原代神經(jīng)元培養(yǎng)培訓課件

1、精品文檔神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)從動物 (大鼠或小鼠等) 的胚胎或新生動物的腦組織取下某一局部區(qū)域，分離細胞，培養(yǎng)在 培養(yǎng)容器后不再移植，常稱為原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)。一、培養(yǎng)前準備1. 器械和器皿器械：外科剪、鑷子、虹膜剪等、小剪刀、細鑷子和虹膜小刀等 各種金屬器械如解剖器械， 使用后及時刷洗干凈， 用酒精棉球擦拭后晾干， 或經(jīng) 60 烘干， 以防生銹。由于濕熱消毒對手術器械容易可用 70 80 酒精浸泡 1 小時以上消毒。器皿：1)2)3) 玻璃瓶及相應的膠塞或膠木螺旋蓋，用于分裝血清、多聚賴氨酸、解剖液、各種鹽溶液和培養(yǎng)液等。5) 培養(yǎng)瓶、蓋玻片培養(yǎng)用的蓋玻片必須不含鉛、 不發(fā)霉， 可用 0.2N 鹽

2、酸浸泡 10 分鐘， 用蒸餾水洗 2 次， 每次 10 分鐘，然后移入丙酮或乙醇浸泡 10 分鐘，再用雙蒸水洗 2 次，每次 10 分鐘， 烘干待消毒。凡組織學用過的舊蓋玻片一般不用。6)7) 移液管、吸管、燒杯、離心管和培養(yǎng)皿。8)9) 塑料培養(yǎng)皿( 35mm )、塑料培養(yǎng)板( 6、24 、96 孔)。輔助工具：放置試管、吸管和玻璃瓶等的架子。2. 培養(yǎng)基和培養(yǎng)用液的配制1）培養(yǎng)基質：有多聚賴氨酸、牛皮膠原和鼠尾膠原。本室目前常用分子量為 7-140000 多 聚賴氨酸（ Poly-L-lysine ，濃度為 0.1mg/ml 。2）平衡鹽溶液： 主要以無機鹽和葡萄糖配制而成。 各種平衡鹽溶

3、液主要的不同點在于 NaCl 的濃度、離子濃度及緩沖系統(tǒng)的不同，可根據(jù)實際需要選用適當?shù)钠胶恹}溶液。3）培養(yǎng)液：目前已有現(xiàn)成的干粉出售，按說明書進行配制即可。神經(jīng)細胞培養(yǎng)需高糖，培 養(yǎng)液應含有或加葡萄糖至 6g/L 。目前培養(yǎng)海馬神經(jīng)元可選用 B27 無血清培養(yǎng)液。4）血清：有胎牛血清、小牛血清和馬血清等。分裝成小瓶，4保存?zhèn)溆茫ǚ盅b前需 56 滅活 30 分鐘）。5）胰蛋白酶溶液：用于分離細胞。先用少量滅菌三蒸水將胰蛋白酶粉末溶成糊狀，然后補水至 2.5% 濃度，振蕩搖勻， 4過夜，待完全溶解后用濾器過濾滅菌，并分裝成1-2ml 凍存。用前以 D-Hanks 平衡鹽水或其他無鈣鎂離子溶液溶解

4、稀釋至 0.25% 或 0.125% 。實際 使用溫度一般為 37 20-30 分鐘。6）解剖溶液：由平衡鹽水 （ D1- 無鈣鎂離子的 Puck 氏液）、HEPES 緩沖液和蔗糖葡萄糖 溶液組成稱為 D1-SGH 。D1 平衡鹽水： NaCl 8.0g 、KCl 0.4g 、 Na2HPO4.7H2O 0.045g 、KH2PO4 0.03g 、酚紅0.0012g 、三蒸水 50ml 。蔗糖葡萄糖（ SG ）：蔗糖 7.5g 、葡萄糖 3g 、三蒸水 50ml 。HEPES（ H ， 0.352mM ）：用 25ml 左右的三蒸水溶解 2.35g 的 HEPES 后，用 NaOH 或HCl

