菌種的選育與保藏

1、第三章 微生物菌種選育與保藏本章知識(shí)概要第一節(jié) 菌種分離與篩選第二節(jié) 菌種選育第三節(jié) 菌種保藏第一節(jié) 菌種分離與篩選1、采樣 原則： 材料來(lái)源越廣泛，越有可能獲得新的菌種。 可尋找已適應(yīng)各種環(huán)境壓力的微生物類群。 土壤、水、空氣、動(dòng)植物體都含有微生物。 土壤由于具備了微生物所需要的營(yíng)養(yǎng)、水分、空氣。是微生物最集中的地方從土壤中幾乎可以分離所需要任何菌株。 細(xì)菌（108）放線菌（107） 霉菌（106）酵母菌（105） 藻類（104）原生動(dòng)物（103）采樣方法： 選擇適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)和場(chǎng)所、用無(wú)菌器皿取樣十克，裝入袋中，記錄采樣地點(diǎn)、時(shí)間、環(huán)境等等。2、富集培養(yǎng)： 在目的微生物含量較少時(shí)，根據(jù)微生物的生

2、理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長(zhǎng)條件，是目的微生物在最適的環(huán)境下，迅速生長(zhǎng)繁殖，數(shù)量增加，由原來(lái)自然條件下劣勢(shì)種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)種，以利于分離到所需要的菌株。A：控制營(yíng)養(yǎng)條件-纖維素酶產(chǎn)生菌B：控制培養(yǎng)條件-施加壓力、pH、溫度、氧氣、根據(jù)特殊生理特征、C：添加特殊抑制劑-抗生素3、純種分離： 富集培養(yǎng)而得到微生物，并不能達(dá)到純化標(biāo)準(zhǔn)，雜菌并沒(méi)有死亡、還需要進(jìn)一步純化-純培養(yǎng) 粗放型：菌落純 精細(xì)型：菌種純 劃線分離法A：粗放型 涂布分離法 稀釋分離法平板劃線分離法： 接種針挑取含有微生物樣品，在固體培養(yǎng)基表面上劃線，適當(dāng)條件培養(yǎng)后，挑取單菌落。稀釋分離法 用1ml無(wú)菌吸管精確

3、地吸取1ml大腸桿菌懸液放入10-1的試管中，使其混合均勻。另取一支吸管自10-1試管吸1ml放入10-2試管中其余依次類推。 涂布分離法 用涂棒蘸取培養(yǎng)液，在固體培養(yǎng)基表面均勻涂平，獲得單菌落。精細(xì)型： 毛細(xì)管分離法：利用培養(yǎng)皿或凹玻片等分離小室進(jìn)行細(xì)胞分離。也可以利用復(fù)雜的顯微操作裝置進(jìn)行單細(xì)胞挑取。 流式細(xì)胞儀：流式細(xì)胞儀（Flow CytoMeter, FCM）是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段，它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn) ，成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析和檢測(cè)、

4、篩選技術(shù)。 篩選方案：4、性能鑒定： 平皿快速檢測(cè) 生產(chǎn)性能測(cè)定 平皿快速檢測(cè)法第二節(jié) 優(yōu)良菌種選育自然選育誘變育種一、自然選育1、自然選育：菌種在生產(chǎn)過(guò)程中不經(jīng)過(guò)人工處理，利用微生物自身堿基突變而進(jìn)行的菌種篩選過(guò)程。多因素低劑量的誘變效應(yīng)：輻射、H2O2、O2互變異構(gòu)：DNA分子的堿基，存在酮式-烯醇式或氨式-亞胺式互變異構(gòu)。不同的互變異構(gòu)體形成氫鍵的方向和能力不同，有可能導(dǎo)致復(fù)制時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤。例如在正常情況下，A（氨式結(jié)構(gòu)）與T（酮式結(jié)構(gòu)）配對(duì)；當(dāng)A以亞胺式存在時(shí)（幾率非常?。?，則與C配對(duì)。 2、誘變育種 利用各種被稱為誘變劑的物理因素和化學(xué)試劑處理微生物細(xì)胞，使菌體負(fù)責(zé)遺傳作用的DNA分子

