腫瘤模型專題0001

1、腫瘤模型專題1. 最新的藥效學(xué)指導(dǎo)原則要求化藥臨床前進(jìn)行至少 5 種人源腫瘤的 體內(nèi)抗癌活性評(píng)價(jià)，以確定藥效及抗瘤譜。2. 瘤株對(duì)藥物的敏感性通過體外篩選可以說明，而體內(nèi)評(píng)價(jià)更大程 度上是考慮藥物經(jīng)體內(nèi)吸收、分布、代謝之后的活性，由于目前 的腫瘤模型多采用皮下接種，并不能完全反映藥物的組織分布對(duì) 其影響，所以感覺這種要求就顯得不是很必要。注解：體內(nèi)的敏 感性不是僅考慮吸收分布代謝的影響，一些樣品，體外活性都是 不錯(cuò)的，體內(nèi)甚至是瘤內(nèi)直接注射給到很高劑量都沒有效果，腫 瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外的生存環(huán)境差別很大，體外模擬的生存環(huán)境 完全不能體現(xiàn)出體內(nèi)的狀態(tài)。3. 皮下接種是一個(gè)目前能找到的最好的權(quán)宜之

2、計(jì)了，實(shí)際上， SFDA 明確表示，鼓勵(lì)原位腫瘤模型，但是由于技術(shù)的原因，很多瘤株 都無法實(shí)現(xiàn)。而皮下模型有它的一系列優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定，便于觀察， 易于構(gòu)建，易于控制等等，能夠在一定程度上反映藥物經(jīng)過體內(nèi) 過程的療效，所以目前只能用它來進(jìn)行評(píng)價(jià)。4. 實(shí)際上原位腫瘤模型仍然不能很好的反映臨床腫瘤的特點(diǎn)，目前 能夠預(yù)見得到最好的模型應(yīng)該是經(jīng)過基因修飾（轉(zhuǎn)基因等）的能 夠集中比較均勻的自發(fā)模型，這才是和臨床最接近的腫瘤模型。但是目前的經(jīng)過基因修飾的自發(fā)腫瘤模型種類很少，而且可控制 性差，周期長(zhǎng)，所以還要經(jīng)過很長(zhǎng)時(shí)間的改善才能大規(guī)模的應(yīng)用。5. 常規(guī)的腫瘤細(xì)胞株接種后如果不能成瘤，細(xì)胞懸液就會(huì)被動(dòng)物吸 收

3、6. 瘤體積可用游標(biāo)卡尺量最長(zhǎng)徑（ a）和最短徑（ b），體積計(jì)算公式： V=ab2/6, 每 2-3 天測(cè)一次。體積 =寬2* 長(zhǎng)/2 的公式計(jì)算腫瘤 體積；抑瘤率 =（對(duì)照組-治療組） / 對(duì)照組*100%； tumor size = width 2 · length · . ； ab2/6 ；關(guān)于腫瘤體積的計(jì)算： /6約等于/2 。如果想做得講究一點(diǎn)， 應(yīng)該用 RTV計(jì)算腫瘤體積： RTV （某日某老鼠的相對(duì)腫瘤體積） =TV（測(cè)量當(dāng)天該老鼠的腫瘤體積） /TV（分組當(dāng)天該老鼠的腫瘤體積） *100 ，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行平均值 SD等數(shù)據(jù)的計(jì)算7. 是否必須稱重小鼠的胸腺

4、和脾臟8. 超過 7 天的腹水再傳代就很容易出現(xiàn)血性；動(dòng)物的周齡也不要太 大， 6 周左右。傳代次數(shù)太多也很容易出現(xiàn)血性腹水。血性腹水 可以離心后加 N 的 NH4CL溶液破紅細(xì)胞，然后精確一些的控制條 件（接種量，傳代時(shí)間，動(dòng)物周齡等）傳幾代，很多情況下再傳 一兩代后會(huì)有不血性的種鼠出現(xiàn)，然后用這只種鼠的腹水繼續(xù)傳 代9. 皮下接種與剝瘤子：小鼠腫瘤剝瘤子是一個(gè)艱難的過程，但是可 以一定程度上的改善一下：接種的時(shí)候要精確控制接種在皮下， 靠皮內(nèi)會(huì)與皮膚強(qiáng)烈粘連，靠肌肉會(huì)與肌肉強(qiáng)烈粘連，而且不要 太靠腋窩里面， 可以往尾部靠一些， 也可以稍微的往背部靠一點(diǎn)， 不要往腹部靠，容易使腫瘤被墊料磨爛