5、調(diào) pH 至 7.3-7.4 ，加三蒸水至 28ml 。將 D1 、SG 和 H 三者合在一起并稀釋到 1000ml 即為解剖液， 小瓶分裝成 5ml 后置 4 備 用。二、培養(yǎng)細胞操作1. 涂培養(yǎng)基一般在細胞培養(yǎng)前 1-2 天，將使用的塑料培養(yǎng)皿（ 35mm ）、24 孔、 96 孔培養(yǎng)板或消毒的 蓋玻片涂上一層 Poly-L-Llisine ，置于超凈臺中備用。2. 實驗動物準備動物的年齡和取材部位對培養(yǎng)細胞的成活率關系密切， 需根據(jù)具體實驗而定。 如大鼠海馬細 胞培養(yǎng)，以 18 天胚胎或新生 48 小時內(nèi)的大鼠為宜，而培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)與脊髓神經(jīng)元以11-13 天胚胎小鼠、大腦皮層以小鼠 1

6、6-21 天、小腦細胞取自臨產(chǎn)或新生動物。3. 進入培養(yǎng)室操作1）穿上消毒衣，戴上口罩和帽子。2）安放消毒的實驗用具，如培養(yǎng)皿、解剖器械、玻璃吸管、培養(yǎng)板等于桌面適當?shù)奈恢谩?）將平衡鹽水、解剖溶液、血清、胰蛋白酶等溶液放置于桌面上，同時準備一個冰袋和污 物盤。4）解剖動物以新生大鼠取海馬組織為例： 將新生大鼠投入 80 的酒精中， 消毒 5-10 分鐘。 用解剖剪斷頭，并移入玻璃器皿中，沿中間骨縫將頭骨剪開（頭骨外側下沿也剪開） ，然后 剝開頭骨暴露大腦半球， 去腦膜， 沿中線將大腦半球往外翻開， 暴露內(nèi)側面半月狀的海馬組 織。用彎頭鑷子輕輕夾起，放入解剖液內(nèi)（培養(yǎng)皿可置于冰袋上） 。待數(shù)個

7、動物均解剖后， 將培養(yǎng)皿內(nèi)的海馬組織移至解剖鏡下， 仔細去除血管、 膜及非海馬結構 （取材干凈非常重要） 后，再移至小培養(yǎng)皿中，加數(shù)滴 D1-SGH 液，并用虹膜剪剪碎或用虹膜刀切成小粒。5) 在上述海馬組織加入解剖溶液和 0.25% 胰蛋白酶各 1ml ，搖勻后置于 37 培養(yǎng)箱內(nèi)消 化 25-30 分鐘。6) 將消化好的細胞碎片移入 2ml 的離心管中， 吸去剩余的胰蛋白酶溶液， 加入含血清的全 培養(yǎng)液 2ml 終止胰酶作用，約 10 分鐘后，再更換一次全培養(yǎng)液以洗凈胰酶。 (全培養(yǎng)液成 份為 80 DMEM 、 10 胎牛血清、 10 馬血清或小牛血清，胎牛血清有助于細胞貼壁)。7) 用

8、口徑較小的、在火焰上光滑過的玻璃吸管吸取細胞團，移入另一離心管，加入 2ml 培 養(yǎng)液并吹打 20 次。將離心管斜放， 讓細胞碎片下沉 5-10 分鐘后，吸取上層細胞溶液約 1ml 。 離心管中再加入培養(yǎng)液 1ml ，同上吹打并吸取細胞， 與第 1 次吸取的細胞混合一起后計數(shù)。8) 按所需的細胞濃度接種在事先準備的塑料培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)板中，用蓋玻片則需滴滿。 接種后移入 37 的 5 CO2 培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 1 天后可用無血清培養(yǎng)液， 1 星期換液 2 次。三、細胞識別 根據(jù)細胞外形及內(nèi)部結構進行細胞的識別。 神經(jīng)細胞具有顯著的特征， 培養(yǎng)中的貼壁的神經(jīng) 元突起很明顯， 特別是樹突由粗而細，有分

9、支，突起的末端有膨大的生長錐結構， 正在不斷 變化；細胞體呈圓形、梭形、三角形或多角形不等，胞體較厚，具有空泡狀核，有明顯的核 仁；立體感強，常見“暈” 。培養(yǎng)細胞中可包括幾種神經(jīng)元的類型和非神經(jīng)元的“背景細胞” ，即成纖維細胞、室管膜細 胞和幾種膠質細胞。成纖維細胞貼壁最快，呈扁平狀，胞核卵園形，有并列的兩粒小核仁， 從胞體兩端發(fā)出細長 突起。 膠質細胞貼附在膠原上和成纖維細胞形成一層“地毯”。神經(jīng)細胞貼壁較慢， 落在“地毯”上生長遷移和分化。培養(yǎng)的神經(jīng)細胞可按一般 Nissl 法染色或免疫細胞化學特異性染色加以鑒別。無菌操作注意事項體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力， 所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或

