粗蛋白的測定方法原理及操作探討

1、粗蛋白的測定方法原理及操作探討粗蛋白的測定方法原理及操作探討 中央化驗室中央化驗室 陸學(xué)文陸學(xué)文 2012-02-15 蛋白質(zhì)是含氮的有機化合物。在催化劑作用下，用硫酸破壞有機物，使含氮物轉(zhuǎn)化成硫酸銨。加入強堿進(jìn)行蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，測出氮含量，將結(jié)果乘以換算系數(shù)6.25，計算出粗蛋白含量。1 凱氏定氮儀原理：1.1 消化 首先將含氮有機物與濃硫酸共熱，經(jīng)一系列的分解、碳化和氧化還原反應(yīng)等復(fù)雜過程，最后有機氮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機氮硫酸銨，這一過程稱為有機物的消化。 消化：蛋白質(zhì) + H2SO4 （NH4）2SO4+ SO2+ CO2+ H2O 1、消化 樣品中的有機物和含N有機化合物

2、，經(jīng)濃H2SO4加熱消化，H2SO4使有機物脫水，炭化為碳；碳將H2SO4還原為SO2，而本身則變?yōu)镃O2；SO2使N還原為NH3，而本身則氧化為SO3，而消化過程中所生成的新生態(tài)氫，又加速了氨的形成。在反應(yīng)中生成物CO2、H2O和SO2、SO3逸去，而NH3與H2SO4結(jié)合生成（NH4）2SO4留在消化液中。蛋白質(zhì)+H2SO4 CC+H2SO4 SO2+CO2SO2+N NH3+SO3NH3+H2SO4 （NH4）2SO42CH3CHCOOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O NH2 濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水并炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又有氧化性，使炭

3、化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫： 二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中：NH3+H2SO4（NH4）2SO4 消化完成后，取出放涼后加入約30mL蒸餾水。將消化液轉(zhuǎn)入凱氏定氮儀反應(yīng)室，加入過量的40%氫氧化鈉溶液，將NH4+轉(zhuǎn)變成NH3，通過蒸餾把NH3驅(qū)入過量的硼酸溶液接受瓶內(nèi)，硼酸接受氨后，形成四硼酸銨，然后用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)原來的氫離子濃度。1.2 蒸餾蒸餾：（NH4）2SO4 + 2NaOH Na2SO4+ 2H2O + 2NH3 2NH3 + 4H3BO3 （NH4）2B4O7+ 5H2O 1.3 滴定

4、滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸摩爾數(shù)即為NH3的摩爾數(shù)，通過計算即可得出總氮量。在滴定過程中，滴定終點采用甲基紅-次甲基藍(lán)混合指示劑顏色變化來判定。測定出的含氮量是樣品的總氮量，其中包括有機氮和無機氮。 滴定：（NH4）2B4O7+ 2HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4 H3BO3 總反應(yīng)式如下： 消化： 蛋白質(zhì) + H2SO4 （NH4）2SO4 + SO2+ CO2 + H2O 蒸餾：（NH4）2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2 H2O + 2NH3 2NH3 + 4H3BO3 （NH4）2B4O7 + 5H2O 滴定：（NH4）2B4O7 + 2HCl + 5H2O 2NH4Cl

5、 + 4 H3BO3 蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜的含氮化合物，每種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量約在1418，平均為16（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。凱氏定氮法測定出的含氮量，再乘以系數(shù)6.25（100166.25） ，即為蛋白質(zhì)含量。 從總反應(yīng)式中可以看出，滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸摩爾數(shù)即為NH3的摩爾數(shù)。1、例如:0.7g南美魚粉(粗蛋白為65%)消耗的鹽酸摩爾數(shù)即為氨氣的摩爾數(shù)。(65%=NHCl .k /m = CHCl V 8.75 /0.7) 當(dāng)濃度為0.2mol/L時，一般消耗鹽酸的體積約為26mL： NHCl =NNH3 0.0052 mol （NH4）2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2 H2O + 2

