生化分析-蛋白質(zhì)熒光探針

1、生化分析蛋白質(zhì)熒光探針化基地 徐周毅 2010001111362013/6/7【香豆素類】中文名稱:香豆素中文別名:氧雜茶鄰酮;香豆內(nèi)脂;鄰氧萘酮;2H-1-苯并吡喃-2-酮;1,2-苯并吡喃酮英文名稱:Coumarin英文別名:2H-1-Benzopyran-2-one; COUMARINE; 1-Benzopyran-2-one; 1,2-Benzopyrone; Chromen-2-one; O-Oxy-Cinnamic Lactone ; 2H-chromen-2-one1. 4-羥基香豆素及其衍生物（1） 簡介：4-羥基香豆素及其衍生物是很多具有生理活性的天然產(chǎn)物的重要組成部分，還是

2、很多合成工業(yè)產(chǎn)品包過抗凝劑、除草劑、抗癌劑和HIV蛋白酶抑制劑等有用的中間體。(2) 光譜分析如下圖所示，以4c為例，其ex = 340 nm，em = 408 nm2. 香豆素類過氧化氫熒光探針（1） 簡介：過氧化氫是一個重要的活性氧（ROS）因子，存在活的生物體的器官中，其穩(wěn)態(tài)可以有不同的生理和病理的結(jié)果，過氧化氫和其他活性氧氧化劑之間的平衡與許多疾病有關(guān)病比如癌癥心血管的混亂和阿爾茨海默氏癥及相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。另一方面，有新的證據(jù)顯示過氧化氫可能在細胞信號轉(zhuǎn)換過程中作為第二信使。Nobuaki Soh等設(shè)計了香豆素類的H2O2探針，該探針受其他活性氧因子干擾少，專一性強，準確度高。D

3、u Lu-pei等利用Click修飾設(shè)計了香豆素類H2O2探針Scheme7該探針巧妙的利用了Click反應(yīng)修飾了香豆素基團,使其熒光強度更強,并且使其激發(fā)波長增加了70 nm,大大增加了Stoke位移。更加有利于觀察和檢測，準確度更高。該探針同樣具有很好的選擇性，且合成材料相對便宜，方法相對簡單，有很好的應(yīng)用價值。(2) 光譜分析香豆素類H2O2探針Scheme7的ex = 400 nm，em = 475 nm3. 香豆素類單胺氧化酶(MAO)的熒光探針（1） 簡介：單胺氧化酶Monoamine oxidase, MAO是機體內(nèi)參與胺類物質(zhì)代謝的主要酶類，位于線粒體外膜質(zhì)，分為MAO-A和M

4、AO-B兩種類型。單胺類物質(zhì)在機體內(nèi)具有重要的生理功能，單胺氧化酶的活性異?？梢饳C體多種功能障礙，形成疾病狀態(tài)。如帕金森氏病、老年癡呆癥及近年來都市中較為流行的抑郁癥等均與MAO活性異常有關(guān)。Chen等對香豆素類衍生物進行了改進，合成了具有檢測MAO生物活性的熒光探針，機理見Scheme1。他們合成了1、3、5探針，發(fā)現(xiàn)在MAO的作用下都生成了具有熒光性質(zhì)的化合物2、4、6，見Scheme 2。(2) 光譜分析如下圖所示三個香豆素的檢測限分別為ex=401nm，em=480nm；ex=355nm，em=490nm；ex=335nm，em=520nm；【芘類】芘，有機化合物，淡黃色單斜晶體（純

5、品為無色），具有芳香，可燃，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚?？蛇M行親電取代，如鹵化、硝化、磺化等反應(yīng)。芘主要存在于煤焦油瀝青的蒸餾物中。芘為有機合成原料，經(jīng)氧化可制取1,4,5,8-萘四甲酸，用于染料、合成樹脂、分散性染料和工程塑料；?；罂芍七€原染料艷橙GR及其他多種染料。還可制殺蟲劑、增塑劑等。1. 含芘熒光探針分子芘丁酰谷氨酸（PLE）和芘甲酰谷氨酸（PYE）（1） 簡介：不同間隔鏈長度的PLE和PYE探針分子在與Lym作用時，表現(xiàn)的光譜性質(zhì)差別不大，這主要是由于探針分子結(jié)合到了Lym的表面；而不同間隔鏈長度的探針分子在與BSA作用過程中，卻表現(xiàn)不同的光物理性質(zhì)，這可能是探針分子作用于BSA