10、失敗的首要條件。 即便使用 設備完善的實驗室。若實驗者粗心大意，技術操作不規(guī)范?也會導致污染。因而為在一切操作中為最大可能的保證無菌每一項工作都必須做到有條不紊和完全靠?！九囵B(yǎng)前準備】在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關數(shù)據(jù)的計算要事先做好。 根據(jù)實驗要求，準備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所（培養(yǎng)室、超凈臺 ）內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后囚物品不全往返拿取而增加污染機會。【操作野消毒】無菌培養(yǎng)室每天都要用 0.2% 的新潔爾滅拖洗地面次 （拖布要專用 ）紫外 線照射消毒 30-50min ，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75 酒精擦洗。然后紫外線淌毒30min

11、。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線， 消毒時工作臺面上 用品不要過多或重疊放置否則會遮擋射線降低消毒效果。些操作用具如移液器、廢液 缸、污物盒、試管架等用 75% 酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒?！鞠词趾椭b】 原則上和外科手術相同。 平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時， 可穿裝細胞培養(yǎng)室 內(nèi)紫外線照射 30min 的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應著 長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75 酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。 進入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、 著 消毒衣帽?！净鹧嫦尽?在無菌環(huán)境進行

12、培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈或煤氣燈。以 后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等， 都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。但要注 意：金屬器械不能在為焰中燒的時間過長， 以防退火， 燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組 織，以免造成組織損傷。 吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼， 因殘留在吸管頭中營養(yǎng) 液能燒焦形成炭膜， 再用時會把有害物帶入營養(yǎng)液中。開啟、 關閉長有細胞的培養(yǎng)瓶時，火 焰滅菌時間要短。 防止因溫度過高燒死細胞。 另外膠塞過火焰時也不能時間長， 以免燒焦產(chǎn) 生有毒氣體，危害培養(yǎng)細胞?！静僮鳌?進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。 不能用手

13、觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。為拿取方便， 工作 臺面上的用品要有合理的布局，原則上應是右手使用的東西放置在右側，左手用品在左側， 酒精燈置于中央。 工作由始至終要保持一定順序性， 組織或細胞在未做處理之前， 勿過早暴 露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復使用，應立即封 閉瓶口直立可增加落菌機會。吸取營養(yǎng)液、PBS、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管，不能混用， 以防擴大污染或導致細胞交叉污染。 工作中不能面向操作野講話或咳嗽， 以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。 操作前用酒精擦拭超凈臺面及雙手。 手或 相對較臟的物品不

14、能經(jīng)過開放的瓶口上方， 瓶口最易污染， 加液時如吸管尖碰到瓶口， 則應 將吸管丟掉。細胞計數(shù)細胞計數(shù)法是細胞學實驗的一項基本技術。 它是了解培養(yǎng)細胞的生長狀態(tài) 測定培養(yǎng)基、 血 清、藥物等物質生物學作用的重要手段。下面介紹常用的血球計數(shù)板計數(shù)法。一、用品(1) 血球計數(shù)板，巴氏吸管(2) 0.25 胰蛋白酶溶液，無血清培養(yǎng)液(3) 顯微鏡二、步驟(1) 準備計數(shù)板：用酒精清潔計數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。(2) 制備細胞懸液； 用消化液分散單層培養(yǎng)細胞或直接收集懸浮培養(yǎng)細胞， 制成單個細胞懸 液。本法要求細胞密度不低于 10000 個細胞 m1 ，若細胞數(shù)很少， 應將懸液離心 (1000rpm ， 2min) ，重懸浮于少量培養(yǎng)液中。(3) 加樣：用吸管輕吹打細胞懸液，取少許細胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片的一側加微量細胞 懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。(4) 計數(shù)：在顯微鏡下，用 10X 物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)細胞壓中線時， 只計左測和上方者，不計右側和下方者。(5) 計算：將計算結果代入下式，得出計數(shù)結果： 細胞數(shù)毫升原液 (4 大格細胞數(shù)之和 4)X104 細胞計數(shù)結果