JHW-018的色譜分析

1、用色譜-質譜法研究煙草中致興奮成分大麻素JWH-018和JWH-073的合成與代謝摘要2010年1月22日，俄羅斯政府禁止草藥化合物氨基烷基吲哚JWH-018與JWH-073的分布與合成，經過詳細的檢測他們的代謝產物發(fā)現，在尿液中天然產物的含量極低并缺乏，說明上述成份經過尿液排泄進入到人體血液中。利用GC/LC-MS我們確定了一系列在人體和小鼠的尿液中代謝產物遵循的反應機理：（a）母體化合物與脂肪族和芳香族殘基中的羥基發(fā)生單-雙羥化反應，（b）羧化，（c）N-脫烷基化反應和（d）N-脫烷基化和羥基化。在人類的尿代謝物中普遍存在的是單羥基化形式，而N-脫烷烴和N-烷烴的單羥基化形式存在于小鼠尿樣

2、中。俄羅斯科學家買了26種含有JWH-018的煙草混合物用于研究。1、 引言尋求與大麻素受體CB1和CB2具有高親和力一系列氨基烷基吲哚化合物并研究它們的合成與藥理活性1。在1998年，報道了萘-1-基 - （1-戊基-1H-吲哚-3-基）甲酮（JWH-018）和它的同系物丁酯是與JWH-073有高親和力的化合物2。這些化合物對CB 1受體（主要位于中樞神經系統(tǒng)并與一個精神應答的產生有關）的親合性是相當高的（JWH-018和JWH-073的親和常數分別為Ki= 9納米和8.9nM）。一種大麻興奮劑比四氫大麻酚的有效親和力高四倍（Ki= 41 nm）3,18 。在2004年該草藥混合物中的成分當

3、做外來植物（根據包裝上的標簽）并被稱為“香料”進入了市場 4 。當他們吸煙時，這些混合物產生的效果像大麻一樣，盡管它們不含有四氫大麻酚或任何其他已知的致興奮活性物質。這些混合物在西歐的日益普及已經引起了公眾的關注，并因此導致了科學家對它們化學成分的研究。在2008年十二月，THC制藥公司（德國）和AGES 制藥公司（奧地利）獨立地報道了許多對于這些混合物噴射到一種草藥基礎的合成成分JWH-018的檢測5。這個結果是在西歐6,7和日本8,9進一步的被研究證實。 JWH-018和吸煙引起的含JWH-018“香料”的致精神興奮效應之間有直接聯系10。煙草混合物通過色譜 - 質譜法進行分析，表明這些組

4、分是植物本來就有的或是添加到混合物中來修改它們的屬性。除了植物甾醇，科學家也對幾種芳香族添加劑（乙醛香草精，丁香酚和桉油精），-生育酚和油酸酰胺 9 進行了檢測。十五種煙草混合物的定量分析表明，混合物中JWH-018的平均濃度約為15毫克/克 9 。產品中JWH-073的高含量是極其罕見的。這種化合物作為雜質（或添加劑）存在于混合物中7,9。根據（關于使用吸煙混合物和指令）幾個專業(yè)互聯網論壇的消息，80-150mg量的該混合物致興奮效果相當于約1-2.5mg的JWH-018的效果。實際由肺部吸收數的量顯然是比較低的。JWH-018量可以通過對血液中 1113天然化合物的檢測來確定。為此，JWH

5、-018在毫微克/毫升和低濃度時用LCMS和高靈敏度質譜法檢測。吸煙者血清中的化合物濃度迅速下降（90%的最大濃度在吸煙后三小時內消退） 11 。JWH-018和JWH-073是難溶于水和不產生親水性的綴合物。在體外進行的類似化合物的代謝的第一項研究這些化合物的主要代謝途徑可能是母體化合物的羥基化和N-脫烷基化14。在作者的 15 報道中，分析了JWH-018灌胃插管大鼠尿液的結果。雖然天然化合物在尿液中發(fā)現，但作者指出主要是以羥基化N-脫烷基化形式存在。在人體尿液中JWH-018代謝產物的鑒定研究中，提出了初始結構的羥基化作為主要代謝途徑；然而，N-脫烷基化的代謝產物也被發(fā)現16。在三人的尿

