實驗二葉綠素的提取與分離

1、實驗二 葉綠素的提取和分離一、 實驗目的從富含葉綠素的菠菜葉片中提取葉綠素，并在薄層層析板上點樣使葉綠素顯示不同顏色。二、 實驗原理要求同學們先查詢資料，了解葉綠素相關知識，實驗課上老師講解。三、 實驗材料、器具研缽、托盤天平、分液漏斗、干燥錐形瓶、毛細管、薄層層析板、飽和NaCl溶液、無水Na2SO4四、 實驗步驟1、葉綠素的提取在中放入幾片(約5g)菠菜葉(新鮮的或冷凍的都可以如果是冷凍的，解凍后包在紙中輕壓吸左水分)。加入10mL2:1石油醚和丙酮混合液，適當研磨。將提取液用滴管轉移至分液漏斗中，加入10mL飽和NaCl溶液(防止生成乳濁液)除去水溶性物質，分去H2O層，再用蒸餾水洗滌兩

2、次。將有機層轉入干燥的小錐形瓶中，加2g無水Na2SO4，通風處理。處理后的液體傾至另一錐形瓶中(如溶液顏色太淺，可在通風柜中適當蒸發(fā)濃縮)。2、點樣 用一根內徑 1mm的毛細管，吸取適量提取液，輕輕地點在距薄板一端1cm處，平行點兩點，兩點相距1cm左右。若一次點樣不夠，可待樣品溶劑揮發(fā)后再在原處點第二次，但點樣斑點直徑不得越過2mm。3、展開 先在小燒杯中放入展開劑用石油醚和丙酮按3：1的比例進行混合作為展開劑，再將薄層板斜靠于層析缸內壁。點樣端接觸展開劑但樣點不能浸沒于展開劑中，密閉層析缸。待展開劑上升到距薄層板另一端約1cm時，取出平放，用鉛筆或小針劃前沿線位置，在空氣中晾干或用電吹風

3、吹干薄層。毛細管點樣 薄層色譜展開4、觀察層析板并記錄實驗結果。薄層層析時Rf值表示的是原點到層析斑點中心的距離與原點的到展層溶劑的前沿距離包括擴散最快的是什么，擴散最慢的是什么最寬的色素帶是什么，最窄的色素帶是什么哪兩個色素帶距離相距最遠，哪兩個最近等等各種色素在層析液中的溶解度不同，溶解度高的隨層析液在濾紙上擴散的快，反之則慢。最快：胡蘿卜素次之：葉黃素次之：葉綠素A最慢：葉綠素B顏色分別為：橙黃色、黃色、藍綠色和黃綠色，最寬的是葉綠素A最窄的是胡蘿卜素胡蘿卜素和葉綠素B最遠葉綠素A和葉綠素B最近實驗十四、 植物色素的提取和薄層色譜分析 一、 實驗目的： 1、了解薄層色譜的基本原理和應用。

4、 2、掌握薄層色譜的操作技術。 二、實驗原理： 1、原理 薄層色譜(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又稱薄層層析，屬 于固液吸附色譜。樣品在薄層板上的吸附劑（固定相）和溶劑（移動相）之 間進行分離。由于各種化合物的吸附能力各不相同，在展開劑上移時，它們進 行不同程度的解吸，從而達到分離的目的。 2、薄層色譜的用途： 1）化合物的定性檢驗。（通過與已知標準物對比的方法進行未知物的鑒定） 在條件完全一致的情況，純碎的化合物在薄層色譜中呈現(xiàn)一定的移動距 離，稱比移值（Rf 值），所以利用薄層色譜法可以鑒定化合物的純度或確定兩 種性質相似的化合物是否為同一物質。但影

5、響比移值的因素很多，如薄層的厚 度，吸附劑顆粒的大小，酸堿性，活性等級，外界溫度和展開劑純度、組成、 揮發(fā)性等。所以，要獲得重現(xiàn)的比移值就比較困難。為此，在測定某一試樣時， 最好用已知樣品進行對照。 距離 溶劑前沿至原點中心的 點中心的距離 溶質最高濃度中心至原 = f R 2）快速分離少量物質。 （幾到幾十微克，甚至0.01µg） 3）跟蹤反應進程。在進行化學反應時，常利用薄層色譜觀察原料斑點的逐步消 失，來判斷反應是否完成。 4）化合物純度的檢驗（只出現(xiàn)一個斑點，且無拖尾現(xiàn)象，為純物質。） 此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜 分析的物質。 3、色譜法

