三代遺傳標記資料講解

1、三代遺傳標記三代遺傳標記分子標記是繼形態(tài)標記、細胞標記和生化標記之后開展起來的一種較為理想的遺傳標記形 式,它以蛋白質、核酸分子的突變?yōu)楦?檢測生物遺傳結構與其變異.分子標記技術從本質上講,都是以檢測生物個體在基因或基因型上所產(chǎn)生的變異來反映生物個體之間的差異.每 一種分子標記都有其自身的特點和特定的應用范圍,但就一般意義而言,DNA分子標記與形態(tài)標記和生化標記等相比,具有許多獨特的優(yōu)點：不受組織類別、發(fā)育階段等影響.植株 的任何組織在任何發(fā)育時期均可用于分析.不受環(huán)境影響.由于環(huán)境只影響基因表達(轉錄與譯),而不改變基因結構即DNA的核甘酸序列.標記數(shù)量多,普及整個基因組.多態(tài)性高,自然存

2、在許多等位變異.有許多標記表現(xiàn)為共顯性,能夠鑒別純合基因型和雜合基因型,提供完整的遺傳信息. DNA分子標記技術簡單、快速、易于自動化.提取的 DNA樣品,在適宜條件下可長期保存,這對于進行追溯性或仲裁性鑒定非常有利.因 此,DNA分子標記可以彌補和克服在形態(tài)學鑒定及同工酶、蛋白電泳鑒定中的許多缺陷和 難題,因而在品種鑒定方面展示了廣闊的應用前景.1. 1第1代分子標記1.1. 1 RFLP標記技術.1980 年Botesin 提出的限制性片段長度多態(tài)性 (Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP)可以作為遺傳標記,開創(chuàng)了直接應用 DNA多

3、態(tài)性的新階段,是最早應用的分子標記技術 .RFLP是檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小,反映DNA分子上不同酶切位點的分布情況,因此DNA序列上的微小變化,甚至1個核 甘酸的變化,也能引起限制性內(nèi)切酶切點的喪失或產(chǎn)生,導致酶切片段長度的變化.優(yōu)點：RFLP標記的等位基因具有共顯性的特點,結果穩(wěn)定可靠,重復性好,特別適應于構 建遺傳連鎖圖.缺點：在進行 RFLP分析時,需要該位點的DNA片段做探針,用放射性同位素及核酸雜 交技術,既不平安又不易自動化.另外,RFLP對DNA多態(tài)性檢出的靈敏度不高,RFLP連鎖圖上還有很多大的空間區(qū).1.1.2 RAPD 標記技術.為了克服R

4、FLP技術上的缺點,Williams等于1990年建立了隨機擴增多態(tài) DNA Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD技術,由于其獨特的檢測 DNA 多態(tài)性的方式使得RAPD技術很快滲透于基因研究的各個領域.RAPD是建立于PCR根底之上的分子標記技術,根本原理是利用一個隨機引物 810個堿基通過PCR反響非定點地擴增 DNA片段 然后用凝膠電泳別離擴增片段來進行DNA多態(tài)性研究.對任一特定引物而言,它在基因組DNA序列上有其特定的結合位點,一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變,就可能導致這些特定結合位點的分布發(fā)生變化,從而導致擴增產(chǎn)物的數(shù)量

5、和大小發(fā)生改變,表現(xiàn)出多態(tài)性.優(yōu)點：與RFLP相比,RAPD技術簡單 檢測速度快,DNA用量少,實驗設備簡單,不需 DNA探針,設計引物也不需要預先克隆標記或進行序列分析,不依賴于種屬特異性和基因組的結構,合成一套引物可以用于不同生物基因組分析,用一個引物就可擴增出許多片段,而且不需要同位素,平安性好.缺點：當然,RAPD技術受許多因素影響,實驗的穩(wěn)定性和重復性差,首先是顯性遺傳,不 能識別雜合子位點,這使得遺傳分析相對復雜,在基因定位、作連鎖遺傳圖時,會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準確性屬特異性和基因組的結構,合成一套引物可以用于不同生物基因組分析 用一個引物就可擴增出許多片段,而