6、液樣本中沒有觀察到天然的JWH-018，這是一個重要的研究結果。研究目的是用氣/液相色譜-質譜法來確定服用過含JWH-018和JWH-073化合物的實驗者的代謝物中依然含有JWH-018和JWH-073。并收集十一份用過合成大麻素的人體尿樣和四份小鼠尿液樣品進行分析。此外，用于研究的JWH-018（和JWH-073）煙草混合物是由俄羅斯購買提供的。2、材料與方法2.1、試劑2.2、煙草藥的混合及后處理2.3、人體尿液采樣2.4、小鼠動物實驗2.5、尿液樣本的制備利用液液萃取和固液萃取方法來制備尿液樣本。液液萃取，2.5ml的尿家加到0.3ml的鹽酸中，在90-95度下加熱60min。向溶液中加

7、入氨水直至溶液Ph達到8-9。將樣品用3ml的氯仿萃取并離心。通過氮氣流將有機相在45C度或更低溫度下蒸發(fā)。將干燥好的樣品溶解在50ul的乙醇中或是50ul的氰化甲烷溶液中。固液萃取，將樣品裝到試劑瓶中（3ml的水解尿、3ml的Ph8-9水溶液和0.6ml的氰化甲烷），吸附劑用3ml體積分數為10%-40%的氰化甲烷洗滌，然后在空氣流中干燥30s，分析物用3ml丙酮洗脫，通過加入高濃度的成分的提取物空白水解尿來確定回收物。通過三次測量，回收率達到102%。通過三甲基硅烷（TMS），乙?；饔茫ˋC）或三氟乙酰（TFA）制備樣品用于GC的衍生。25ul的BSTFA和25ul的乙酸乙酯的混合物保持

8、在60度60min得到三甲基硅烷（TMS）。乙?；饔檬歉稍锏漠a物溶解在50ml乙酸酐和50ml吡啶的混合物中，在70度下加熱30分鐘，然后將混合物在真空下蒸發(fā)，再溶解在50ul的乙醇中50ul三氟乙酸酐和50ul乙酸乙酯混合物在50度30分鐘得到三氟乙酰衍生物。蒸發(fā)后溶解在50ul的乙酸乙酯中。2.6 、GC-MS氣相色譜儀6890連接到單四極桿質譜儀5973和5975VL配備了HP-5MS（30m×0.25mm×0.25um）和EVDX-5MS（25m×0.20mm×0.33um）柱。分離物通過應用以下溫度程序進行的：50度（0.5分），99/分鐘（

9、100度，1分鐘），和60/分鐘（320度，15分鐘）。氦作為載氣（分別為1ml/min和0.8ml/min）。柱溫降低得到不分離化合物（35度/分鐘和在最后溫度300度）光譜。離子源和固體過濾器的輸送管線的溫度分別為290、230和150度。通過AMDIS（自動質譜解卷積和識別系統(tǒng)）項目（NIST，美國）手動和自動模式矯正所識別的組分的質譜圖。最關鍵的m/z值的強度變化通過選定離子監(jiān)測（SIM）模式進行了檢查。2.7、LCMS/MS (Q-TOF)液相色譜儀1200串聯一個6510四極桿 、 渡越時間（Q-TOF）、質譜儀和芯片箱電離源用于納流模式。將液相色譜含有豐富的芯片進行分離和分析。將

10、富集柱裝填然后用1%的甲酸水溶液洗滌（3ul/min）。樣品B相組分洗脫的線性梯度以從2%至100流動相A（0.1甲酸的水）和B（在乙腈中的20體積/體積相A）為48分鐘，并與保持最終溶液超過2分鐘。流動相流速為0.4ul/min。MS/MS的分析是由電噴霧離子化（ESI）和正離子檢測。干燥氣體的溫度（氮氣，流速5升/分鐘）為325度以2000 V的毛細管電壓。掃描范圍是從100至1000道爾頓，和經銷商的MS/MS部件搜索模式與安捷倫Mass亨特工作站軟件（前體和產物離子光譜的注冊）中的使用。2.8 、LC-MS/ MS（QQQ）此方法中使用了離子掃描和選擇反應監(jiān)測（SRM）模式。以正模式E

