白.子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤ER、PR、CD10、波形蛋白、desmin 、SMA、P53、Ki-67、 MRP3、Pg糖蛋白宮頸浸潤性鱗癌廣譜 CK、P16、HPV16、P53、Ki-67、MRP3 Pg 糖 蛋白.P16是一種重要的抑癌基因,當(dāng) P16基因突變和喪失時細胞增 殖失控使細胞無限制增殖而發(fā)生腫瘤. 在宮頸上皮內(nèi)瘤變及癌的發(fā)生 是以P16陽性表達為特征,這與宮

15、頸上皮內(nèi)瘤變與宮頸癌是由HPV感染所造成細胞不死性有關(guān).宮頸鱗形細胞原位癌及早期浸潤除以上幾項外再加IV型膠原蛋白、層粘蛋白卵巢漿液性腺癌CA125、EMA、CEA、P53、Ki67、MRP3、 Pg 糖蛋白卵巢粘液性腺癌CK7 CK20 CEA EMA CA125S-100P53 Ki-67MRP3、Pg糖蛋白卵巢卵泡膜細胞瘤Vimentin(+)( 但無法與纖維瘤區(qū)別)因瘤細胞漿內(nèi)含類脂質(zhì),用脂 肪染色可證實乳腺浸潤性癌ER、PR、SMA、P63、E-ca、P53、Ki-67、C-erbB-2、MRP3、 Pg-糖蛋白惡黑S-100 , HMB-45 , NSE免疫組化染色是通過一系列環(huán)節(jié)

16、及過程. 包括組織的固定,脫水, 包埋,切片,各種抗體合理的稀釋度,孵育時間及溫度,各種有關(guān)溶 液的濃度和PH值等等,使抗體抗原更好保存并有效地結(jié)合, 再通過 顯色液顯現(xiàn)出來,最后用蘇木素襯染,每一步驟和環(huán)節(jié)都必須認真處 理,一步過失全部失敗.常用的方法有S-P法、PAP法,ABC法.目前常用的是S-P法, 即鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化物法.此法可產(chǎn)生低背景,高放大效 果,更加簡便敏感和特異.在完成免疫酶標記全過程后,對于如何判斷標記的結(jié)果作出正確的診斷是非常重要的首先需要對本病例的石蠟切片,HE染色的切片有一個診斷意見, 再次須掌握切片的主要病變區(qū)和細胞形態(tài)的特點, 由于它是免疫組化 標記的“靶細胞,應(yīng)根據(jù)“靶細胞標記結(jié)果判斷其性質(zhì).在染色過程中,某些組織和細胞,如：紅細胞,嗜酸性粒細胞, 肥大細胞,中性粒細胞和退化變性壞死組織也可以出現(xiàn)非特異反響, 影響對標記結(jié)果的判斷.在鏡下必須會識別,預(yù)防誤認為陽性細胞.抗原抗體結(jié)合后顯色,陽性時呈棕色顆粒狀.細胞陽性著色可以 在細胞漿、細胞膜和細胞核.上皮性,肌源性,神經(jīng)內(nèi)分泌,黑色素, 內(nèi)皮細胞和外周神經(jīng)細胞皆為細胞漿表達. 即在細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆 粒.淋巴細胞陽性表達是在細胞膜上,圍繞細胞膜出現(xiàn)棕色線狀結(jié)構(gòu). ER, PR陽性表達是棕色顆粒在細胞核內(nèi).免疫組化檢測