6、空腔時其結(jié)合位點或者結(jié)合方式的不同引起的。目前的研究對揭示蛋白質(zhì)分子的識別位點和定位切割具有重要的意義。(2) 光譜分析PLE:PYE:2. L-4-（1-芘基）丁?；奖彼幔≒LP）（1） 簡介：PLP與蛋白質(zhì)的結(jié)合發(fā)生在蛋白質(zhì)的疏水部分其與血清白蛋白的結(jié)合方式是芘基端被包埋在血清白蛋白內(nèi)部的疏水空腔中，使結(jié)合后的PLP分子中的芘基由水相包圍轉(zhuǎn)移到血清白蛋白的疏水空腔中；而PLP與溶菌酶的結(jié)合方式是其分子中的芘基結(jié)合在溶菌酶分子表面的疏水部分，使結(jié)合后的PLP仍然被周圍的水相所包圍。（2） 光譜分析：隨著Lys濃度的逐漸增大，芘環(huán)在327和342 am處的吸收峰強度逐漸減弱所對應(yīng)的熒光發(fā)射

7、光譜圖2(B)表明，隨著蛋白質(zhì)濃度的增大，芘基在376和396 nm處的發(fā)射峰強度也逐漸減弱這種減色效應(yīng)是由芘基與蛋白質(zhì)分子中芳香基團之間的相互作用引起的川，且隨著蛋白質(zhì)濃度的增加這種效應(yīng)越來越明顯。3. pyrene appended boronic acid 16 together with a polycation 2（1） 簡介：Caruso etal.8 reported that pyrenetetrasulfonate is electrostatically bound by a polycation, and then hydrophobic association betw

8、een the bound pyrene units results in an excimer emission in the fluorescence spectra. Nishizawa et al.9 demonstrated a related system in which two molecules of pyrene-functionalized guanidinium receptor are assembled onto one molecule of pyrophosphate through electrostatic and hydrogen bonding inte

9、ractions, and then give an excimer emission. These studies inspired us to design a novel ATP sensing system as illustrated in Scheme 2. Pyrene-appended boronic acid 1 is assembled onto polycation 2 mediated by ATP through the electrostatic interaction between ATP and 2 in addition to the ester forma

10、tion between the boronate group in 1 and the diol unit in ATP.The aggregate formation brings about a change in the fluorescenceemission from monomer to excimer, and thus enables us tofluorometrically detect ATP.結(jié)構(gòu)示意圖：作用機理：（2） 光譜分析：如下圖所示：【萘類】一種有機化合物,分子式C10H8,白色，易揮發(fā)并有特殊氣味的晶體.從煉焦的副產(chǎn)品煤焦油中大量生產(chǎn)，而用于合成染料、樹脂

11、等。通常的衛(wèi)生球就是用萘制成的。1.2-對甲苯胺基-6-萘磺酸鈉（TNS）（1） 簡介：TNS是一種對環(huán)境極為敏感的熒光探針分子，它在極性溶劑中產(chǎn)生非常弱的熒光，在非極性溶劑中將產(chǎn)生較強的熒光。溶劑極性大小取決于檢點常熟的大小。（2） 光譜分析：如下圖所示：2.8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（ANS）（1） 簡介：ANS在人血紅蛋白中心空腔-DPG-結(jié)合位點與蛋白質(zhì)非共價結(jié)合。（2） 光譜分析：如下圖所示：3.酮一2一(對二甲氨基苯亞甲基)一四氫萘(KDTN)（1） 簡介： 結(jié)構(gòu)式如下： 結(jié)合作用：疏水作用力是結(jié)合反應(yīng)的主要作用力，與扭血清蛋白（BSA），二者結(jié)合常數(shù)為3.2742*104L