6、NH3 2 2 0.0052 mol 0.0052 mol 即硫酸銨消耗VNaOH = 0.0052mol / 9.6mol/L =0.000542 L = 0.542 mL2、0.4g CuSO45H2O中，硫酸銅的摩爾數(shù)為0.4/250=0.0016mol CuSO4 + 2NaOH =Cu(OH)2 +Na2SO4 1 2 0.0016mol 0.0032mol 硫酸銅消耗VNaOH = 0.0032mol / 9.6mol/L =0.33mL 由此可見，硫酸銨和硫酸銅消耗的氫氧化鈉的量較少，氫氧化鈉主要是與硫酸發(fā)生中和反應(yīng)。樣品和試劑消耗氫氧化鈉的量 從總反應(yīng)式中可以看出，滴定消耗的標(biāo)

7、準(zhǔn)鹽酸摩爾數(shù)即為NH3的摩爾數(shù)。消化中消耗硫酸的量1. K2SO4 + H2SO4 = 2KHSO4 2KHSO4 = K2SO4+H2O+SO3 1 1 6/174=0.03448 mol 0.03448mol硫酸鉀消耗硫酸VH2SO4 = 0.03448mol / 18.4mol/L = 1.87 mL2. 硫酸銅的作用機理如下所示：C2CuSO4（加熱）Cu2SO4+SO2+CO2 2 1Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+2H2O+SO21 2 2CuSO4-Cu2SO4-2H2SO4 2 2 0.4/160 0.0025mol硫酸銅消耗硫酸VH2SO4 = 0.0025mol /

8、 18.4mol/L = 0.14 mL以下是儀器商提供消耗硫酸的量參考數(shù)據(jù)：3. 1g樣品消耗3.6-7mL4. 蒸發(fā)損失1.2mL5. 管內(nèi)殘留1.7-5.1mL (1) 40%NaOH（NaOH含量96%，以96%計）的摩爾濃度 =（40g96% / 40g/mol）/ 0.1L = 9.6mol/L (2) 濃H2SO4的摩爾濃度=18.4mol/L (3) 那么50mL 40%NaOH溶液 能與多少體積的濃硫酸反應(yīng)？ NaOH主要與 （NH4）2SO4 、硫酸銅、硫酸反應(yīng)，而加入的堿量是固定的（50 mL），因此當(dāng)加入的酸過多時，酸就會消耗過多的堿，從而不能使（NH4）2SO4 與堿

9、充分反應(yīng)，生成的氨氣量減少，最后不能反映出實際的含氮量 . 在消化的過程中，硫酸也會有損失， 但從主要反應(yīng)中可以估算出加酸的量：不能多于13mL H2SO4 + 2NaOH Na2SO4+ 2H2O 1 2 18.4mol/LV1 9.6mol/L50mL V1 =13.04 mL 濃硫酸的用量與濃硫酸的用量與40%NaOH 溶液的關(guān)系溶液的關(guān)系 (1) 硫酸：化學(xué)純，含量為98%，無氮； (2) 混合催化劑：0.4g CuSO45H2O，6g K2SO4 , 均為化學(xué)純，磨碎混勻；(藥品先過篩，后各稱量，再混合) (3) NaOH：40% 水溶液，化學(xué)純； (4) 硼酸：4% 水溶液，化學(xué)純

10、； (5) 混合指示劑（甲基紅-亞甲基藍(lán)=2:1,配置濃度都為0.1%）； (6) 0.2mol/LHCl標(biāo)準(zhǔn)溶液； (7) 蔗糖：分析純； (8) 硫酸銨：分析純，干燥； (9) 硼酸吸收液。2 實驗試劑:3 儀器實驗用樣品粉碎機或研缽；40目（0.45 mm）分析篩；分析天平；消化裝置；酸式滴定管；凱氏定氮蒸餾裝置。 4 操作步驟: 磨樣 稱樣 加入催化劑和濃硫酸 消化 蒸餾 滴定4.1 磨樣確保樣品均勻，顆粒細(xì)度（1 mm）。4.2 稱樣 用差量法稱取試樣 0.5 1g（含氮量5 80mg），準(zhǔn)確至0.0002g，小心無損的將樣本放入洗凈烘干的凱氏消化管中。 加減樣時要細(xì)心，不能抖動樣匙

