第五章DNA的生物合成ppt課件

1、中心法那么中心法那么the central the central dogma)dogma)DNARNAProtein轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄1958 F.Crick 1970 H.Temin (逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄)Chapter 5 Chapter 5 DNA replication DNA replication復(fù)復(fù) 制制 概概 念念 遺傳信息從親代遺傳信息從親代DNA傳送到子代傳送到子代DNA分子上，稱為復(fù)制，這是生分子上，稱為復(fù)制，這是生物體內(nèi)高分物體內(nèi)高分 子的聚合過程，即子的聚合過程，即DNA的生物合成。的生物合成。第一節(jié)第一節(jié) DNADNA復(fù)制的根本方式復(fù)制的根本方

2、式一、半保管復(fù)制一、半保管復(fù)制semiconservative replication) 復(fù)制時母鏈的雙鏈復(fù)制時母鏈的雙鏈DNA解開成各自作解開成各自作為模板指點子代合成互補鏈；為模板指點子代合成互補鏈；子代的兩條鏈：親代鏈新合成鏈；子代的兩條鏈：親代鏈新合成鏈；由于堿基互補，子代由于堿基互補，子代DNA雙鏈和親代雙鏈和親代DNA堿基序列一致。堿基序列一致。AGAACTTAGTCTTGAATCTCTTGAATC經(jīng)過半保管復(fù)制，子代經(jīng)過半保管復(fù)制，子代DNA和親代的和親代的DNA是一致的是一致的AGAACTTAG重新合成的子代鏈重新合成的子代鏈TCTTGAATCAGAACTTAG母鏈母鏈意意 義

3、義 子代保管了親代子代保管了親代DNA的全部信息；的全部信息； DNA經(jīng)過復(fù)制和基因表達決議生物特性；經(jīng)過復(fù)制和基因表達決議生物特性； 表達了遺傳過程的相對保守性；表達了遺傳過程的相對保守性； 保守性是相對的，不能忽視其變異性。保守性是相對的，不能忽視其變異性。復(fù)制叉挪動方向復(fù)制叉挪動方向前導鏈前導鏈岡崎片段岡崎片段后隨鏈后隨鏈二、半不延續(xù)性二、半不延續(xù)性semidiscontimity不延續(xù)復(fù)制不延續(xù)復(fù)制 延續(xù)復(fù)制延續(xù)復(fù)制概念概念復(fù)制叉、前導鏈、后隨鏈、岡崎片段復(fù)制叉、前導鏈、后隨鏈、岡崎片段第二節(jié)第二節(jié) DNA復(fù)制的酶學復(fù)制的酶學 復(fù)制是在酶催化下的核苷酸復(fù)制是在酶催化下的核苷酸聚合過程，

4、需求多種高分子物質(zhì)聚合過程，需求多種高分子物質(zhì)共同參與。共同參與。dNTPDNA-pol單鏈的單鏈的DNA母鏈母鏈RNA引物引物其它輔助因子其它輔助因子5TCA353OH3A GTCAAGTGA5GPP-PHOdTTPdATPdCTP復(fù)制過程中的脫氧核苷酸聚合復(fù)制過程中的脫氧核苷酸聚合 代表引物代表引物C5TCTOHP PP3v DNA聚合酶聚合酶DNA polymerasev DNA螺旋酶螺旋酶 v 拓撲酶拓撲酶v 引物酶引物酶v 銜接酶銜接酶v 其它相關(guān)酶和蛋白質(zhì)其它相關(guān)酶和蛋白質(zhì)一、一、DNADNA聚合酶聚合酶DNApolymeraseDNApolymerase原核生物：原核生物：DNA

5、-pol I II III 真核生物：真核生物：DNA-pol 原核生物原核生物DNA聚合酶聚合酶NC小片段小片段35kDa大片段大片段Klenow片段片段68kDa5 3 5 3 核酸核酸外切酶活性外切酶活性DNADNA聚合酶聚合酶活性活性3 5 3 5 核酸核酸外切酶活性外切酶活性蛋白酶蛋白酶DNA-pol I 103kDa構(gòu)造特點構(gòu)造特點1、由、由18個個-螺旋區(qū)組成；螺旋區(qū)組成；2、蛋白酶水解產(chǎn)生、蛋白酶水解產(chǎn)生2個片段：個片段：小片段：有小片段：有53外切酶活性外切酶活性大片段：有大片段：有DNA聚合酶活性及聚合酶活性及3 5外切酶活性。外切酶活性。Kornberg酶酶,1956 主