11、SI液體微柱色譜Milichrom A-02與2.1mm×75mm柱連接到SCIEX API365三重四極質譜儀。AB SCIEX分析工作站軟件使用。以下梯度系統(tǒng)所使用流動相A遞送B速度以0.1ml/min：溶劑B 30分鐘內從2至為100，然后2分鐘溶解B。3、結果與討論3.1、煙草化合物的成分俄羅斯市場對煙草混合物的區(qū)分是根據產品的多樣性。最初，吸煙的混合物被進口到俄羅斯的已知的商標，和它們的組合物對應于已發(fā)表的數據。該混合物的相對簡單的制備過程，以及質量和各種成分導致大量的自制產品。這些產品，然后通過互聯網或匿名分銷網絡銷售俄羅斯的商標（或不顯著）。合成公式在科學期刊上發(fā)表了在

12、家里或在一個小實驗室JWH-018的合成。在俄羅斯的JWH-018禁止（自2010年1月22日起）有LED到法律組件銷售，讓國產JWH-018合成。因此，最終成為依賴于一個特定的制造商的能力，個人特征和混合歷史（表1）的吸煙混合物的組合物。從吸煙混合物中提取的成分可以分為五組。（1）根據所采用的技術或制造使用的產品，將致興奮成分加入到混 合物中（同系的氨基烷基吲哚JWH-018，JWH-073和環(huán)己烯苯酚羧酸酯CP-47, 497 C8（2 - （1R，3S）- 3-羥基環(huán)己基 - 5 -（- 2-甲基辛烷-2-yl）苯酚，C22H36O2) 6)。（2）改善或修改產品質量的成分。維生素E幾乎

13、是所有混合物中可能添加的抗氧化劑。維生素E是以下化合物的主要成分“精靈融合”，“魔力”，“香料北極協同”，“香料鉆石”，“香料熱帶協同”，“尤卡坦消防”8，9和13（基于氣相色譜法）。油酸酰胺，是一種比較罕見的對于致興奮成分氨基烷基吲哚的表面修飾劑。煙霧中還含有相當數量的飽和與不飽和酰胺C14C20。（3）芳香族助劑（丁香油酚，薄荷醇和香草醛衍生物）（4）許多物質是典型的草藥混合物，包括尼古丁。（5）可能合成半副產物的活性成分和雜質（1 -戊基-1H-吲哚，吲哚，和1 - 戊基萘甲酰胺-1 -萘甲酸）。典型的雜質被發(fā)現在“切爾諾貝利”和“香料北極協同”確定為含有JWH-018萘殘留氯原子的物質

14、。原始混合物的成分可以通過化學方法降解為其他成分。我們的觀察表明，一個假設是自制混合物（未命名的混合物3，而生育酚）被存儲在室溫下約一個月，JWH-018幾乎完全消失。然而，監(jiān)測無名的混合物4（酒精提取物），至少一個月內儲存在穩(wěn)定性評價房間中并沒有導致任何濃度的氨基烷基吲哚的減少。3.2、GC-MS：小鼠和人的尿樣檢測JWH-018和JWH-073代謝產物主要由GC MS檢測和鑒定?；谶@個目的，所有的樣品描述中均使用該實驗方法。通過電子電離得到本款規(guī)定的光譜。沒有了尿液樣本顯示本地JWH-018和JWH-073。這些結果是與以前的觀察一致的 16 ，但與另一項研究矛盾 15 。這種分歧的原因

15、可能有兩種：（1）JWH-018在水中的低溶解度（根據我們的評估）和（2）作者 15 基于更靈敏分析方法的應用（LCMS / MS）。由于其結構特點，JWH-018不能通過尿素酸共軛（作為一種天然的化合物），因此可作為一種水溶性共軛物。對分析方法的應用可以使它更敏感，可以檢測人體尿液中的微量JWH-018。搜索和代謝產物的鑒定是基于相似的化合物可能的代謝途徑的一般假設，提示母體結構的氧化和脫烷基反應，和以往的研究結論14-16。十四JWH-018代謝產物在人類和大鼠的尿液樣本中發(fā)現。他們提出的結構如圖1所示。表2中的線性保留指數和所研究的化合物在人類和大鼠尿樣品的發(fā)生。新化合物的生理活性一般首