6、色譜法是與植物天然色素的分離提取同時發(fā)展起來的.色譜法(紙色譜,薄層 色譜和柱色譜)至今仍然是分離葉綠素等天然色素最有效的方法。 色譜法分離葉綠體色素的基本原理是利用不同色素在各種有機溶劑中的分 配系數(shù),或在吸附劑上的吸附能力的不同,當它們通過色譜柱/床時,這種分配或 吸附過程反復多次地進行,最后將它們一一分離開來。 通常認為,紙色譜屬于分配色譜.它是以濾紙為惰性支持物,濾紙纖維一般能 吸收約20 % 的水分,其中有67 % 以氫鍵形式與纖維素上的羥基結合,構成紙 色譜的固定相.在展開過程中,被分離組分在展開劑和固定相之間不斷進行分配,龍巖學院 分析化學精品課程 分析化學實驗項目指導書 2 達

7、到相互分離.薄層色譜和柱色譜的吸附劑(固定相)有硅膠,氧化鋁,硅藻土等無 機物,也有糖類,纖維素,聚酰胺,C18 和離子交換樹脂等有機物.它們的分離機理 也各不相同,如吸附,分配,氫鍵,正相和反相色譜等。對于紙色譜或薄層色譜,毛細 管作用是推動溶劑展開的動力.被分離物質在圖譜上的位置,可用比移值 Rf表示 Rf=原點至斑點中心的距離/原點至展開劑前沿的距離。 植物光合作用是自然界最重要的現(xiàn)象,它是人類所利用能量的主要來源.在 把光能轉化為化學能的光合作用過程中,葉綠體色素起著重要的作用.高等植物 體內的葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素兩類,主要包括葉綠素a,葉綠素b, 胡 蘿卜素和葉黃素四種.

8、葉綠素(chlorophylls)是葉綠酸的酯,它在植物進行光合作 用中吸收可見光,并將光能轉變?yōu)榛瘜W能.葉綠素是植物進行光合作用所必需的催化劑.在綠色植物中葉綠素主要以葉綠素a(C55H72O5N4Mg)和葉綠素 b(C55H70O6N4Mg)兩種結構相似的形式存在,其差別僅是葉綠素a中一個甲基被 葉綠素 b中的甲?；〈?。 三 、實驗裝置 四、實驗操作步驟和內容： （一）步驟 1、吸附劑的選擇 薄層色譜的吸附劑最常用的是氧化鋁和硅膠。 1）、硅膠： “硅膠H”不含粘合劑； “硅膠G”含煅石膏粘合劑； 其顆粒大小一般為260目以上。顆粒太大，展開劑移動速度快，分離效果 不好；反之，顆粒太小

9、，溶劑移動太慢，斑點不集中，效果也不理想。 化合物的吸附能力與它們的極性成正比， 具有較大極性的化合物吸附較強， 因而Rf 值較小。 酸和堿 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 鹵代物、醚 > 烯 > 飽和烴 本實驗選擇的吸附劑為薄層色譜用硅膠G。龍巖學院 分析化學精品課程 分析化學實驗項目指導書 3 2、薄層板的制備（濕板的制備） 薄層板制備的好壞直接影響色譜的結果。薄層應盡量均勻且厚度要固定。 否則，在展開時前沿不齊，色譜結果也不易重復。在燒杯中放入2g硅膠G，加 入56ml 0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液，調成糊狀。將配制好的漿料傾

10、注到 清潔干燥的載玻片上，拿在手中輕輕的左右搖晃，使其表面均勻平滑，在室溫 下晾干后進行活化。本實驗用此法制備薄層板4片。 3、薄層板的活化 將涂布好的薄層板置于室溫涼干后，放在烘箱內加熱活化，活化條件根據 需要而定。硅膠板一般在烘箱中漸漸升溫，維持 105110活化 30min。氧化 鋁板在 200烘 4h可得到活性為級的薄板，在 150160烘 4h可得活性為 級的薄板。活化后的薄層板放在干燥器內保存待用。 4、點樣 先用鉛筆在距薄層板一端1cm處輕輕劃一橫線作為起始線，然后用毛細管 吸取樣品，在起始線上小心點樣，斑點直徑一般不超過2mm。若因樣品溶液太 稀，可重復點樣，但應待前次點樣的溶