6、要作用：主要作用：填補復(fù)制修復(fù)空填補復(fù)制修復(fù)空隙隙(53(53外切酶外切酶活性活性) )校正復(fù)制中錯誤校正復(fù)制中錯誤(35(35外切酶外切酶活性活性) )一條分子量一條分子量120kDa的多肽鏈的多肽鏈活性很低活性很低能促進能促進DNA合成合成有有35的外切核酸酶活性，無的外切核酸酶活性，無53外外切酶活性切酶活性 在在DNA的修復(fù)中起一定作用的修復(fù)中起一定作用 DNA-pol IIKornberg,Gefter, 19701971Kornberg,Gefter, 19701971真正擔任大腸桿菌細胞內(nèi)合成真正擔任大腸桿菌細胞內(nèi)合成DNA的復(fù)的復(fù)制酶制酶Replicase；10種亞基組成的不對

7、稱二聚體；種亞基組成的不對稱二聚體；中心酶中心酶(core enzyme)：具有核苷酸聚合：具有核苷酸聚合的作用；的作用； 35外切酶活性。外切酶活性。DNA-pol IIIKornberg,Gefter, 19701971Kornberg,Gefter, 19701971 E.coli DNA 聚合酶聚合酶不對稱二聚體不對稱二聚體 中心酶中心酶(, , )原核生物原核生物DNA聚合酶的比較聚合酶的比較 酶活性酶活性 5 3 聚合酶活性聚合酶活性 3 5 外切酶活性外切酶活性 分子大小分子大小kd 250 36-38 163-300 170 256細胞內(nèi)定位細胞內(nèi)定位 核核 核核 線粒體線粒體

8、 核核 核核功能功能 引物酶活性引物酶活性 修復(fù)修復(fù) 復(fù)制復(fù)制 主要主要 校讀、修校讀、修 復(fù)制復(fù)制 無其它無其它 聚合酶聚合酶 復(fù)、填補復(fù)、填補 DNA-pol時時真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA解旋酶解旋酶/DNA解旋蛋白解旋蛋白DNA unwinding protein：催化雙螺旋：催化雙螺旋DNA的解旋和解鏈，該過程需水解的解旋和解鏈，該過程需水解ATP提供提供能量。能量。二、二、DNADNA解旋酶解旋酶DNA helicaseDNA helicase解旋酶解旋酶和和rep蛋白；蛋白；解旋酶解旋酶：沿著后隨鏈的模板，從：沿著后隨鏈的模板，從53方向挪動，促使復(fù)制叉向前延伸；

9、方向挪動，促使復(fù)制叉向前延伸；rep蛋白：沿著前導鏈的模板，以蛋白：沿著前導鏈的模板，以35方向向前挪動，從而促進雙鏈不斷解開。方向向前挪動，從而促進雙鏈不斷解開。三、三、DNA拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶DNA Topisomerase 原核和真核生物中都發(fā)現(xiàn)二類拓撲異構(gòu)酶：原核和真核生物中都發(fā)現(xiàn)二類拓撲異構(gòu)酶： Topo和和Topo 原核生物：原核生物：Topo與復(fù)制有關(guān)與復(fù)制有關(guān) Topo與轉(zhuǎn)錄有關(guān)與轉(zhuǎn)錄有關(guān)真核生物：真核生物：Topo和和均與復(fù)制有關(guān)。均與復(fù)制有關(guān)。作用：經(jīng)過切斷、旋轉(zhuǎn)和再銜接作用，理作用：經(jīng)過切斷、旋轉(zhuǎn)和再銜接作用，理順順DNA鏈。鏈。 DNA結(jié)合蛋白對單鏈結(jié)合蛋白對單鏈DN