5、中的堿基對(duì)產(chǎn)生突變，進(jìn)而采用簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的方法。誘變育種原理：基因突變 染色體畸變：染色體或DNA片段發(fā)生缺失、易位、 重復(fù)等現(xiàn)象 基因突變：DNA堿基發(fā)生變化 誘變劑：物理、化學(xué)、生物三大類。（1）物理誘變劑紫外線、X-射線、-射線、激光、快中子、超聲波、同位素等等紫外線誘變機(jī)制：造成DNA鏈斷裂或是DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生交聯(lián)。核酸物質(zhì)的最大紫外線吸收峰值在265nm波長(zhǎng)處。（2）化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑的種類有許多，但具有高效誘變作用的并不多，常用的化學(xué)誘變劑根據(jù)其作用方式不同分為三種類型。與核酸堿基化學(xué)反應(yīng)的誘變劑 此類型主要有烷化劑、亞硝酸和羥胺等

6、。A：烷化劑，帶有一個(gè)或多個(gè)活性烷基，帶一個(gè)活性烷基稱單功能烷化劑，帶二個(gè)或多個(gè)的分別稱為雙功能或多功能烷化劑。 它們的誘變作用是其與DNA中的堿基或磷酸作用。 常見(jiàn)的烷化劑有硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硝基胍(NTG)、亞硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙酸等。 B：亞硝酸-亞硝酸的作用主要是使堿基氧化脫氨基，如使腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鳥(niǎo)嘌呤(G)分別脫氨基成為次黃嘌呤(H)、尿嘧啶(U)和黃嘌呤(X)。復(fù)制時(shí)，次黃嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤分別與胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)配對(duì)。 （2）、 誘變育種的方法步驟 2.1 制定篩選目標(biāo)高產(chǎn)量生長(zhǎng)速度快、

7、產(chǎn)孢子多；消除某些色素或無(wú)益組分；能有效利用廉價(jià)的發(fā)酵原材料；改善發(fā)酵工藝中的某些缺陷(如泡沫過(guò)多、對(duì)溫度波動(dòng)敏感、菌絲太多、自溶早、過(guò)濾困難等)。2.2 制定育種方案 誘變篩選的典型流程見(jiàn)后圖，除了增加了誘變處理，其他與前面所講的自然選育過(guò)程基本相似。菌株選育典型流程出發(fā)菌株（砂土管或冷凍管） 小試 原種特性考擦斜面 或搖瓶培養(yǎng)24h 培養(yǎng)基優(yōu)化 單孢子懸液 菌懸液 挑出高產(chǎn)菌株誘變處理 搖瓶復(fù)篩 處理前后計(jì)數(shù) 稀釋涂平板 傳種斜面 觀察單菌落形態(tài)挑選單菌落轉(zhuǎn)種斜面 保藏菌株 對(duì)照組比較 搖瓶初篩 挑出高產(chǎn)斜面 出發(fā)菌株的選擇 用來(lái)進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)的菌株就是出發(fā)菌株，對(duì)它的選擇是誘變育種工作成敗

8、的關(guān)鍵，挑選出發(fā)菌株有以下幾點(diǎn)原則：a. 來(lái)源于自然界直接分離的野生菌株.b. 有利于發(fā)酵產(chǎn)物合成的性狀，出發(fā)菌株應(yīng)具有生產(chǎn)上所需要的代謝特征。c. 要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來(lái)作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。d.生產(chǎn)或科研上經(jīng)過(guò)多次誘變改造的菌株。誘變劑的選擇 誘變劑復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng)突變株篩選誘變處理后遺傳性能發(fā)生變化：營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗性、代謝、呼吸缺陷、形態(tài)變異、生長(zhǎng)繁殖、溫度敏感性突變株。粗篩方法： A：菌體形態(tài)觀察法：形態(tài)與產(chǎn)量并沒(méi)有完全相關(guān)性，形態(tài)特征變化可能引起產(chǎn)量變化，阿舒假囊酵母-VB2高產(chǎn)菌落深黃色，淺黃色、白色低產(chǎn)。 B：平

