實驗一、RNA提取方法及原理

1、實驗一、RNA提取方法及原理一、研究背景二、方法及原理一、研究背景1. RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白質是三種重要的生物大分子，是生命現(xiàn)象的分子基礎。 DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀，而mRNA在信息傳遞中起很重要的作用。其它兩大類RNA，rRNA和tRNA，同樣在蛋白質的生物合成中發(fā)揮不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質的過程中舉足輕重。 2 RNA分布不同豐度不同豐度組織名稱組織名稱樣品樣品量量總總RNARNA含量含量高豐度高豐度肝臟肝臟1mg1mg2-4g2-4g脾臟脾臟1mg1mg心臟心臟1mg1mg中豐度中豐度

2、大腦大腦1mg1mg0.05-2g0.05-2g胚胎胚胎1mg1mg腎臟腎臟1mg1mg肺肺1mg1mg低豐度低豐度膀胱膀胱1mg1mg0-0.05g0-0.05g骨骨1mg1mg脂肪脂肪1mg1mg高豐度高豐度成纖細胞成纖細胞10105 50.5-1g0.5-1g人白細胞人白細胞10105 5中豐度中豐度酵母酵母10105 50.5-1.5g0.5-1.5g擬南芥葉片擬南芥葉片1mg1mg0.2-0.5g0.2-0.5g低豐度低豐度煙草葉片煙草葉片1mg1mg0.05-0.1g0.05-0.1g玉米葉片玉米葉片1mg1mg二、方法及原理1 、 RNA的提取流程 （1）樣本前處理 （2）細胞裂

3、解 （3） RNA的純化及獲得RNA提取流程 樣品前處理注意點 選擇新鮮血液，不得超過選擇新鮮血液，不得超過4 4小時小時選擇新鮮的幼嫩組織選擇新鮮的幼嫩組織選擇處于生長旺盛的時期收集細胞選擇處于生長旺盛的時期收集細胞選擇新鮮組織，生長旺盛的組織選擇新鮮組織，生長旺盛的組織可將新鮮血液先進行紅細胞裂解，得到的白細胞可將新鮮血液先進行紅細胞裂解，得到的白細胞然后加入一定量的然后加入一定量的TRNzolTRNzol，-70-70保存較長時間保存較長時間去掉培養(yǎng)基，加入一定量去掉培養(yǎng)基，加入一定量TRNzolTRNzol-70 -70 保存較長時間保存較長時間推薦使用專門的推薦使用專門的RNARNA

4、樣品樣品儲存液進行儲存儲存液進行儲存液氮或加入液氮或加入RNaseRNase抑制劑中保存，抑制劑中保存，避免反復凍融避免反復凍融RNA提取流程 樣品前處理中如何保存樣本RNA提取流程細胞裂解，以釋放RNA異硫氰酸胍異硫氰酸胍/酚酚TRNzol總總RNA提取試劑提取試劑獨特配方獨特配方-RNAplant植物植物RNA提取試劑提取試劑胍鹽胍鹽/-巰基乙醇巰基乙醇RNAprep系列系列RNA提取試劑盒提取試劑盒RNA提取流程 RNA的純化及獲得RNA純化要求1 1 純化后不應存在對酶純化后不應存在對酶( (如逆轉錄酶如逆轉錄酶) )有抑制作用物質有抑制作用物質2 2 排除有機溶劑和金屬離子的污染排除

5、有機溶劑和金屬離子的污染3 3 蛋白質、多糖和脂類分子等的污染降低到最低程度蛋白質、多糖和脂類分子等的污染降低到最低程度4 4 排除排除DNADNA分子的污染分子的污染2. RNA提取的注意事項杜絕外源酶的污染a.嚴格戴好口罩，手套。 b.實驗所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。 c.實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。 阻止內源酶的活性 a.選擇合適的勻漿方法。 b.選擇合適的裂解液。 c.控制好樣品的起始量。 明確自己的抽提目的 a.任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。 b.RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟的標準

6、是后續(xù)實驗的一次成功，而不是得率。 Rnase 污染的污染的10大來源大來源 1：手指頭 2：槍頭 3：水/緩沖液 4：實驗臺面 5：內源 Rnase 6：RNA 樣品7：質粒抽提 8：RNA 保存 9：陽離子 (Ca, Mg) 10：后續(xù)實驗所用的酶 復習核酸的提取方法lRNA的提取l苯酚水溶液提取l細胞破碎 勻漿等體積90苯酚水溶液振蕩RNA、Pro分開RNA、多糖（水層）； DNA、Pro（苯酚層）l冷酚法、熱酚法，注意苯酚除雜復習核酸的提取方法l DNA提取l濃鹽法：1mol/L氯化鈉溶液提取，含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振蕩除去蛋白質 l或：先用稀鹽除去RNAPro，再用濃鹽提取l也可

7、用苯酚法，苯酚層得到 DNA、Pro 復習核酸的提取方法l核酸的沉淀lDNA的等電點4-4.5，RNA的等電點2-2.5.l收集上面的的水樣層后，RNA 可以通過異丙醇沉淀。l在除去水樣層后，樣品中的DNA 和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。 Trizol 試劑提RNA的原理lTrizol 試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑 。Trizol中含苯酚和異硫氰酸胍，可保護RNA免受RNase的污染。 lTrizol試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性，裂解細胞并釋