16、先在實驗動物研究。在這項研究中，我們可以得出結論，大鼠和人類的一般代謝途徑不同。在小鼠尿液中發(fā)現的只有N-烷基化（和單羧基化的N-烷基化）代謝產物。人尿樣品顯示出患病的主要和次要的羥基化的產品，N-烷基化形式和內容是通過氣相色譜-質譜法在尿常規(guī)分析。根據我們的測算，超過90%的羥基化代謝物以共軛的形式存在于人體尿樣中，并且酶或酸分解因此被需要。SPE和LLE的樣品制備分離提取物，具有很低的選擇性反相SPE相關的基質化合物的量幾乎相同。因此，降低成本是用于測量樣品的制備方法。一種衍生方法的選擇是在樣品制備的主要問題。這三個應用的最佳方法是TMS（TMS，AC，TFA），在靈敏度和可觀察到的代謝產

17、物的數量方面。乙?；策m用于常規(guī)分析，雖然靈敏度略有降低。不能推薦是因為某些衍生物具有較低的熱穩(wěn)定性。所有檢測到的代謝產物的結構可分為四組：單羥基化，雙羥化反應，羧化和脫烷基反應。每個組的化合物的鑒別將在以下做詳解。3.2.1、單羥基化產物（M1-M4）人尿液中代謝物的JWH-018離子色譜圖如圖2所示。主要JWH-018（和JWH-073）代謝產物在我們的條件下觀察到的是M1的單羥基化的形式，和羥基是應該代替一對正鏈質子。此假設對應于觀察表明，當時的氧化發(fā)生在脂族部分，而不是母體化合物的芳族部分。圖3給出的是M1的質量譜。為了提供與母體化合物的譜圖比較。這兩種化合物的光譜具有典型的離子。既為

18、母體化合物和M1，萘渣可用m/z 127和155確定。JWH-018吲哚殘留離子的相關分別為186和214，而與m/z 202和230離子M1類似建議的羥基基團的存在。m/z 116和144對應的碎片離子氧化吲哚。該位置在正鏈羥基（而不是吲哚）是基于對m/z 144離子存在下，116和284（ M1 +H2O，c4h7 ）和296（ M1 +H2O，C3H7 ）在M1譜。與米/ 212離子表示脫水伴隨著雙鍵的形成。支持的羥基位置的其他參數將被描述如下。圖4給出的是M1在TMS和活性C衍生物的質譜。對于衍生產品，我們注意到在m/z 184和212通過三甲基硅烷形成離子的存在消除（或醋酸）在正鏈雙

19、鍵的形成。JWH-073的主要代謝產物（現有條件下觀察）顯然是一個側鏈單羥基化產品。因為JWH-073通常是在低濃度中吸煙的混合物（相對于JWH-018），檢測其微量代謝物是困難的。母體化合物及其代謝物譜（如TMS衍生物）在圖6中給出。代謝物M2（圖7A）是在混合物中可觀察到的第二種成分。其TMS和AC衍生物的質譜是相應M1光譜非常相似，它可能會被認定為一種異構體由于在正鏈羥基的位置。TMS的M3代謝物衍生物的光譜（圖7B）包含m/z 127和155離子（這表明缺乏在萘殘留羥基），這顯然不包含m/z 116和144（對應于一個不變的吲哚的殘留）。然而，密集的m/z 270和284表明該化合物也