9、皿快速檢測(cè)法 a：紙片顯色法，浸有指示劑濾紙。 b：變色圈法；c：透明圈法；d：生長(zhǎng)圈法；e：抑制圈法。復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)法： a、 抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种仆蛔冎甑暮Y選 常用的篩選方法為： 1）抗末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株。 2）利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變篩選抗反饋突變株。 例如：谷氨酸棒桿菌的肌苷酸脫氫酶的回復(fù)突變株對(duì)其終產(chǎn)物鳥(niǎo)苷酸的反饋調(diào)節(jié)不敏感，從而提高了鳥(niǎo)苷酸的產(chǎn)量。 b、抗性突變株的篩選 這包括抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體等抗性突變株的篩選。方法是在平板中（分離培養(yǎng)基）和初篩培養(yǎng)基中加入不同的抗性物質(zhì)，能夠很好生長(zhǎng)的菌株就為抗性突變株。 選擇能和抗生素或合成中間體結(jié)合的對(duì)菌體生長(zhǎng)有毒性作用的抑

10、制劑,如二價(jià)金屬離子加入培養(yǎng)基中，當(dāng)抑制劑達(dá)到一定濃度時(shí)，抗生素低產(chǎn)菌株不能夠生存，可以得到高產(chǎn)菌株。c、組成型突變株的篩選 (1)通過(guò)加入誘導(dǎo)酶合成抑制物篩選組成酶的突變株。如鄰硝基-D-巖藻糖苷抑制 -半乳糖苷酶的合成。 (2)利用交替培養(yǎng)法使組成型突變株處于優(yōu)勢(shì)。 (3)顯色法篩選組成型突變株生產(chǎn)酶。 如鄰硝基苯半乳糖苷用于篩選-半乳糖苷酶組成型突變株，剛果紅用于篩選纖維素酶組成型突變株。 d、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育* 營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指通過(guò)誘變育種，出發(fā)菌株發(fā)生基因突變，致使細(xì)胞組成成分的合成途徑出現(xiàn)某些缺陷，在只含有最低限度營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，必須在此中培養(yǎng)基中加入某些有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物才

11、能正常生長(zhǎng)。氨基酸、維生素和堿基與營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型。能滿足野生型菌株正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM minimal medium)；在基本培養(yǎng)基中有針對(duì)性地補(bǔ)加某一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)需要（其他營(yíng)養(yǎng)缺陷型仍不能生長(zhǎng)）的培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM supplemental medium)；可滿足該菌各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基(CM complete medium)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途： 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種

12、技術(shù)都必須有營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的步驟菌種誘變淘汰野生型檢出缺陷型營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定二、淘汰野生型原理：野生型能在MM中生長(zhǎng)，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時(shí)讓野生型生長(zhǎng)，處于活化階段，而缺陷型無(wú)法生長(zhǎng)，仍處于休眠狀態(tài)?？股胤ǎ河捎诩?xì)菌或酵母對(duì)一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細(xì)菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過(guò)濾法：對(duì)于霉菌，因孢子生長(zhǎng)后會(huì)長(zhǎng)出菌絲體，就可用濾紙過(guò)濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過(guò)。添加化學(xué)試劑法： 青霉屬、鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬菌株可用25-50mg/mL五氯酚