11、劑揮發(fā)后方可重新點樣，以防樣點過大， 造成拖尾、擴散等現(xiàn)象，而影響分離效果。若在同一板上點幾個樣，樣點間距 離應為1。點樣要輕，不可刺破薄層。 5、展開 薄層色譜的展開，需要在密閉容器中進行。為使溶劑蒸氣迅速達到平衡， 可在展開槽內襯一濾紙。在層析缸中加入配好的展開溶劑，使其高度不超過 1cm。將點好的薄層板小心放入層析缸中，點樣一端朝下，浸入展開劑中。蓋 好瓶蓋，觀察展開劑前沿上升到一定高度時取出，盡快在板上標上展開劑前沿 位置。晾干，觀察斑點位置，計算Rf值。 分離葉綠體色素的展開劑有:石油醚(60 90)-丙酮-乙醚(3:1:1);石油醚-丙 酮 (8:2);石油醚-乙酸乙酯(6:4);

12、苯-丙酮(7:3)和石油醚(30 60)-丙酮-正丁醇 (90:10:4.5)等. 本實驗將150 mL石油醚(60 90)-丙酮-乙醚(3:1:1)展開劑倒入層析缸中,并在 層析缸的內壁四周貼一張5 cm高的濾紙,濾紙下部浸在展開劑中,蓋好蓋子平衡 1015 min.將點好樣的硅膠板放入展開缸里,液面不能超過點樣線,蓋好蓋子進 行上行層析.待展開劑前沿上升到距硅膠板上端 1.52 cm時,取出硅膠板置于通 風櫥里晾干,可看到層析板上出現(xiàn)若干色素帶,其排列順序一般是 -胡蘿卜素,去 鎂葉綠素,葉綠素 a,葉綠素 b 和葉黃素等多條色帶.用鉛筆標記出樣品斑點,計算各色素的比移值Rf. 6、顯色

13、被分離物質如果是有色組分，展開后薄層色譜板上即呈現(xiàn)出有色斑點。 如果化合物本身無色，則可用碘蒸氣熏的方法顯色。還可使用腐蝕性的顯 色劑如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸等。 對于含有熒光劑的薄層板在紫外光下觀察，展開后的有機化合物在亮的熒龍巖學院 分析化學精品課程 分析化學實驗項目指導書 4 光背景上呈暗色斑點。 本實驗樣品本身具有顏色，不必在熒光燈下觀察。 7、樣品收集 將層析板上分開的-胡蘿卜素,葉綠素a,葉綠素b的色帶分別用干凈的刮刀刮入 試管中,加入5 mL丙酮提取,低溫避光保存. 8*、溫度對薄層色譜分離的影響 取兩塊 1×5 cm 2 的商品硅膠板,點樣后,以相同的展開劑,分別置于

14、冰箱(4)和室 溫(20以上)展開.觀察和對比它們的分離結果. (二)實驗內容：（以下實驗內容選做其一） 1、檢驗甲基橙的純度。（通過與已知標準物對比的方法檢驗物質是否純凈） 實驗樣品：甲基橙粗品（自制）、甲基橙純品。 溶劑：乙醇：水=1：1 展開劑：丁醇：乙醇：水=10：1：1 2、混合物的分離 實驗樣品：圓珠筆芯油 溶劑：95%乙醇 展開劑：丁醇：乙醇：水=9：3：1（體積比） 3、1%偶氮苯、1%間硝基苯胺、熒光黃(95%乙醇, 1mg/1ml)、次甲基藍、環(huán)己 烷:乙酸 9:1 4、 植物色素-胡蘿卜素,去鎂葉綠素,葉綠素a,葉綠素 b和葉黃素的提取與分離。 五、實驗關鍵步驟： 1、載