5、。10. LD50 是毒理中的半數(shù)致死量， ED50是體外試驗(yàn)中的半數(shù)有效量， 一般體內(nèi)實(shí)驗(yàn)沒有類似的指標(biāo)，如果想比較幾個(gè)類似物的藥效還 是做量效曲線比較好。11. 劑量設(shè)置應(yīng)該按照 LD10（10%致死劑量，也叫最大耐受劑量）來分 組，一般分別采用 1/2 LD10, 1/4 LD10, 1/7 LD10或 1/10 LD,但最大劑量不得超過 LD10。這里面還得考慮 ED5 0，LD10與 ED50 的劑量相差越大越好。 用 LD50作為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置劑量是不現(xiàn)實(shí)的， 因?yàn)閯?dòng)物實(shí)驗(yàn)是不可能允許 10%以上動(dòng)物死亡的。12. 說到療效的比較，如只是發(fā)文章，比較不同基團(tuán)之間可能對(duì)母體 抑瘤率的影響，

6、一般做做體外試驗(yàn)，比一比大家的 IC50 就好了， 不太做體內(nèi)。如是真正的篩藥，我個(gè)人有些觀點(diǎn)：這個(gè)不是孤立 起來看某個(gè)或者某幾個(gè)劑量下誰比誰的抑瘤率高。主要要看誰更 具有可開發(fā)性。首先，要考慮它的毒性以及 治療窗口 的大小，通 俗的說，就是這個(gè)要在發(fā)揮療效的劑量下，毒性是否大？比如 A 藥，10mg抑瘤率有 50%，但是體重下降了 20%;而 B 藥，10mg的時(shí) 候根本無效， 30mg的時(shí)候有 40%的抑瘤率， 60mg的時(shí)候抑瘤率高 達(dá) 80%，而且體重幾乎沒有下降， 這個(gè)時(shí)候 A藥與 B 藥如何比較？ 特別如果是公司篩選新藥，還要考慮成本，病人可接受度（動(dòng)物 上的有效劑量換算到人一天要

7、吃 2 斤，這種藥也是不現(xiàn)實(shí)的） ，制 劑，工藝等等方面。如果單純從藥理的角度給出答案，至少要考慮毒性和劑量限制 的問題。13. 關(guān)于劑量選擇， LD50的幾分之一是一種比較通用的方法，目前相 對(duì)更合理一些的劑量選擇是做一個(gè)簡(jiǎn)單的多次給藥的毒理試驗(yàn)來 確定劑量，我們一般會(huì)連續(xù)給藥一周，然后再觀察一周，這樣摸 出來的最大劑量可以直接用于藥效試驗(yàn)，然后其他的劑量都在此 劑量的基礎(chǔ)上往下減。14. 說到給藥療程，一般初篩的藥物都是連續(xù)天天給藥， qd。 但是給 藥途徑，特別是與的選擇， 我們都是先做一個(gè)簡(jiǎn)單的 PK試驗(yàn)考察 一下，再確定， 特別是如果 PK試驗(yàn)的結(jié)果顯示， 血藥濃度甚至達(dá) 不到體外