10、A有高親和力，能特異地結(jié)合到有高親和力，能特異地結(jié)合到分開的單鏈分開的單鏈DNA上。對上。對DNA復(fù)制區(qū)構(gòu)成的單鏈復(fù)制區(qū)構(gòu)成的單鏈DNA有穩(wěn)定有穩(wěn)定作用。作用。 在真核生物中，一種單鏈在真核生物中，一種單鏈DNA結(jié)合蛋白稱之復(fù)制蛋白結(jié)合蛋白稱之復(fù)制蛋白Areplication protein A, RPA結(jié)合到暴露的單鏈上。結(jié)合到暴露的單鏈上。三、單鏈三、單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 (single- strand DNA binding protein,SSB)解螺旋酶解螺旋酶 helicasehelicaseDNA拓樸異構(gòu)酶拓樸異構(gòu)酶 DNA topoisomerase單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白

11、結(jié)合蛋白 SSB解開、理順解開、理順DNA鏈、維持鏈、維持DNA單鏈形狀單鏈形狀四、四、DNA引物酶引物酶(Primase)引物酶：復(fù)制是在一段引物酶：復(fù)制是在一段RNA引物上參與引物上參與脫氧核苷酸，而催化引物合成的脫氧核苷酸，而催化引物合成的RNA聚聚合酶。合酶。目的：盡量減少目的：盡量減少DNA復(fù)制起始處的突變。復(fù)制起始處的突變。五、五、DNA銜接酶銜接酶(DNA ligase )DNA銜接酶：催化岡崎片段間磷酸二銜接酶：催化岡崎片段間磷酸二酯鍵的構(gòu)成；酯鍵的構(gòu)成； 留意：銜接堿基互補根底上雙鏈中的留意：銜接堿基互補根底上雙鏈中的單鏈缺口，不能銜接單獨存在的單鏈缺口，不能銜接單獨存在的D

12、NA或或RNA單鏈。單鏈。銜接酶銜接模板鏈上相鄰兩個片段的切口銜接酶銜接模板鏈上相鄰兩個片段的切口 v解螺旋酶：解開解螺旋酶：解開DNA雙螺旋雙螺旋vDNA拓樸異構(gòu)酶：理順拓樸異構(gòu)酶：理順DNA鏈鏈v單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白：穩(wěn)定維持結(jié)合蛋白：穩(wěn)定維持DNA單鏈形狀單鏈形狀v前導鏈的合成：在聚合酶前導鏈的合成：在聚合酶III與滑動夾子結(jié)合與滑動夾子結(jié)合下延續(xù)合成。下延續(xù)合成。v尾隨鏈的合成：解旋酶尾隨鏈的合成：解旋酶DnaB和引物酶和引物酶DnaG沿著模板挪動。每沿著模板挪動。每1000-2000bp合成合成一個引物。聚合酶一個引物。聚合酶III延伸引物，不斷到達前一延伸引物，不斷到達前一個岡崎

13、片段為止。聚合酶個岡崎片段為止。聚合酶I去除去除RNA引物，并引物，并填補留下的空隙。銜接酶封鎖最后缺口。填補留下的空隙。銜接酶封鎖最后缺口。 各種酶與蛋白質(zhì)的作用小結(jié)各種酶與蛋白質(zhì)的作用小結(jié)起始起始 延伸延伸 終止終止大腸桿菌大腸桿菌DNA復(fù)制的相關(guān)酶和蛋白質(zhì)復(fù)制的相關(guān)酶和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)作用作用DnaB蛋白開始解鏈引物酶(DnaG)合成RNA引物rep蛋白(解鏈酶)解開雙鏈SSB(單鏈結(jié)合蛋白)穩(wěn)定單股鏈區(qū)DNA旋轉(zhuǎn)酶(拓撲異構(gòu)酶)引入負超螺旋DNA pol全酶合成DNADNA pol去除引物，補充空隙DNA連接酶連接DNA片段DnaA蛋白連接DNA片段辨認起始點DnaC蛋白運送和協(xié)同D

14、naB一復(fù)制的起始一復(fù)制的起始(initiation)一、原核生物的一、原核生物的 DNA 生物合成生物合成引發(fā)體生成引發(fā)體生成引物合成引物合成DNA 解鏈解鏈vDnaA蛋白、蛋白、rep蛋白、蛋白、SSB 和和 拓撲酶共同拓撲酶共同參與。參與。v起始點起始點ori Cv 固定單一同始點固定單一同始點 v 跨度跨度 254 bpv 構(gòu)造：構(gòu)造：3 組串聯(lián)反復(fù)序列識別區(qū)組串聯(lián)反復(fù)序列識別區(qū)v 2 對反向反復(fù)序列富含對反向反復(fù)序列富含AT1、DNA 解鏈解鏈Dna BDna CDna ASSBDNA大腸桿菌起始點大腸桿菌起始點: : DNA- DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的類核小體構(gòu)造蛋白質(zhì)復(fù)合物的類核小