15、玻片應干凈且不被手污染，吸附劑在玻片上應均勻平整。 2、 點樣不能戳破薄層板面， 各樣點間距11.5cm， 樣點直徑應不超過2mm。 3、展開時，不要讓展開劑前沿上升至底線。否則，無法確定展開劑上升高 度，即無法求得Rf值和準確判斷粗產物中各組分在薄層板上的相對位置。 六、思考題 1、如何利用Rf 值來鑒定化合物？ 答：在條件完全一致的情況，純碎的化合物在薄層色譜中呈現(xiàn)一定的移動距離， 稱比移值（Rf 值），所以利用薄層色譜法可以鑒定化合物的純度或確定兩種性 質相似的化合物是否為同一物質。但影響比移值的因素很多，如薄層的厚度， 吸附劑顆粒的大小，酸堿性，活性等級，外界溫度和展開劑純度、組成、揮

16、發(fā) 性等。所以，要獲得重現(xiàn)的比移值就比較困難。為此，在測定某一試樣時，最 好用已知樣品進行對照。 2、薄層色譜法點樣應注意些什么？ 答： （1）先用鉛筆在距薄層板一端1cm處輕輕劃一橫線作為起始線，然后用毛細管吸取樣品，在起始線上小心的點樣，斑點直徑一般不超過2mm。 （2）若因樣品溶液太稀，可以重復點樣，但應待前次點樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點樣，以防樣點過大，造成拖尾、擴散等現(xiàn)象，而影響分離效果。 （3）若在同一板上點幾個樣，樣點間距離應為1-1.5cm。 （4）點樣要輕，不可刺破薄層。 3、常用的薄層色譜的顯色劑是什么？ 答：顯色凡可用于紙色譜的顯色劑都可用于薄層色譜。薄層色譜還可使用腐蝕

17、性的顯色劑如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸等。對于含有熒光劑（硫化鋅鎘、硅酸 鋅、熒光黃）的薄層板在紫外光下觀察，展開后的有機化合物在亮的熒光背景 上呈暗色斑點。也可用鹵素斑點試驗法來使薄層色譜斑點顯色。 4、薄層板的展開方式有哪些？ 答： （1）上升法：將色譜板垂直于盛有展開劑的容器中，適合于含粘合劑的色 譜板。 （2）傾斜上行法：色譜板傾斜10-15°角；色譜板傾斜45-60°角。 （3） 下降法： 用濾紙或紗布等將展開劑吸到薄層板的上端， 使展開劑沿板下行， 這種連續(xù)展開的方法適用于Rf 值小的化合物。 （4）雙向色譜法：將樣品點在方形薄層板的角上，先向一個方向展開，然后轉

18、動90°角的位置，再換另一種展開劑展開。適合于成分復雜的化合物分離。 注意：展開時，不要讓展開劑前沿上升至底線。否則，無法確定展開劑上升高 度，即無法求得Rf值和準確判斷粗產物中各組分在薄層板上的相對位置。 5、硅膠G薄層如何涂布和活化？ 答：取硅膠 G 或硅膠 GF一份，置燒杯中加水約 5 份混合均勻，放置片刻，隨 即用藥匙取一定量，分別倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推動涂 布），均勻涂布成0.250.5mm厚度，輕輕振動玻璃板，使薄層面平整均勻，在 水平位置放置，待薄層發(fā)白近干，于烘箱中 100活化 0.51 小時，冷后貯于 干燥器內備用?；罨瘻囟群蜁r間可依需要調整，一

19、般檢識水溶性成分或一些極 性大的成分時，所用薄層板只在空氣中自然干燥，不經活化即可貯存?zhèn)溆谩?6、薄層色譜法有哪些優(yōu)點？ 答：薄層色譜法是一種高效、簡便的分離方法，其優(yōu)點是：快速，全過程只需 1060min（紙色譜法需幾小時到幾十小時）；分離效率高；靈敏度高，可檢出 0.01 g m 的物質；顯色的方法比紙色譜法多；應用面廣。 7、薄層色譜法中展開劑、吸附劑是如何選擇的？ 答：薄層色譜法的固定相吸附劑顆粒要比柱色譜法細得多，其直徑一般為 1040 m m 。由于被分離的對象及所有展開劑的極性不同，應選用活性不同的吸 附劑作固定相，吸附劑的活性可分為IV級，I級活性最強，V級的活性最弱。 吸附劑和展開劑選擇的一般原則是：非極性組分的分離，選用活性強制吸附劑， 用非極性展開劑；極性組分的分離，選用活性弱的吸附劑，用極性展開劑。實 際