13、處理發(fā)芽孢子。適當(dāng)亞硫酸對(duì)霉菌發(fā)芽孢子有選擇殺死作用差別殺菌法： 芽孢耐熱性強(qiáng)，萌發(fā)后的菌體細(xì)胞不耐熱，通過(guò)加熱殺死營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，芽孢保存。三、營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的檢出1、逐個(gè)檢出法：把經(jīng)誘變處理的細(xì)胞群涂布在完全培養(yǎng)基的瓊脂平板上，待長(zhǎng)成單個(gè)菌落后，用接種針或滅過(guò)菌的牙簽把這些單個(gè)菌落逐個(gè)整齊地分別接種到基本培養(yǎng)基平板和另一完全培養(yǎng)基平板上，使兩個(gè)平板上的菌落位置嚴(yán)格對(duì)應(yīng)。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基平板的某一部位上長(zhǎng)出菌落，而在基本培養(yǎng)基的相應(yīng)位置上卻不長(zhǎng)，說(shuō)明此乃營(yíng)養(yǎng)缺陷型。 2、夾層培養(yǎng)法：先在培養(yǎng)皿底部倒一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，待凝，添加一層混有經(jīng)誘變劑處理菌液的基本培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，對(duì)首

14、次出現(xiàn)的菌落用記號(hào)筆一一標(biāo)在皿底。然后再加一層完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)后新出現(xiàn)的小菌落多數(shù)都是營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。 3、限量補(bǔ)充培養(yǎng)法：把誘變處理后的細(xì)胞接種在含有微量（0.01%）蛋白胨的基本培養(yǎng)基平板上，野生型細(xì)胞就迅速長(zhǎng)成較大的菌落，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型則緩慢生長(zhǎng)成小菌落。若需獲得某一特定營(yíng)養(yǎng)缺陷型，可再在基本培養(yǎng)基中加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。 4、影印平板法：將誘變劑處理后的細(xì)胞群涂布在一完全培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)長(zhǎng)出許多菌落。用特殊工具-“印章”把此平板上的全部菌落轉(zhuǎn)印到另一基本培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，比較前后兩個(gè)平板上長(zhǎng)出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)在前一培養(yǎng)基平板上的某一部位長(zhǎng)有菌落，而在后一平板上的相應(yīng)部位卻呈空白

15、，說(shuō)明這就是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。四、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定生長(zhǎng)譜法。生長(zhǎng)譜法是指在混有供試菌的平板表面點(diǎn)加微量營(yíng)養(yǎng)物，視某營(yíng)養(yǎng)物的周?chē)蟹耖L(zhǎng)菌來(lái)確定該供試菌的營(yíng)養(yǎng)要求的一種快速、直觀的方法。具體操作： 把生長(zhǎng)在完全培養(yǎng)液里的營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞經(jīng)離心和無(wú)菌水清洗后，配成適當(dāng)濃度的懸液（如107108個(gè)ml），取0.1ml與基本培養(yǎng)基均勻混合后，傾注在培養(yǎng)皿內(nèi)，待凝固、表面干燥后，在皿背劃幾個(gè)區(qū)，然后在平板上按區(qū)加上微量待鑒定缺陷型所需的營(yíng)養(yǎng)物粉末（濾紙片），例如氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶堿基等。經(jīng)培養(yǎng)后，如發(fā)現(xiàn)某一營(yíng)養(yǎng)物的周?chē)猩L(zhǎng)圈，就說(shuō)明此菌就是該營(yíng)養(yǎng)物的缺陷型突變株。五、基因重組育種基因重組育種：

16、采用結(jié)合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、有性雜交及準(zhǔn)性生殖的遺傳學(xué)的方法和技術(shù)使微生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生基因重組，增加優(yōu)良性狀的組合或者導(dǎo)致多倍體的出現(xiàn)，從而獲得優(yōu)良菌株的一種育種方法。（一）原核生物的基因重組育種：1、結(jié)合 供體菌通過(guò)性菌毛與受體菌直接接觸，把F質(zhì)?；蚱鋽y帶的不同長(zhǎng)度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象。大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒(méi)有F因子稱F-。F因子存在于細(xì)胞中形式：游離狀態(tài)(F+細(xì)胞)；整合狀態(tài)，即F因子插入胞核質(zhì)的一定位置上(Hfr細(xì)胞)。F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，實(shí)質(zhì)上是F因子的轉(zhuǎn)移，所以F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌。2、