15、體構(gòu)造Dna AaDNADnaA蛋白識別、結(jié)合于蛋白識別、結(jié)合于ori C的反復(fù)序列的反復(fù)序列vDNA 解鏈的根本過程解鏈的根本過程bDnaA蛋白與蛋白與DNA構(gòu)成構(gòu)成復(fù)合物，促使解鏈復(fù)合物，促使解鏈c在在DnaC的協(xié)助下，的協(xié)助下，DnaB結(jié)合于初步翻開的雙鏈，結(jié)合于初步翻開的雙鏈，并用其解螺旋酶活性使雙并用其解螺旋酶活性使雙鏈解開一定長度鏈解開一定長度v在解鏈根底上，引物酶進入構(gòu)成引發(fā)體。在解鏈根底上，引物酶進入構(gòu)成引發(fā)體。v引發(fā)體引發(fā)體 為含解螺旋酶、引物酶和為含解螺旋酶、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)的復(fù)合物。復(fù)制起始區(qū)的復(fù)合物。2、引發(fā)體構(gòu)成：、引發(fā)體構(gòu)成：3、引物的生成：、引物的生成：v

16、引發(fā)體挪動過程中，在適當位置引物酶引發(fā)體挪動過程中，在適當位置引物酶催化引物生成。催化引物生成。復(fù)制的起始復(fù)制的起始(initiation)復(fù)制方向復(fù)制方向5 3半不延續(xù)復(fù)制半不延續(xù)復(fù)制岡崎片段岡崎片段前導鏈前導鏈滯后鏈滯后鏈二復(fù)制的延伸二復(fù)制的延伸(elongation)553335 不延續(xù)復(fù)制不延續(xù)復(fù)制隨從鏈隨從鏈復(fù)制叉復(fù)制叉岡崎片段岡崎片段 延續(xù)復(fù)制延續(xù)復(fù)制領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈引物水解引物水解RNA酶酶補缺補缺DNA-pol I 銜接銜接酶銜接銜接酶三復(fù)制的終止三復(fù)制的終止(termination)0/10050Ori C82ter32E.Coli 基因圖基因圖雙向復(fù)制雙向復(fù)制終止點終止點Ter

17、：根本過程根本過程二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成一復(fù)制的起始比較原核生物一復(fù)制的起始比較原核生物 1、過程同原核生物：、過程同原核生物： 解鏈解鏈 引發(fā)體構(gòu)成引發(fā)體構(gòu)成 生成引物生成引物 2、特點：、特點： 起始點構(gòu)造較起始點構(gòu)造較 ori C 短短 酵母為酵母為11bp，富含富含AT，稱為自主復(fù)制序列，稱為自主復(fù)制序列 autonomouse replication sequence，ARS 多起點多復(fù)制子多起點多復(fù)制子 時序性分組激活，非同步進展時序性分組激活，非同步進展3、參與酶和蛋白因子：、參與酶和蛋白因子： DNA-pol 引物酶活性引物酶活性 DNA-pol 解

18、螺旋酶活性解螺旋酶活性 拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶 復(fù)制因子復(fù)制因子RF，如：，如：RFA、RFC 增殖細胞核抗原增殖細胞核抗原proliferation cell nuclear antigen，PCNA4、經(jīng)過細胞周期實現(xiàn)其調(diào)理：、經(jīng)過細胞周期實現(xiàn)其調(diào)理： 細胞周期與細胞周期與DNA復(fù)制復(fù)制 細胞周期蛋白、周期蛋白依賴激酶與細胞周期細胞周期蛋白、周期蛋白依賴激酶與細胞周期 CDK抑制物抑制物 錨蛋白錨蛋白ankynin、P21蛋白蛋白1、 DNA-pol 催化合成引物。催化合成引物。2、 DNA-pol 在增殖細胞核抗原在增殖細胞核抗原PCNA協(xié)同下，協(xié)同下，催化領(lǐng)頭鏈或隨從鏈合成催化領(lǐng)頭鏈或隨