6、且不需要同位素,平安性好.當然,RAPD技術受許多因素影響,實驗的穩(wěn)定性和重復性差,首先是顯性遺傳,不能識別雜合子 位點,這使得遺傳分析相對復雜,在基因定位、作連鎖遺傳圖時,會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準確性下降；其次,RAPD對反響條件相當敏感,包括模板濃度、Mg2 +濃 度,所以實驗的重復性差.1. 1. 3 AFLP標記技術擴增片段長度多態(tài)技術(AFLP),又名限制片段選擇擴增技術(Selective restrictionfragment amplifi2cation ,SRFA), 于 1993 年由荷蘭 KEYGENE 公司的 Zabean 和 Vos 等創(chuàng)造,并已申請

7、專利.AFLP是近年來迅速開展起來的一種分子標記技術,它將基因組DNA用成對的限制性內(nèi)切酶雙酶切后產(chǎn)生的片段用接頭(與酶切位點 互補)連接起來,并通過5端與接頭互補的半特異性引物擴增得到大量DNA片段,從而形成指紋圖譜的分子標記技術.AFLP指紋呈孟德爾式共顯性和顯隱性遺傳.優(yōu)點：它兼具 RAPD與RFLP的優(yōu)點,有較高的穩(wěn)定性,用少量的選擇性引物能在較短 時間內(nèi)檢測到大量位點,并且每對引物所檢測到的多個位點都或多或少地隨機分布在多條染色體上,各染色體上AFLP標記的數(shù)目與染色體長度呈正相關(r = 0. 501),而一對引物獲得的標記涉及的染色體數(shù)與標記數(shù)呈正相關(r = 0. 826).因

8、此,通過少量效率高的引物組合可獲得覆蓋整個基因組的AFLP標記.目前,AFLP作為一種高效的指紋技術,已在遺傳育種研究中發(fā)揮它的優(yōu)勢.缺點：不過也有研究認為,AFLP對基因組純度和反響條件要求較高,另外用于遺傳作圖 時,少數(shù)的標記與圖譜緊密度有出入.此外,在RAPD和RFLP技術根底上建立了SCARSequence characterize damplified regions ,序列特異性擴增區(qū)域 、CAPSCleaved ampli2fied polymorphic sequence ,酶切擴增多態(tài)序列和 DAFDNAam2plified fingerprints ,DNA擴增指紋等標記技

9、術.這些技術的出現(xiàn),進一步豐富、完善了第1代分子標記技術,增加了人們對DNA多態(tài)性的研究手段.1.2第2代分子標記1. 2. 1 SSR標記技術.在真核生物基因組中存在許多非編碼的重復序列,如重復單位長度在 1565個核甘酸的小衛(wèi)星DNAMinisatellite DNA,重復單位長度在 26個核甘酸的 微衛(wèi)星DNA Microsatellite DNA .小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA 分布于整個基因組的不同位點.由于 重復單位的大小和序列不同以拷貝數(shù)不同,從而構成豐富的長度多態(tài)性.Moore等于1991年結合PCR技術創(chuàng)立了 SSR Simple sequence repeat , 簡單重復序列標記

10、技術.SSR 也稱微衛(wèi)星DNA,是一類由幾個多為15個堿基組成的基序串聯(lián)重復而成的DNA序列,其中最常見的是雙核甘酸重復,即CA n和TG n,每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結構相同,重復單位數(shù)目1060個,其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同.不同遺傳材料重復 次數(shù)不同,導致了 SSR長度的高度變異性,這一變異性正是 SSR標記產(chǎn)生白根底.SSR標記 的根本原理：根據(jù)微衛(wèi)星重復序列兩端的特定短序列設計引物,通過PCR反響擴增微衛(wèi)星片段.由于核心序列重復數(shù)目不同,因而擴增出不同長度的PCR產(chǎn)物,這是檢測DNA多態(tài)性的一種有效方法.微衛(wèi)星序列在群體中通常具有很高的多態(tài)性,而且一般為共顯性,因此是一類