17、轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的媒介，把供體細(xì)胞的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)導(dǎo)子轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)3、轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收供體菌的DNA片段而獲得了供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化子感受態(tài)：遺傳性、菌齡、生理狀態(tài)、培養(yǎng)條件CaCl2 冰冷 電擊（二）放線菌的雜交育種 基因重組過(guò)程近似于細(xì)菌，但其育種方法有許多與霉菌相似。 1、雜交原理 放線菌基本上有四種遺傳體系。 （1）異核現(xiàn)象 有些放線菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型在混合培養(yǎng)或雜交過(guò)程中，經(jīng)菌絲之間的接觸和融合而形成異核體。 異核體形成的菌落在表型上是原養(yǎng)型的，無(wú)重組體出現(xiàn)。 （2）結(jié)合現(xiàn)象 不同基因型的細(xì)胞核在雙方增

18、殖過(guò)程中，發(fā)生部分DNA的轉(zhuǎn)移或遺傳信息的交換，形成部分合子。 （3）異核系的形成 當(dāng)部分合子形成后，經(jīng)過(guò)一次單交換而產(chǎn)生異核系染色體組。（4）重組體的形成 異核系不穩(wěn)定，在菌落生長(zhǎng)過(guò)程中，在染色體重疊區(qū)域不同的部位再次發(fā)生交換后，能產(chǎn)生重組體孢子。 也可由部分合子不經(jīng)過(guò)異核系，直接經(jīng)過(guò)雙交換形成重組孢子。 2 雜交方法 (1) 混合培養(yǎng)法： 要求兩親本菌株必須為互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。將兩菌株接種到完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)至孢子長(zhǎng)出，然后將孢子在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，能長(zhǎng)出的菌株為重組菌株。 (2) 平板雜交法：將菌株一在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，用影印法將菌落孢子印至已鋪有另一菌株

19、孢子的完全培養(yǎng)基上，等長(zhǎng)出孢子后，用基本培養(yǎng)基篩選重組菌株。 三、霉菌的雜交育種構(gòu)巢曲霉-準(zhǔn)性雜交不經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂就能導(dǎo)致基因重組的生殖過(guò)程四、酵母菌的雜交育種 性細(xì)胞間的結(jié)合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。 子囊孢子的形成 子囊孢子的分離 雜種的獲得 (三)原生質(zhì)體融合分別酶解兩個(gè)不同遺傳性狀的菌株細(xì)胞壁，在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)體膜包被的原生質(zhì)體，將它們混合，然后通過(guò)物理、化學(xué)或生物學(xué)方法使他們互相聚集，通過(guò)遺傳性狀不同的兩親本原生質(zhì)體融合，接著發(fā)生染色體交換、重組而達(dá)到雜交目的。并篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定重組體。六、基因工程育種基因工程：用人為的方法

20、將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)DNA分子提取出來(lái)，在離體條件下進(jìn)行切割，獲得代表某一性狀的目的基因，把該目的基因與作為載體的DNA分子連接起來(lái)，然后導(dǎo)入某一受體細(xì)胞中，讓外源基因在受體細(xì)胞中進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得目的產(chǎn)物。一個(gè)完整的基因克隆過(guò)程包括以下步驟、獲得待克隆的DNA片段（基因）；、目的基因與載體在體外連接；、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；、篩選、鑒定陽(yáng)性重組子；、表達(dá)篩選。（一）載體系統(tǒng)：攜帶目的基因并將其轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的運(yùn)載工具。1、特征:一般為環(huán)狀，具有體外酶切和連接能力，與目的基因結(jié)合成環(huán)狀-轉(zhuǎn)化-受體細(xì)胞中-復(fù)制表達(dá)能力 2、載體具備性質(zhì)：在宿主細(xì)胞