8、IC50 的濃度，那么是否進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，就有待商榷了。 連續(xù)，小鼠的皮膚有時(shí)候會(huì)變厚，你可以換一邊給藥。15. 動(dòng)物選擇: KM小鼠,裸鼠,C57 等均可作為 ,但是個(gè)人認(rèn)為 KM能做 出來最好 , 畢竟比較有普遍性 , 還是正常生理狀態(tài)的健康動(dòng)物 , 比 較有說服力 , 還便宜 , 裸鼠或者其他特定品種 , 比較適合特定的瘤 株16. 關(guān)于腫瘤細(xì)胞活力的問題 : 一般培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞活力往往是不夠 的, 很難在短時(shí)間內(nèi)長(zhǎng)到規(guī)定重量 , 所以建議至少在動(dòng)物體內(nèi)傳 2 代, 讓腫瘤細(xì)胞活力充分體現(xiàn)以后再開始用于實(shí)驗(yàn) . 傳代數(shù)次的 原因在于讓腫瘤細(xì)胞充分活化，要不活化也行，多接種點(diǎn)吧17. 關(guān)于接

9、種部位的問題 : 以小鼠為例一般可以選擇腋下或者后肢 , 背 部血管不發(fā)達(dá) ,營(yíng)養(yǎng)不夠 ,一般不建議采用 .接種一般采用皮下注 射, 針頭沿皮膚水平進(jìn)入 ,然后挑起表皮 , 注射18. 關(guān)于腫瘤重量的問題 : 模型組腫瘤重量應(yīng)該不低于19. 肺內(nèi)原位注射制作腫瘤模型效果頗好 , 流程如下: 麻醉-固定-皮 膚消毒-剪開左側(cè)胸部皮膚 ,大約第 2-3 肋間的位置 -用鑷子輕 輕撥開皮下筋膜 , 可以看到呼吸運(yùn)動(dòng)的肺葉 -將準(zhǔn)備好的腫瘤細(xì) 胞注射入肺 ,30 微升 -分層縫合 OK20. 胸膜活檢穿刺針 規(guī)格： #20 #25(14G 12G) L 65 mm ；用途： 供人體胸腔穿刺，鉤取胸膜活

10、體組織用21. 開始做腫瘤藥效評(píng)價(jià)， 應(yīng)該采用 s180這些小鼠腫瘤模型。 一個(gè)方 面這些腫瘤對(duì)于藥物很敏感，而且周期短，花費(fèi)也少。但如果要 成藥，裸鼠模型是必需的。22. 一般瘤重的 SD在平均值的 7080%以下就還湊活，漂亮一點(diǎn)的是 在 30%以下，實(shí)在不行， 100%也勉強(qiáng)，就是特別難看，但是 SD 越 大，統(tǒng)計(jì)上就越不利23. 皮下腫瘤模型中，腋下最適合腫瘤生長(zhǎng)。接種時(shí)由裸鼠體側(cè)腰部 稍靠上的部位進(jìn)針，要保證與接種點(diǎn)的距離小于針頭的長(zhǎng)度，向 頭部方穿行，絕對(duì)不能刺破皮膚或者刺破肌肉層，當(dāng)針頭到達(dá)接 種位點(diǎn)時(shí)注射， 退出針頭， 這樣操作的目的并不完全是避免漏液， 其實(shí)熟練后，不需要皮下

11、穿行也不會(huì)漏液，主要是避免污染，進(jìn) 針點(diǎn)還有少量污染的可能性的，針頭在皮下穿行一段后，接種點(diǎn) 離進(jìn)針點(diǎn)較遠(yuǎn)，最大限度減少污染的可能。24. 如果是藥效試驗(yàn)， 不建議你用手術(shù)標(biāo)本， 因?yàn)?SFDA的臨床前研究 指導(dǎo)原則上明確指出要用建株的腫瘤株進(jìn)行試驗(yàn)，因?yàn)橛檬中g(shù)標(biāo)本的試驗(yàn)可重復(fù)性太差25. 一般用 4-5WK，體重 1517g 鼠，年輕鼠接種瘤容易長(zhǎng)26. 種植腎被膜下：第一該區(qū)免疫豁免，第二貼近腎可以從此獲得充 分的養(yǎng)料 . 在實(shí)驗(yàn)時(shí)先用顯微用的鑷子在腎被膜上撕慨一個(gè)小口 子, 然后種植。注意 :腎被膜和腎臟是有一個(gè)間隙可以用鑷子在被 膜下趕腫瘤組織到遠(yuǎn)離撕開口處 ,不用縫合被膜 .這樣就可