12、83;mol-1，結(jié)合位點數(shù)n=0.9389【熒光素類】1.5-異硫氰酸酯熒光素（1） 簡介：5-異硫氰酸酯熒光素是最重要、最典型的熒光探針之一，由于其熒光強度高，能與多種基團生成穩(wěn)定的共價鍵，因而在生物檢測，例如蛋白質(zhì)或者多肽標記，細胞檢測，藥物分析等方面得到光放的應(yīng)用。FITC是性能優(yōu)良的熒光探針，由于多數(shù)生物樣品的背景熒光的波長為430nm-470nm，F(xiàn)ITC最大激發(fā)波長（max.ex）為494nm容易發(fā)生濃度猝滅。（2） 光譜分析：最大激發(fā)波長和最大吸收波長見下表2.氨基熒光素（1） 簡介：氨基熒光素是熒光素類染料中重要的熒光探針之一，由于氨基直接與芳環(huán)相連使氨基的親核能力后所降低，

13、很難與其他物質(zhì)進行衍生反應(yīng)，而且氨基熒光素的熒光量子化率也很低，因此將其直接應(yīng)用與生物體的檢測收到了限制。氨基熒光素的衍生后，得到異硫氰酸化，馬來酰亞胺，?；苌锏?，可以改善其與其他化合物的特異結(jié)合能力，或改變其在細胞中的分布，大大提高氨基熒光素類衍生物在生物分析中的應(yīng)用。例如：5-2-(4,6-二氯-三嗪基)氨基熒光素（22）（2） 光譜分析：3.羧基熒光素二醋酸琥珀酰亞胺酯（CFDA/SE）（1） 簡介結(jié)構(gòu)式如下：結(jié)合作用：由于琥珀酰亞胺酯（SE）的存在，這種物質(zhì)能與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)中的氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的燃料蛋白加合物【羅丹明類】1.5-羧基-磺酸基羅丹明（1） 簡介：由于羅丹明特殊的結(jié)構(gòu)以

14、及相應(yīng)的熒光特性，使羅丹明類熒光光染料成為分析化學和生物醫(yī)藥科學等生物技術(shù)領(lǐng)域黃總最常用的熒光染料之一。為了改善羅丹明的熒光性能，國外許多化學家和生物學家通過引入不同功能的化學基團對羅丹明的結(jié)構(gòu)進行修飾，設(shè)計合成了一系列新型的羅丹明熒光染料。其典型的制備方法是：取代3-氨基苯酚與鄰苯二酸酐的含生物縮合。然后用這種方法得到的主要是5（6）-羧基羅丹明的混合物，且二者的相對含量接近1:1，不易分離，使產(chǎn)品難以純化。（2） 光譜分析：用PES緩沖溶液為溶劑，配置1.0*10-6 mol/L化合物1,2,3的溶液，測定紫外可見光譜和熒光光譜。將測試樣品加入1cm石英比色池中，在LS-55型熒光分光光度

15、計上計入280-700nm波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜，狹縫寬為10nm。2.丁基羅丹明B（1） 簡介：丁基羅丹明B (BRB) 是堿性占噸類染料, 其水溶液有較大的摩爾吸光系數(shù), 分子結(jié)構(gòu)具有剛性, 單體水溶液能產(chǎn)生很強的熒光, 但它與十二烷基苯磺酸(SDBS) 的現(xiàn)場二聚體作為測定蛋白質(zhì)生物探針未見報道。本文考察了在SDBS 存在下的BRB 的吸收光譜, 并對與染料分子形成的現(xiàn)場二聚體作為人血清蛋白(HSA ) 測定的熒光探針進行了研究, 取得了滿意的結(jié)果。（2） 光譜分析：BRB 在沒有SDBS 引入時本身在556 nm 處有最大吸收峰, 隨著表面活性劑的加入, 最大吸收峰藍移至552nm