21、內(nèi)具有自主復(fù)制和表達(dá)能力。能與外源DNA片段結(jié)合而不影響本身的復(fù)制能力。具有兩個(gè)以上限制性內(nèi)切酶單一位點(diǎn)。具有兩個(gè)易檢測(cè)的遺傳標(biāo)記，賦予宿主細(xì)胞不同的表型，便于檢測(cè)和分離。載體分子量盡可能小，便于與較大基因結(jié)合，不易受到機(jī)械剪切。易于轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞。3、常用質(zhì)粒載體 pBR322 質(zhì)粒載體 p plasmidBR構(gòu)建者 Boliver 和 Rodriguez322 實(shí)驗(yàn)標(biāo)號(hào) pUC 質(zhì)粒載體 Plasmid University California 宿主：JM101細(xì)菌細(xì)胞（突變體） 限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶） 限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識(shí)

22、別DNA的特異序列(48bp), 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類內(nèi)切酶。 （四）目的基因的獲取1、通過(guò)建立基因文庫(kù)分離靶基因2、化學(xué)合成法制備DNA片段 從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。3、聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增基因片段 對(duì)于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），以基因組DNA或cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段。(五)重組DNA導(dǎo)入宿主菌體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。1、轉(zhuǎn) 化 指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞

23、的過(guò)程。轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)菌必須經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)即容易接受外源DNA的狀態(tài),然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中。 此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌，它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。 2、轉(zhuǎn)染和感染利用噬菌體DNA作為載體時(shí)可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。 一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。 另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。（六）重組克隆的篩選與鑒定 基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽(yáng)性重組子的菌落，并鑒

24、定重組子的正確性。通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達(dá)該基因的產(chǎn)物。種子制備 將保存在沙土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面，活化后再經(jīng)過(guò)扁瓶、搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種培養(yǎng)過(guò)程。工業(yè)發(fā)酵種子的制備種子質(zhì)量的控制發(fā)酵階段的條件控制一、 概 述（一）種子擴(kuò)大的目的31、為每次發(fā)酵罐投料提供一定數(shù)量代謝旺盛的種子2、有利于縮短發(fā)酵時(shí)間、提高罐利用率。3、減少雜菌污染機(jī)會(huì)（二）優(yōu)良種子必須具備條件1、菌種細(xì)胞生長(zhǎng)活力強(qiáng)，接種于發(fā)酵罐后迅速生長(zhǎng)，延遲期短。2、生理狀態(tài)穩(wěn)定，以得到穩(wěn)定的菌體生長(zhǎng)過(guò)程。3、

25、具有適宜的菌體總量及濃度，滿足大容量發(fā)酵需要。4、無(wú)雜菌及噬菌體污染，保證整個(gè)發(fā)酵正常進(jìn)行。5、保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力，使最終產(chǎn)物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。（三）種子擴(kuò)大培養(yǎng)的工藝流程將砂土管或冷凍抱子接種到斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)；將斜面抱子或菌絲體轉(zhuǎn)接到扁瓶固體培養(yǎng)基或搖瓶液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，制備實(shí)驗(yàn)室種子；將擴(kuò)大培養(yǎng)的孢子或菌絲體按種到一級(jí)種子罐，制備生產(chǎn)用種子，一級(jí)種子再接種至二級(jí)種子罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，完成生產(chǎn)車(chē)間種子的制備；制備好的生產(chǎn)種子轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。（四）種子進(jìn)罐的方法：1、孢子進(jìn)罐法：先在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、繁殖成大量孢子，將孢子直接接入種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)。發(fā)酵生產(chǎn)方向，細(xì)、霉、放線