12、以了27. 人腫瘤模型用裸鼠，基本上沒有可成腹水的，只能皮下接種傳代28. nude mice 的數(shù)據(jù)在 SCID mice 上是比較有參考價(jià)值的，另外， 因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)的進(jìn)一步缺乏， 腫瘤生長(zhǎng)的進(jìn)程可能會(huì)比 nude mice 上更快一點(diǎn)29. 接種后，用干凈的棉簽按住注射部位才拔針 , 拔針后再按住 10 秒種左右 , 一般不會(huì)有液體滲出30. K562 第一代細(xì)胞接種的成瘤很好，傳一代就很差了，沒有幾只成 瘤的，到第三代就全軍覆沒31. 不贊同用 7901 這個(gè)瘤株，國際公認(rèn)度比較差32. 分組要求平行性，盡量縮小組間差異，組內(nèi)差異是實(shí)際情況的反 映。你可以按照腫瘤體積分層隨機(jī)分組，這樣平

13、行性比較好33. 腫瘤細(xì)胞懸液裸鼠接種前稀釋效果順序：相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基>PBS>saline34. 現(xiàn)在常用的陽性對(duì)照藥物是 CTX和 cisplatin ，另外乳腺癌可以 用 Taxol 。陽性藥的劑量途徑和療程不要求和樣品一致，不過給 藥途徑盡量一樣。還有，最好選用機(jī)制類似或者結(jié)構(gòu)類似的陽性對(duì)照。一般來說陽性對(duì)照的抑制率都會(huì)在 60%以上或者更大，少數(shù)情況下只有 50%左右。35. 細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物臨床前體內(nèi)試驗(yàn)一般至少應(yīng)選用 6 種人癌移 植瘤模型，其中應(yīng)包括 II 期臨床試驗(yàn)中擬篩選的腫瘤組織類型。36. 針對(duì)每一種人癌移植瘤模型，推薦采用相對(duì)腫瘤增殖率 T/C（%）

14、作為試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)通常為： T/C（%）>40 %為無效； T/C （%） 40%，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 P < 為有效。在體內(nèi)有效性試驗(yàn) 采用的全部人癌移植模型中，一般至少應(yīng)有 1/3 達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)。 注解：對(duì)于 T/C<40%，按照這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，很多現(xiàn)有的一線化療藥物 都會(huì)被淘汰37. 適于接種的瘤源的直徑最好為 1cm或者稍大一點(diǎn)，直徑 2cm可能 對(duì)于有些瘤株來說會(huì)太大了一點(diǎn)。一般來說，插塊法，一個(gè)瘤源 接種 30只動(dòng)物是沒有問題的，勻漿法一般 2 只也可以接種 30只 了38. 新的抗腫瘤藥物指導(dǎo)原則上強(qiáng)調(diào)要 3 代以上才能用，并且不能超 過 1520 代（人腫瘤）。

15、39. 只有少部分的小鼠實(shí)體瘤可以腹水傳代，人實(shí)體瘤幾乎沒有能夠 腹水傳代的40. 一般來說，小鼠腫瘤比較推薦路易斯肺癌和 B16。國內(nèi)的 S180并 不好，各實(shí)驗(yàn)室之間的變異很大。國外基本都不用它。其實(shí)并不 是因?yàn)?S180 有多好大家才選用他， 而是他進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的成本低， 周 期短，操作較容易41. 灌胃藥溶解用生理鹽水可以嗎： 不一定，根據(jù)混懸效果來看，一 般多用% 甲基纖維素鈉（ CMC-N）a42. 實(shí)體腫瘤不可以采用生命持續(xù)時(shí)間這個(gè)指標(biāo)， 這個(gè)是明確有規(guī) 定的43. 正常的實(shí)體腫瘤都是越長(zhǎng)越大，最后可能會(huì)潰破，但是沒有消亡 這個(gè)現(xiàn)象，如果腫瘤整體的自發(fā)消亡，說明模型有問題，最大可 能