16、, 并且吸收峰強度與SDBS 濃度的相關(guān), 吸收峰先降低后又上升。文獻也報道其他染料在表面活性劑溶液中存在單體與二聚體的平衡 6 。表面活性劑與水分子形成了所謂的“冰山結(jié)構(gòu)( iceberg st ructu re) ”, 導致溶劑的性質(zhì)向著有利于BRB 二聚體形成的方向變化, 出現(xiàn)二聚體的特征峰。3.羅丹明B（RhB）等羅丹明類試劑（1） 簡介：堿性羅丹明類染料,用于各類物質(zhì)中金屬離子的測定主要是利用絡(luò)合物或締合體系,具有較大的摩爾吸光系數(shù)和很好的氧化還原特性以及熒光效應(yīng)。因為羅丹明類染料苯環(huán)中有“氧橋”相聯(lián),具有剛性平面結(jié)構(gòu),容易吸收入射光的能量而發(fā)射長波,從而產(chǎn)生熒光。另外,它本身具有醌

17、式結(jié)構(gòu),能產(chǎn)生顏色,被氧化時,其醌式結(jié)構(gòu)被破壞,染料溶液顏色變淺甚至變?yōu)闊o色,為光度分析奠定了理論基礎(chǔ)。（2）光譜分析：【花菁類】花菁染料一般由兩個 N 原子中心構(gòu)成，其中一個 N 原子帶正電荷，并與一個含奇數(shù)碳原子的共軛鏈相連，共軛鏈上的碳原子再與另一個 N 中心相連。人們根據(jù)花菁結(jié)構(gòu)的顯著特征常稱花菁為“推-拉” 烯烴，所有含有亞甲基鏈生色團的聚亞甲基染料都具有這種結(jié)構(gòu)特征。根據(jù)亞甲基鏈單元所帶的電荷不同，花菁染料可分為以下 4 種：（1）陽離子亞甲基鏈-花菁和半花菁；（2）陰離子亞甲基鏈-氧雜菁；（3）中性亞甲基鏈-部花菁；（4）兩性的方酸菁，其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)如下：1. 2-4-chloro

18、-7-(1-ethyl-3,3-di-methyl-indolin-2-ylidene)-3,5-(propane-1,3-diyl)-1,3,5-heptatrien-1-yl-1-ethyl-3,3-dimethyl-3H-indolium iodide（1） 簡介：結(jié)構(gòu)組成：（2） 光譜分析：實驗表明，在甲醇溶液中，疏水花菁 I 在 778 nm 有一強的單體吸收峰，在 710 nm 處有一弱的二聚體吸收峰（圖 2，曲線 1）。在水溶液中，花菁 I的單體吸收峰明顯藍移至 770 nm（圖 2，曲線 2），歸因于花菁 I 的疏水性。當加入表面活性劑 SDBS，花菁 I 的吸收峰位置不變，而

19、吸收強度減弱（圖2，曲線 2-8）。而且，吸光度的差值與 2.9×10-7mol/L 1.0×10-5mol/L 范圍內(nèi)的 SDBS 濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。當 SDBS 的濃度高于 1.0×10-5mol/L且低于 2.0×10-4mol/L（剛好低于 SDBS 的臨界膠束濃度 CMC）時，花菁 I的單體吸收峰完全消失，而在 700 nm 和 800 nm 處出現(xiàn)新峰（圖 2，曲線9，10）。前者被認為是花菁 I 發(fā)生聚集形成二聚體，后者由于染料發(fā)生膠束化前預(yù)聚集形成 J-聚集體，即使在很低的表面活性劑濃度下，這種膠束化前預(yù)聚集也能形成。同時還發(fā)現(xiàn)，當

20、 SDBS 的濃度增大到臨界膠束濃度 CMC 時，花菁 I 的單體峰和二聚體的肩峰迅速恢復，并分別紅移至 788nm 和 724 nm，同時花菁 I 的 J-聚集體消失了（圖 2，曲線 11）。實驗表明，此方法不適合直接測定高濃度的表面活性劑，而實際水樣中的表面活性劑的濃度遠遠地低于 CMC，所以本方法可以用來測定河水中的表面活性劑。2. 水溶性碳菁染1 ,1-丙磺酸-3 ,3 ,3,3-四甲基吲哚三次甲基碳菁-5 ,5-二磺酸鉀（1） 簡介：雙嵌花菁探針具有剛性平面結(jié)構(gòu), 熒光性能良好, 同時又可以作為生物大分子的嵌入體; 連接橋鍵后, 雙嵌花菁具有多個探針結(jié)合點、良好的柔韌性, 具有極高的