26、菌采用，工藝簡(jiǎn)單、種子易于保存、減少污染機(jī)會(huì)，沙土管冷凍管用量較大。2、菌絲搖瓶進(jìn)罐法：將固體培養(yǎng)基上繁殖的孢子接入搖瓶液體培養(yǎng)基中，使菌絲生長(zhǎng)，再將搖瓶菌絲接入種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵。生長(zhǎng)、發(fā)育緩慢放線菌、節(jié)約沙土管冷凍管用量，菌絲不易保存，批次之間差異大，污染機(jī)會(huì)多。二、工業(yè)發(fā)酵種子的制備 實(shí)驗(yàn)室種子制備：孢子制備、固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)、搖瓶液體培養(yǎng)。 生產(chǎn)車(chē)間種子制備：搖瓶液體種子制備、種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（一）實(shí)驗(yàn)室種子制備 孢子制備-發(fā)酵工序開(kāi)端1、放線菌孢子制備： 培養(yǎng)基一般采用瓊脂和其他一些適合孢子生長(zhǎng)的成分。麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨、牛肉膏和一些無(wú)機(jī)鹽等，其中的碳源和氮源不要太豐富(碳源約

27、為1，氮源不超過(guò)0.5)。碳氮比例大一些為好，這樣避免菌絲的大量形成，有利于產(chǎn)生大量孢子。一般情況下，干燥和限制營(yíng)養(yǎng)可直接或間接誘導(dǎo)。2、霉菌孢子制備： 培養(yǎng)基一般使用大米、小米、玉米、麥麩等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基原料。適合霉菌的生長(zhǎng)繁殖、這類培養(yǎng)基的表面積較大，可獲得大量的孢子。 制備大(小)米培養(yǎng)基，要嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的含水量，使其不粘不散。接種時(shí)，先將砂土管或冷凍管中的菌種制成懸浮液，再把一定量的懸浮液直接接人大(小)米培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成熟后稱為“親米”，由親米再轉(zhuǎn)至大(小)米培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成熟后稱為“生產(chǎn)米”。用“生產(chǎn)米”制成孢子懸浮液，最后轉(zhuǎn)入種子罐內(nèi)。培養(yǎng)溫度2528，一般培養(yǎng)時(shí)間4

28、14天。 3、細(xì)菌類孢子制備 制備細(xì)菌類孢子，斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。牛肉膏，蛋白胨是常用的有機(jī)氮源。細(xì)菌培養(yǎng)溫度大多數(shù)為37，少數(shù)為28。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時(shí)間一般為12d，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌則需培養(yǎng)910d。 搖瓶液體種子制備 種子罐種子制備1、搖瓶液體種子制備 某些孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需要將孢子經(jīng)搖瓶液體培養(yǎng)成菌絲后再接人種子罐，這就是搖瓶種子。 將斜面孢子接種到體積較小的搖瓶（母瓶）中，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量菌絲體后，再轉(zhuǎn)接到較大的搖瓶(子瓶)中培養(yǎng)，這種搖瓶培養(yǎng)方法稱為母瓶-子瓶?jī)杉?jí)培養(yǎng)、搖瓶進(jìn)罐法常采用母瓶-子瓶?jī)杉?jí)培養(yǎng)。2、種子罐種子制備 種子罐的級(jí)數(shù)是指制備種子需

29、要逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。種子罐種子制備的工藝過(guò)程，因菌種不同而有差異，一般可分為一級(jí)種子、二級(jí)種子和三級(jí)種子的制備。 孢子(或搖瓶菌絲)被接種到體積較小的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量的菌絲，這樣的種子稱為一級(jí)種子。把一級(jí)種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為二級(jí)發(fā)酵。如果將一級(jí)種子接入到體積較大的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成更多的菌絲，這樣的種子稱為二級(jí)種子。把二級(jí)種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為三級(jí)發(fā)酵。 一般應(yīng)根據(jù)菌種生長(zhǎng)特性、孢子發(fā)芽和繁殖速度以及所采用的發(fā)酵罐容積來(lái)確定種子罐的級(jí)數(shù). 抗生素生產(chǎn)中，放線菌的細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖速度較慢，常采用二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，即三級(jí)發(fā)酵，一般50t發(fā)酵罐多采用三級(jí)發(fā)酵，有的甚至采用四級(jí)發(fā)