11、。否則會引起樣品的自動分級，使加入的硬質(zhì)部分多，粉末部分少，造成實驗不精確。 樣品放入消化管內(nèi)時，盡量不要沾附管壁上，萬一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結(jié)果偏低。 加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時作堿性反應(yīng)的指示劑。 加濃硫酸要沿著消化管口緩慢加入，同時輕輕轉(zhuǎn)動消化管，使散落在管口處的樣品接觸到硫酸并被碳化，有利于樣品的完全消煮。 如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當(dāng)硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量。4.3 加入催化劑和濃硫酸 加入 6.4g 混合催化劑與試樣混合均勻，再加入 12mL

12、 濃硫酸。 消化時如不容易呈透明溶液，可將消化管放冷后，慢慢加入30%過氧化氫2-3ml，促使氧化。4.4 消化 420, 2h, 直至呈透明的藍(lán)綠色。消煮時間不能過短，要達(dá)2 h以上，否則樣品消煮不完全，也會造成很大的實驗誤差。 開始消化時，當(dāng)有白煙(SO2)產(chǎn)生后，先把抽氣的水流量滿負(fù)荷開大，十分鐘后再調(diào)小，調(diào)小量以煙霧能留在消化管內(nèi)而又不冷凝成滴為宜，以免使硫酸損失過大。4.5 蒸餾 向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往出現(xiàn)褐色沉淀物，這是由于分解促進(jìn)堿與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅（藍(lán)色），經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀（黑色）。有時銅離子與氨作用，生成深蘭色的結(jié)合物Cu(NH3)4+CuSO

13、4 + 2NaOH =Cu(OH)2 +Na2SO4 氫氧化銅藍(lán)色沉淀Cu(OH)2= CuO + H2O 氧化銅黑色的沉淀2CuO + H2O + CO2 =Cu2(OH)2CO3 堿式碳酸銅 墨綠色黑色的沉淀有可能是Cu2(OH)2CO3和CuO 蒸餾時間以流出的液體呈中性為宜，可用pH試紙測試。4.6 滴定 滴定終點的判斷準(zhǔn)確的滴定終點判斷是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的一個關(guān)鍵。在判斷終點時，要敏銳地把握溶液臨界顏色的變化， 甲基紅-亞甲基藍(lán)混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。 用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定時，溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點。 滴定濃度鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度必須精確

14、適中，不宜過高也不宜過低。濃度過高，加大滴定終點的控制難度；過低，滴定消耗的鹽酸量過大。4.6.1 混合指示劑變色范圍甲基紅-次甲基藍(lán)變色點pH=5.4，5.2（紅紫）5.4（灰藍(lán)）5.6（綠），保存于棕色瓶中。甲基紅-溴甲酚綠 變色點PH=5.1pH 5.0 以下為暗紅色，pH 5.1 為灰綠色，pH 5.2 以上為綠色。 在酸中酒紅色，堿性為綠色，做粗蛋白時是由藍(lán)綠色變成灰紅色4.6.2 混合指示劑變色原理 當(dāng)溶液PH值發(fā)生變化時，指示劑可能失去質(zhì)子由酸色成分變?yōu)閴A色成分，也可能得到質(zhì)子由堿色成分變?yōu)樗嵘煞郑辉谵D(zhuǎn)變過程中，由于指示劑本身結(jié)構(gòu)的改變，從而引起溶液顏色的變化。指示劑的酸色成分或堿色成分是一對共軛酸堿酸式色 堿式色-H+H 蒸餾步驟的檢驗精確稱取0.2g硫酸銨代替試樣，按相同蒸餾步驟進(jìn)行操作，測得硫酸銨含氮量為21.190.2%，否則應(yīng)檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。 6 空白測定稱取蔗糖0.5g，代替試樣