21、親和常數(shù)。自1992 年Rye 等突破性地合成了性能獨特的噻吩橙同型花菁雙嵌入劑以來, 熒光花菁探針發(fā)展迅速,TOTAB , FED , EthD 等熒光探針相繼被開發(fā)并在生物分析中應(yīng)用, 花菁雙嵌探針已成為生物分析的一項重大突破。該文章研究的碳菁染料1 ,1-丙磺酸-3 ,3 ,3,3-四甲基吲哚三次甲基碳菁-5 ,5-二磺酸鉀為一種新的水溶性同型雙嵌探針。（2） 光譜分析：染料熒光光譜的最大激發(fā)波長為548 nm , 最大發(fā)射波長為在562 nm , Stokes 位移為14 nm。隨著染料濃度的增加, 染料熒光最大波長發(fā)生了明顯的紅移, 如圖1 所示, 在較低濃度下, 熒光強度隨染料濃度

22、增強而不斷增強, 當染料濃度為4100mol ·L - 1時, 花菁染料熒光強度最大; 但當濃度大于4100mol ·L - 1 , 染料締合程度增加, 熒光發(fā)射波長紅移, 熒光強度顯著降低。3. 花菁素 （1） 簡介：花菁 可以作為非離子表面活性劑CMC測定的指示劑。它具有分子“光開關(guān)”的功能,發(fā)射強度增幅可達103。為了進行比較,我們對花著I也進行了研究,并觀察到了類似發(fā)光現(xiàn)象。借助于這兩個“光開關(guān)”分子,我們建立了一種熒光方法,用于監(jiān)測膠束形成過程和估測某些表面活性劑的CMC值。與分光光度法和其它相關(guān)技術(shù)相比,該法測定CMC更方便、直觀、可靠。（2

23、） 光譜分析：如圖3.1.1所示, 花菁 在乙醇溶液中激發(fā)和發(fā)射波長分別為789nm和819nm?；ㄝ?#160;的激發(fā)和發(fā)射光譜與花菁 相似,激發(fā)和發(fā)射波長分別在784nm和820nm。隨著水的加入,兩種探針的熒光強度都下降。當水含量高于60%時,熒光幾乎完全碎滅,表明兩種探針對環(huán)境變化都很敏感。吸收光譜隨水含量增加變化也比較明顯。隨著水含量的增加,兩種探針在約800nln處的單體峰吸收下降并最終消失,同時,短波處(大約578nnl和695nm)出現(xiàn)兩個新的弱吸收峰(光譜未給出)?！痉剿彷肌糠剿彷碱惢衔飳儆诰奂兹差愌苌?是由方酸和供電子化合物通過縮合反應(yīng)生成的一類兩性

24、離子化合物,具有吸收峰窄、強度高、可見-近紅外區(qū)域吸收、熒光峰顯著等特點,同時具有光導電性,在蛋白質(zhì)檢測等生物醫(yī)學領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ目梢娊t外突光探針。Yarmoluk等人合成了一系列對稱或不對稱方酸菁類探針,研究了BSA、HSA、卵清蛋白、抗生物素蛋白、胰蛋白以及溶解酵素等多種蛋白質(zhì)對于探針光譜的影響,結(jié)果表明探針與BSA以非共價結(jié)合后,與其他白蛋白相比,呈現(xiàn)顯著的突光增強效應(yīng),說明探針對于BSA具有識別作用。Volkova等人以方酸菁為母體,在環(huán)丁燒處引入輕基乙胺基、氨基乙胺基、3-碘代-節(jié)基胺基,合成了一系列突光探針(86a-c)并研究了BSA、HSA、馬血清白蛋白以及卵