20、是一個M1異構體將在正鏈羥基的位置。M4的羥基（圖7C）位于萘片段因其TMS衍生物的光譜包含m/z 116離子，144和214（不變吲哚殘留）。m/z 358和372是形成的正鏈的斷裂或消除引起。3.2.2、羧基化產物（M5）M5衍生物的羧基代謝物通過它們的TMS分子離子m/z值（443）和m/z 127，144和155證明存在。化合物的混合物中出現的代謝產物在酸性介質中與甲醇醚化后會支持給定的結構。鑒定的化合物是甲基化的羧基化代謝物M5（圖8）。沒有M5在TMS衍生物的混合物的額外衍生透露（TMS）經過醚化。3.2.3、雙羥基化產物（M6-M9）四強保留化合物（M6M9）在他們的光譜中包含m

21、/z 517（提出的分子離子），可以稱為JWH-018的二羥基代謝物（圖9）。由于低濃度和低濃度的分離，其結構復雜。在萘殘基中m/z 127和155和m/z 243表明，M7M9是有效的羥基化的低強度的離子的缺乏。離子m/z 184，這些化合物的光譜是由消除三甲基硅烷多鍵的形成使口譯M7M9的萘殘基和正鏈羥基化的產品。代謝產物M7和M8可以部分分離，如果減少柱的溫度梯度。這些化合物的光譜一般是相似的。密集的m/z 127和155是典型的M6。在這種化合物中，羥基組可能定位在吲哚鏈和N-戊基鏈中。所有這三個化合物，離子峰m/z358是羥基烷基鏈完全消除的結果，離子組m/z 372426可能是由多

22、個鍵的形成在消除三甲基硅烷與鏈逐步斷裂的解釋。3.2.4、脫烷基化產物（M10-M14）JWH-018的氧化代謝產物最初在小鼠尿液中確定。由于這些樣品的相對成分簡單和較小的矩陣的影響這些化合物被檢測到。氧化代謝產物的整個集團被確定為交流衍生物由于困難與硅烷化，這是這些化合物中的吲哚氮的具體行為相關。這一組最簡單的成員（M10）目前是在大鼠尿液中相當集中，而且不是在人尿液檢測中。JWH-018的單羥基化形式在我們現有的色譜條件下是難以分離的，但如果減少柱的溫度梯度我們可以將其成功分離。比較小鼠和人的尿液樣本片段離子色譜圖如圖10所示。代謝物M11M13是樣品，而M14是人體尿液中的唯一。所有的氧

23、化代謝產物是在較低濃度的人體尿液中檢測的，不能代表所有樣品的檢測。除了在相應的羥基殘基基團的位置，解碼這些代謝物的結構是沒有問題的。根據圖11中的光譜，M11和M12有羥基位于萘殘基中。m/z 127和155是不存在的，但密集峰m/z 270和286，這是由乙烯酮分子的形成以及消除的，和m/z 144一樣。對于M13和M14，一個密集的離子m/z 160（萘消除）表明，羥基局限在吲哚殘基處。 3.3、LC-Q-TOF:小鼠和人體尿樣一個串聯的Q-TOF液相色譜質譜儀僅是用來確定一些發(fā)現的代謝產物的鑒定和闡明它們的結構（圖12）。JWH-018的產物離子質譜（TR37.11 min，圖12F）包

24、含相同的特征離子電子電離光譜。在色譜圖中TR 在26.26 min左右峰值（圖12a和G）色譜主峰，寄存器在358.1000358.2000可以認定為代謝產物M1(C24H23NO2)。前體離子的m / z在計算和測量之間的區(qū)別是1.60 ppm。產物離子的光譜表明，羥基留在吲哚殘基中（230.1152，C14H16NO2），m/z 284.1061（C20H14NO，不同的是3.26 ppm）是烷基鏈的羥基化的直接指示。M1是在人體尿液中有卻幾乎在大鼠尿液中沒有觀察到。羧基代謝物M5是在人體尿液中的唯一能檢測到的。它的前體離子的光譜對應的分子式C24H21NO3（不同的是0.73 ppm）。二羥基代謝產物在應用色譜條件分離不佳，其詳細的識別因此受阻。然而，單一的前體離子m/z在色譜峰中對應的總公式C24H23NO3（不同的是4.60 ppm）。產品離子包含色譜峰強度最大的光譜m/z 143.0514（C10H7O）和171.0459（C11H7O2），相應羥基的位置在萘殘基中（圖