8、放出RNA,酸性條件使RNA與DNA分離,加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。 TRIzol法提取流程1. 樣品處理： 組織：取 100mg 組織（新鮮或 -70 及液氮中保存的組織均可）置勻漿器中 ，加入 1ml Trizol 充分勻漿，勻漿液轉1.5ml 離心管中,室溫靜置 min 。2 .加入 0.2ml 氯仿，振蕩 15s ，靜置 2min 。 3 .4 離心， 13000g 15m

9、in ，取上清。 4 .加入 與上清1:1的異丙醇(約0.5ml)，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置 20min (-20 ，時間長效果更好)。 取取200-300ul從從5步往下做。步往下做。 TRIzol法提取流程5 .4 離心， 13000g 10min ，棄上清。 6 .加入 1ml 75% 乙醇，洗滌沉淀,將沉淀打碎。 4 ， 13000g 5min ，棄上清。 7.100%乙醇,輕輕洗滌沉淀.(不用將沉淀打碎)8. 晾干，加入適量的 H 2 O 溶解（100ul）（ 65 促溶 10-15min ）。9.定量。 細胞細胞基因組基因組DNA水相有機相RNA氯仿氯仿純化純化pH5.7離心離

10、心加入裂解液加入裂解液(TRNzol-A+)實驗流程圖實驗流程圖細胞選擇細胞選擇 貼壁細胞貼壁細胞 懸浮細胞懸浮細胞q RNA RNA 的降解的降解 q ODOD260260 /OD /OD280280 比值偏低比值偏低q 電泳帶型異常電泳帶型異常q 下游實驗效果不佳下游實驗效果不佳q 新鮮細胞或組織：新鮮細胞或組織： 裂解液的質量裂解液的質量 外源外源RNaseRNase的污染的污染 裂解液的用量不足裂解液的用量不足 組織裂解不充分組織裂解不充分 另外某些富含內源酶的樣品另外某些富含內源酶的樣品 ( (如脾臟，胸腺等如脾臟，胸腺等) )，很，很難避免難避免 RNA RNA 的降解。的降解。

11、建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液多裂解液。q 冷凍樣品：冷凍樣品： 樣品取材后應立即置于液氮中速凍，然后可以移至樣品取材后應立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70-70冰箱保存。樣品要相對小一點；冰箱保存。樣品要相對小一點； 先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿； 樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預冷，碾磨過程中及時補充液氮。預冷，碾磨過程中及時補充液氮。OD260 /OD280 比值偏低q 蛋白質污染：蛋白質污染：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先

12、混勻，并且離心分不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。層的離心力和時間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法解決辦法: :重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚殘留：苯酚殘留：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。層的離心力和時間要足夠。解決辦法解決辦法: :重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260 /OD280 比值偏低q 抽提試劑殘留：抽提試劑殘留：確保洗滌時要

13、徹底懸浮確保洗滌時要徹底懸浮 RNARNA，并且徹底去掉，并且徹底去掉 75% 75% 乙醇。乙醇。解決辦法解決辦法: :再沉淀一次后，溶解。再沉淀一次后，溶解。q 設備限制：設備限制：測定測定OD260 OD260 及及OD280 OD280 數(shù)值時，要使數(shù)值時，要使OD260 OD260 讀數(shù)在讀數(shù)在 0.10 - 0.50 0.10 - 0.50 之間。此范圍線性最好。之間。此范圍線性最好。q 用水稀釋樣品：用水稀釋樣品：測測 OD OD 時，對照及樣品稀釋液請使用時，對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris10 mM Tris，pH 7.5pH 7.5。用。用水作為稀釋液將導致比值

14、的降低。水作為稀釋液將導致比值的降低。 q 非變性電泳：非變性電泳： 上樣量超過上樣量超過 3ug，電壓超過，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，電泳緩沖液陳舊，均可能導致均可能導致 28S 和和 18S 條帶分不開。條帶分不開。q 變性電泳條帶變淡：變性電泳條帶變淡： EB 與單鏈的結合能力要差一些，故同樣的上樣量，與單鏈的結合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；變性電泳比非變性電泳要淡一些； 甲醛的質量不高甲醛的質量不高 。q RNA RNA 降解降解 q 抽提試劑的殘留抽提試劑的殘留 75% 75% 乙醇洗滌乙醇洗滌 q 樣品中雜質的殘留樣品中雜質的殘留 多糖等雜質，再次沉淀多糖等雜質，再次沉淀 q DNA DNA 污染污染 使用使用RNase-Free RNase-Free 的的 DNase I DNase I 消化抽提消化抽提RNA RNA RNA的保存l短期保存：可將RNA溶解于TE緩沖液(10mmolL Tris，1mmolL EDTA)或無：RNA酶水(0.1mmolL EDTA)中，保存于一20。在保存RNA樣品時，通常使用EDTA來螯合RNA酶以防止其降解RNA。值得注意的是，許多實驗室配制EDTA后常使用很長時間甚至數(shù)年，這種長期使用的EDTA溶液常有微生物存在，反而會造成RN