25、清白蛋白對探針光譜的影響。結(jié)果表明,白蛋白的加入使得探針光強增加了400倍,熒光量子產(chǎn)率達0.18,突光光譜最大特征峰移動了近60 nm,以此建立了新型的蛋白質(zhì)光譜檢測方法,拓寬了方酸菁類突光探針的應(yīng)用范圍。Peng等人合成了含有1-氨基甲酰甲基-3H-花菁取代基團方酸菁類化合物(87a-c),與BSA非共價鍵結(jié)合后,探針熒光顯著增強,其程度與BSA在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,以及建立了檢測蛋白質(zhì)分析方法。Peng等人研究發(fā)現(xiàn)方酸菁類化合物(88a-c)具有/-或J-團聚效應(yīng),在水溶液中不呈現(xiàn)突光特性,但隨著BSA的加入,團聚的聚合物向單體類型轉(zhuǎn)變伴隨著焚光增強現(xiàn)象,電泳和光譜結(jié)果表明,這類化

26、合物具有良好的BSA識別作用Ramaiah等人報道了釆用光物理、手性、生物物理以及微觀手段研究了方酸菁類化合物空間位阻效應(yīng)對于探針(89a-c)與HSA、BSA結(jié)合作用的影響。結(jié)果表明,取代基團大小對結(jié)合位點具有一定影響,同其他方酸菁類探針一樣,血清蛋白對于化合物具有熒光“打開”效應(yīng)同時也提高了三線激發(fā)態(tài)的突光壽命和量子產(chǎn)率。這類以非共價鍵作用標記蛋白的近紅外焚光探針,有望成為新型光動力治療藥物。1.吲哚方酸菁染料（1） 簡介：4種水溶性吲哚方酸菁染料在十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和曲拉通(TX一100)等表面活性齊3膠束模擬的生理條件下的吸收發(fā)射光譜，結(jié)果表明：

27、這些吲哚類方酸菁染料可以與膠束發(fā)生有效的相互作用，染料與表面活性劑相互作用的大小依次為CTAB>TX100>SDS；在表面活性劑溶液中，隨著膠束的形成，染料的最大吸收和發(fā)射光譜都發(fā)生紅移，其中最大吸收波長紅移了1116nm；CTAB濃度小于臨界膠束濃度時，隨著CTAB濃度的增加，染料a、d主要生成H聚集體，而染料e、f不僅生成H聚集體，還生成J聚集體；而"-3CTAB濃度大于臨界膠束濃度時，聚集體解離；染料熒光強度和熒光量子產(chǎn)率在合適的表面活性劑溶液中大幅度增加。（2） 光譜分析：下面舉a為例：2.甲基菁染料（1） 簡介：近年來合成的甲基菁染料：（2） 光譜分析：如下圖所

28、示：3.各類不同取代基方酸菁（1） 簡介： （2） 光譜分析：【酞菁類】1. 四硝基鋁酞菁（1） 簡介：該文章介紹了建立以四硝基鋁酞菁為熒光探針測定葡萄糖的熒光分析新方法。方法基于四硝基鋁酞菁苯環(huán)上的硝基與葡萄糖發(fā)生還原反應(yīng),形成鋁酞菁的氨基化產(chǎn)物;氨基化鋁酞菁具有紅區(qū)激發(fā)和發(fā)射的特性,在強酸性介質(zhì)中可發(fā)射較強熒光;體系的熒光強度和葡萄糖的含量呈良好的線性關(guān)系,并具有較好的準確性和穩(wěn)定性。方法用于測定發(fā)酵樣品中的還原糖,結(jié)果滿意。（2）光譜分析：同其它酞菁化合物類似,四硝基鋁酞菁也具有兩個吸收帶,一個在短波處,一個在長波640 nm 處(圖2 曲線a) 。四氨基鋁酞菁也有兩個吸收帶,一個在短波