11、很好的分子標記.目前已利用微衛(wèi)星標記 構建了人類、小鼠、大鼠、水稻、小麥、玉米等物種的染色體遺傳圖譜.優(yōu)點：這些 微衛(wèi)星標記 已被廣泛應用于基因定位及克隆、疾病診斷、親緣分析或品種 鑒定、農(nóng)作物育種、進化研究等領域.此外 ,SSR標記不僅能夠鑒定名合體和雜合體,而且結果更加可靠,方法簡單,省時省力.2. 2. 2 ISSR標記技術.ISSR即內(nèi)部簡單重復序列,是一種新興的分子標記技術.1994年Zietkiewicz 等對SSR技術進行了開展,建立了加錨微衛(wèi)星寡核甘酸 (Anchored microsatellite oligo nucleotides) 技術.他們用加錨定的微衛(wèi)星寡核甘酸作引

12、物,即在SSR的5端或3 端加上24個隨機選擇的核甘酸,這可引起特定位點退火,從而導致與錨定引物互補的間隔不太大 的重復序列間的基因組節(jié)段進行PCR擴增.這類標記又被稱為ISSR ( Inter2simplesequence repeat )、ASSR(Anchored simple sequence repeats) 或 AMP2PCR .在所用的兩翼引物中,可以一個是ASSR引物,另一個是隨機引物.如果一個是5端加錨的ASSR引物,另一個是隨機引物,那么被稱為RAMP技術19.用于ISSR2PCR擴增的引物通 常為1618個堿基序列,由14個堿基組成的串聯(lián)重復和幾個非重復的錨定堿基組成,從

13、而保證了引物與基因組 DNA中SSR的5 或末端結合通過PCR反響擴增SSR之間的 DNA片段.優(yōu)點：SSR在真核生物中的分布是非常普遍的,并且進化變異速度非?？?因而錨定引物的ISSR2PCR可以檢測基因組許多位點的差異.與SSR2PCR相比,用于ISSR2PCR的引物不需要預先的 DNA測序,也正因如此,有些ISSR引物可能在特定基因組DNA中沒有配對區(qū)域而無擴增產(chǎn)物,通常為顯性標記,呈孟德爾式遺傳,且具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性.1. 3第3代分子標記1. 3. 1 SNP標記技術.單核甘酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被稱為第3代DNA

14、分子 標記,是指同一位點的不同等位基因之間個別核甘酸的差異,這種差異包括單個堿基的缺失或插入,更常見的是單個核甘酸的替換,且常發(fā)生在喋吟堿基(A與G)和喀咤堿基(C與T)之間.SNP標記可幫助區(qū)分兩個個體遺傳物質的差異,被認為是應用前景最好的遺傳標記.目前,已有2 000多個標記定位于人類染色體上,在擬南芥上也已開展出236個SNP標記.在這些SNP標記中大約有 30 %包含限制性位點的多態(tài)性.優(yōu)點：檢測SNP的最正確方法是 DNA芯片技術,最新報道的微芯片電泳(Microchip electrophoresis),可以高速度地檢測臨床樣品的SNP ,它比毛細管電泳和板電泳的速度可分別提升10

15、和50倍.SNP與第1代的RFLP及第2代的SSR標記的不同有2個方面： 其一 ,SNP不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段,而直接以序列變異作為標記；其 二,SNP標記分析完全摒棄了經(jīng)典的凝膠電泳,代之以最新的DNA芯片技術.1. 3. 2 EST標記技術.表達序列標簽(Expressed sequence Tag , EST)是美國國立衛(wèi)生研究院 (NationalInstitutes of Health ,NIH) 的生物學家 Venter于1991年提出的.隨著人類基因組方案 的開展,EST技術首先被廣泛應用于尋找人類新基因,繪制人類基因組圖譜,識別基因組序列編碼區(qū)等研究領域,之后又被廣泛應用于植物基因組研究.EST是指在來源于不同組織的cDNA文庫中隨機挑選克隆、測序 得到局部cDNA序列,一個ES