30、酵。 谷氨酸類氨基酸發(fā)酵所采用的菌種是細(xì)菌，生長(zhǎng)繁殖速度很快，采用二級(jí)發(fā)酵。種子異常的分析 1、菌種生長(zhǎng)發(fā)育緩慢或過(guò)快 這種現(xiàn)象是指在各項(xiàng)工藝參數(shù)正常的情況下，出現(xiàn)整個(gè)代謝過(guò)程過(guò)慢或過(guò)快。菌種在種子罐中生長(zhǎng)發(fā)育緩慢或過(guò)快和孢子質(zhì)量以及種子罐的培養(yǎng)條件有關(guān)。一般情況下，通入種子罐中無(wú)菌空氣的溫度較低或者培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量較差是種子生長(zhǎng)、代謝緩慢的主要原因。3、菌絲貼壁 所謂菌絲粘壁是指在種子培養(yǎng)過(guò)程中菌絲正常發(fā)育生長(zhǎng)，但再繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)菌絲逐步粘附在罐壁上。當(dāng)菌絲繁殖速度低于被罐壁粘附的速度時(shí)，培養(yǎng)液中菌絲濃度愈來(lái)愈小，最后就可能形成菌絲團(tuán)。攪拌效果不好攪拌時(shí)泡洙過(guò)多以及種子罐裝料系數(shù)過(guò)小等原因造成。

31、在以真菌為產(chǎn)生菌的種子培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)生菌絲貼壁的機(jī)會(huì)較多。4、生理生化代謝異常 如糖、氮代謝過(guò)快或過(guò)慢，pH過(guò)高或過(guò)低，種子罐發(fā)酵單位低等。第四節(jié) 菌種保藏和復(fù)壯一、菌種退化：生產(chǎn)菌株遺傳標(biāo)記的丟失及生產(chǎn)能力的下降退化表現(xiàn)： 產(chǎn)量下降，騰倉(cāng)赤霉產(chǎn)赤霉素能力下降。菌落和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，蘇云金芽孢桿菌芽孢伴孢晶體變小而少。 對(duì)宿主寄生能力下降，白僵菌對(duì)宿主致病能力下降。退化原因： 基因突變，控制細(xì)胞性狀的基因發(fā)生突變 當(dāng)控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變，就會(huì)引起產(chǎn)量下降；當(dāng)控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變，則使菌種產(chǎn)孢子性能下降。 分離現(xiàn)象 遺傳育種獲得菌株如果是多核的細(xì)胞或菌絲體，基因突變只發(fā)生在一個(gè)核上

32、，在傳代過(guò)程中會(huì)發(fā)生分離現(xiàn)象。退化防止： 盡可能使用單核菌株或孢子，避免對(duì)多核細(xì)胞處理，誘變后要進(jìn)行充分的篩選。 控制傳代次數(shù)，隨著傳代次數(shù)的增加，退化現(xiàn)象增加。 創(chuàng)造良好的培養(yǎng)環(huán)境，適合微生物的培養(yǎng)。 采用有效的菌種保藏方法。二、菌種的保藏（一）目的 使微生物菌種保持原來(lái)的性狀和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交換和使用。（二）原理 挑選典型培養(yǎng)物（typical culture）的優(yōu)良純種，并創(chuàng)造最有利于休眠的環(huán)境條件，使微生物處于代謝不活潑、生長(zhǎng)受抑制的休眠狀態(tài)。措施 § 低溫：生長(zhǎng)溫度低限約為-30，水溶液中酶促反應(yīng)溫度低限-140 § 干燥§ 缺氧§ 避光§ 缺乏營(yíng)養(yǎng)§ 添加保護(hù)劑：甘油、脫脂牛奶、血清白蛋白 § 添加酸度中和劑 （三）菌種保藏方法