16、是被污染了44. 出針掛組織的問題，關(guān)鍵在于針頭的磨制，在針后部的小突起于 小缺口吻合后，實(shí)體針彎曲方向應(yīng)該與套管針磨制的斜面一致， 接種時(shí)，實(shí)體針要推到底，也就是后面的小突起與小缺口契合， 然后針頭“舔住”肌肉層轉(zhuǎn)一圈再退針，還有就是瘤塊一定要完 全塞入針頭內(nèi)，外面不能有漏出來的。45.S180、H22 不需要測(cè)量腫瘤體積，試驗(yàn)結(jié)束后直接剝?nèi)∧[瘤成瘤 重46. 瘤株皮下成瘤率好，那么到了原位應(yīng)該會(huì)更好47. 建議最好流水線操作，確保每一個(gè)步驟都是同一個(gè)人做到底的， 比如插塊法，可以一個(gè)人切，一個(gè)人塞瘤塊，一個(gè)人接種；比較 忌諱每個(gè)人自己切自己塞自己接種，然后只做一部分的動(dòng)物48. B16 是

17、小鼠黑色素瘤，宿主一般多用 C57 小鼠，因?yàn)檫@個(gè)腫瘤的 細(xì)胞是黑色的， 用它做肺轉(zhuǎn)移， 在白色的肺葉上是黑色的轉(zhuǎn)移灶， 很容易分辨。49. 在注射腫瘤細(xì)胞前對(duì)小鼠使用 "環(huán)磷酰氨 "或"放射線照射 ", 有利于移植瘤的生長(zhǎng)50. 對(duì)于水不溶藥物： 低濃度的 DMSO確實(shí)是一個(gè)不錯(cuò)的解決手段， 當(dāng)然這么做進(jìn)行報(bào)批是不能夠被接受的，因?yàn)榕R床不允許這樣的 制劑血液給藥，但是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)湊合可以， 1%的濃度很低了，實(shí)際 上，給小鼠（包括裸鼠）尾靜脈注射 DMS，O 5%以下基本沒有任何 反應(yīng)，10%的時(shí)候需要較慢的速度注射， 但是動(dòng)物也能夠接受， 再 高就不行了

18、51. 瘤內(nèi)注射：總注射量只能為瘤體積的 10%，最多 20%，瘤內(nèi)注射有 一定的技巧，我們就是用的 4 號(hào)針頭，但是進(jìn)針點(diǎn)要遠(yuǎn)一點(diǎn)，讓 針頭在皮下多走一段， 然后再刺入瘤內(nèi)， 一個(gè)腫瘤可以多點(diǎn)注射， 但是一定要注意，刺入一點(diǎn)注射完畢以后，針頭退出瘤組織，但 是絕對(duì)不能退出皮下，然后換個(gè)地方再刺進(jìn)去，一個(gè)點(diǎn)只能注射 1015ul ，不要多打，比如要注射 20ul ，就分兩個(gè)點(diǎn)注射，每個(gè) 點(diǎn) 10ul 。52. 腫瘤模型一般常用的有小鼠模型和人腫瘤裸小鼠移植瘤模型。其 中用得最多的是皮下模型，另外還有腹水（或者尾靜脈注射）以 及原位模型，其他的模型很少用53. 小鼠模型分三大類：a）第一類：以

19、S180、 EAC、H22等為代表的，他們的宿主小鼠多 選用 KM，可產(chǎn)生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水傳代，實(shí) 驗(yàn)時(shí)抽取腹水， 經(jīng)過一定稀釋后皮下接種構(gòu)建模型， 接踵后第 二天開始給藥，給藥 7到 10天，接種 10天后結(jié)束試驗(yàn)，剝?nèi)∧[瘤稱瘤重i. 關(guān)于構(gòu)建瘤種： 可以用體外細(xì)胞株培養(yǎng)后， 用 PBS懸浮至13×106/mouse，接種即可，最好用 6 號(hào)左右的針頭，就 是常用的 2ml 一次性注射的針頭。ii. 關(guān)于腹水傳代：觀察到第一代的種鼠肚子較大后（一般約 89天左右），可以傳代，傳代時(shí)取 1ml注射器，用 2ml 注 射器的針頭，種鼠腹部消毒后直接將針頭插入抽取腹水即 可