19、從鏈合成 DNA-pol 與與 發(fā)生轉(zhuǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換。換。3、引物除有、引物除有RNA外，還有外，還有DNA片段參與構(gòu)成去除片段參與構(gòu)成去除引物不僅需求引物不僅需求RNA酶，還需求核酸外切酶。酶，還需求核酸外切酶。4、引物和岡崎片段都較原核短引物長度大致與核、引物和岡崎片段都較原核短引物長度大致與核小體所含小體所含DNA長度或其假設(shè)干倍長度或其假設(shè)干倍 。5、合成速度較慢，但總速度不慢。、合成速度較慢，但總速度不慢。二復(fù)制延伸二復(fù)制延伸353553核小體核小體引物引物真核生物復(fù)制叉的延伸真核生物復(fù)制叉的延伸注：當隨從鏈延伸了一個或假設(shè)干個核小體的長度后，注：當隨從鏈延伸了一個或假設(shè)干個核小體的長度后

20、， 要重新合成引物要重新合成引物三復(fù)制終止和端粒酶三復(fù)制終止和端粒酶 復(fù)制與核小體裝配同步進展復(fù)制與核小體裝配同步進展引物水解引物水解RNA酶酶補缺補缺DNA-pol 銜接銜接酶銜接銜接酶1、根本過程、根本過程2、端粒酶：、端粒酶： 由蛋白質(zhì)和由蛋白質(zhì)和 RNA 兩部分組成，是一種特殊的反兩部分組成，是一種特殊的反轉(zhuǎn)錄酶。轉(zhuǎn)錄酶。 催化特點：它以本身的催化特點：它以本身的 RNA 為模板，在隨從鏈為模板，在隨從鏈的模板的模板DNA 的的 3 -OH 末端延伸末端延伸 DNA，再以這種延，再以這種延伸的伸的 DNA 為模板，繼續(xù)合成隨從鏈，直至一定長度。為模板，繼續(xù)合成隨從鏈，直至一定長度。端粒

21、的復(fù)制模型 1989年Greider和Blackburn提出了端粒的復(fù)制模型。反響為四步進展： 1首先是端粒酶與端粒DNA結(jié)合，端粒酶 中的RNA與凸出的3模板配對； 2以RNA為模板，在DNA3端上從頭合成 DNA； 3延伸六個nt； 4合成一個反復(fù)單位后，端粒酶向DNA模板 新合成的3挪動， RNA再和模板配對，就這樣循環(huán) 往復(fù)，周而復(fù)始。最后延伸的3端再回折，以GG 配對的方式構(gòu)成發(fā)夾構(gòu)造，產(chǎn)生端粒。 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 AACCCC GGGGTTGGGG圖 11-68 端粒3延伸，末端回折形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)癌癥與端粒酶此前人們曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)，癌細胞往往會產(chǎn)生格

22、外多的端粒酶，使它們能不斷分裂繁衍。以為80%的癌癥與端粒酶過多親密相關(guān)。英國雜志最近在網(wǎng)上提早發(fā)表了美國加利福尼亞大學伯克利分校的科學家的報告?？茖W家用會發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)給端粒酶“染色，察看它們在細胞里的活動。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常細胞是將端粒酶限制在細胞核里的一個特定區(qū)域，只需在細胞分裂、DNA端粒需求修補時才把它釋放出來。與之相反，在癌細胞里，端粒酶有很大的自在度?？茖W家以為，端粒酶在癌細胞里可以自在活動，能夠與癌細胞的強大生命力有關(guān)。假設(shè)找到方法把這些端粒酶重新“關(guān)起來，就有能夠抑制癌細胞的繁衍。RNA模板模板逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H堿水解堿水解雜化雙鏈雜化雙鏈單鏈單鏈DNA雙鏈雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA pol IS1核酸酶核酸酶整合整合基因組基因組DNAcDNA 逆轉(zhuǎn)錄酶催化細胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄酶催化細胞內(nèi)DNA合成合成逆轉(zhuǎn)錄酶在試管內(nèi)催化逆轉(zhuǎn)錄酶在試管內(nèi)催化cDNA合成合成一、逆轉(zhuǎn)錄一、逆轉(zhuǎn)錄: RNA DNA二、滾動復(fù)制和二、滾動復(fù)制和 D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制滾