29、,一個在長波725 nm 處(圖2 曲線c) 。反應(yīng)產(chǎn)物吸收光譜在長波處顯示如圖2 曲線b所示的吸收特性。反應(yīng)前后,反應(yīng)體系的吸收光譜發(fā)生了明顯的改變,640 nm 處的吸收逐漸下降,725 nm 處的吸收則逐漸增強。圖3 是反應(yīng)產(chǎn)物的激發(fā)和發(fā)射光譜。四硝基鋁酞菁在酸性條件下不發(fā)熒光,而反應(yīng)產(chǎn)物在酸性條件下具有熒光,熒光峰在680 nm 處(圖3 曲線b) 。與文獻8 中關(guān)于四氨基鋁酞菁的熒光特性相符。因此,我們認為四硝基鋁酞菁經(jīng)葡萄糖還原后,形成了鋁酞菁的氨基化產(chǎn)物。反應(yīng)產(chǎn)物在610 nm 處有一激發(fā)峰。以此峰激發(fā),可有效避開散射光的干擾,獲得較好的信噪比,故實驗選擇610 nm 進行激發(fā)。

30、2. 半乳糖酞菁（1） 簡介：該文獻報道了半乳糖酞菁近紅外熒光探針在腫瘤成像方面的應(yīng)用。酞菁在近紅外區(qū)域具有較高的量子產(chǎn)量和光學穩(wěn)定性，以其為熒光發(fā)射基團可以解決探針的近紅外光學特性；通過半乳糖對酞菁的修飾可改善探針的溶解性、生物相容性及腫瘤主動靶向成像效果。該分子探針對惡性腫瘤可高特異性結(jié)合且具有高靈敏度。（2） 光譜分析：半乳糖酞菁近紅外熒光探針的光譜行為合成的半乳糖修飾酞菁具有較好的水溶性，其水溶液為綠色均相溶液 紫外光譜顯示，半乳糖修飾酞菁在618 和670 nm 處具有明顯的酞菁特征吸收峰 以618 nm 為激發(fā)波長，半乳糖修飾酞菁在690 nm 有明顯的熒光發(fā)射，因此該化合物可以滿

31、足近紅外探針的光學要求。3. 八羧酸酞菁鈷配合物（1） 簡介：八羧基金屬酞菁的周邊四個苯環(huán)各帶有兩個羧基，具有較好的水溶性，且吸收峰在670700nm，是一類性能優(yōu)良的光敏劑，而且CoPc(COOH)8帶有負電荷，對蛋白有很強的親和作用。采用光譜法研究了CoPc(COOH)8與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合作用；采用熒光光譜分析方法測定了CoPc(COOH)8與BSA 的結(jié)合常數(shù)為K=6.94×105；以氯血紅素（HE）、布洛芬（IB）、L-色氨酸（TRP）為BSA 的分子配體，絡(luò)合競爭法研究了它們對CoPc(COOH)8-BSA 體系紫外光譜的影響， 并且確定了CoPc(COOH)8

32、與BSA 的結(jié)合點為SiteIII。（2） 光譜分析：BSA 上色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在，使其具有內(nèi)源熒光CoPc(COOH)8（0-1.0×10-5mol/L）滴定BSA(1×10-5mol/L)，隨著CoPc(COOH)8濃度的增大，BSA 熒光強度有規(guī)律地降低，但發(fā)射峰位及峰形不變，如圖2 所示。可以認為白蛋白帶有較多游離氨基，在酸性介質(zhì)中由于質(zhì)子化而呈正電荷狀態(tài)，與溶液中帶有負電荷的CoPc(COOH)8相互作用，導致熒光物質(zhì)BSA 熒光強度降低。引起B(yǎng)SA 熒光猝滅的原因可能有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，猝滅原因可以通過計算結(jié)合常數(shù)來判斷?！距玎簢f嗪類】目前常用的噻嘆和惡嚷類突光探針主要有亞甲基藍(Methyiene blue, MB)、尼羅紅(Nile red, NR)和尼羅藍(Nile bhie, NB)等。MB是一種具有剛性平面結(jié)構(gòu)的陽離子近紅外熒光探針,常作為醫(yī)學光動力治療中的光敏劑、臨床診斷及化學分析中生物大分子探針加以應(yīng)用。Yang等人報道了利用MB的二聚作用和近紅外光物理特性作為突光探針測定BSA和EA,檢測限達到了納克級,該研究拓寬了MB的在生物檢測和分析化學領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍。Tung等人合成了水溶性NB的類似物89,在NB的9位上的