20、，注意不要把針頭插得很深，盡量淺一點(diǎn)，還可以把老 鼠拎起來，利用重力，讓腹水集中在某處便于抽取，一般 抽個(gè)就可以了，不用離心，直接用 PBS36倍稀釋后，接種 到新的老鼠腹腔，腹水顏色為白色或者略有發(fā)黃都是正常 的，但是血性腹水說明不好，需要注意調(diào)整，第二代以后， 盡量 67 天的時(shí)候傳代，不要等的時(shí)間太久，否則腹水容 易血性。三代后可用于試驗(yàn)。iii. 關(guān)于接種進(jìn)行試驗(yàn)：這個(gè)時(shí)候抽取的腹水需要量比較多， 一般需要處死種鼠后，小心地用消毒眼科剪刀鑷子剝開腹 部皮膚，注意不要弄破肌肉，然后，用鑷子（最好是那種 前面有倒勾的鑷子， 學(xué)名好像是唇型鑷） 拎起腹部的肌肉， 用剪刀剪開一個(gè)小口，然后用玻

21、璃滴管或者去掉針頭的注 射器吸取腹水。然后經(jīng)過一定的稀釋后，接種到小鼠的腋 下。關(guān)于稀釋量，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的情況都不一樣，最好摸索 一下，開始的時(shí)候可以適當(dāng)?shù)挠?jì)數(shù)，但是要用臺(tái)盼蘭染色 后計(jì)活細(xì)胞數(shù)。接種部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋 窩里面，會(huì)給以后的操作帶來麻煩。接種時(shí)的進(jìn)針處離接 種處遠(yuǎn)一點(diǎn)，讓針頭在皮下多走一段，不容易污染。有的 人接種的時(shí)候喜歡針頭向上用力，緊貼著表皮往里走，然 后注射的時(shí)候感覺阻力較大，打出來的皮丘又緊又圓，這 樣的接種，會(huì)使腫瘤與皮膚嚴(yán)重粘連，不利于最后腫瘤的 剝?nèi)　Ｒ膊灰o靠肌肉，腫瘤會(huì)與肌肉嚴(yán)重粘連。應(yīng)該在 兩者之間，進(jìn)針的感覺輕松自如，針頭很自由，雖然打出 來的

22、腫瘤不會(huì)很圓很漂亮，但是相對(duì)好剝?nèi)∫恍?。iv. 關(guān)于觀測(cè)指標(biāo)：主要是按時(shí)稱體重，試驗(yàn)結(jié)束后剝?nèi)∧[瘤 稱瘤重。因?yàn)槌隽鲆呀?jīng)是接種后的第 6天左右了，第 10天 就結(jié)束時(shí)間， 瘤體積的數(shù)據(jù)意義就不大。 小鼠腫瘤很難剝， 這是沒有辦法的，只能耐心，沒有太好的辦法，剝多了以 后，手上會(huì)掌握一些巧力，有一些幫助，但是我們還是很 頭痛小鼠腫瘤試驗(yàn)結(jié)束。腫瘤組織周圍經(jīng)常會(huì)有一些血竇 的形成，弄破后會(huì)有血和黃色的液體流出，正常的，但是 剝瘤子的時(shí)候不要把它弄破，會(huì)嚴(yán)重影響瘤重。按照 SFDA 的規(guī)定，平均瘤重小于 1g，或者單個(gè)瘤重小于 200mg，認(rèn) 為腫瘤生長(zhǎng)不良，試驗(yàn)作廢。b) 第二類：以 lewis 肺癌