大腸桿菌生長曲線

1、1 / 4四川大學(xué)課程名稱化學(xué)生物工藝學(xué)實驗實驗課程報號告309119060學(xué) 院輕紡與食品學(xué)院業(yè)專輕工生物技術(shù)學(xué)生姓名趙鳳佼學(xué)號0843095035指導(dǎo)教師周榮清成績評定實驗日期2011-06-202011-06-22、實驗名稱：大腸桿菌生長曲線的制作、實驗?zāi)康模?.通過細菌數(shù)量的測量了解大腸桿菌的生長特征與規(guī)律，繪制生長曲線2.掌握光電比濁法測量細菌數(shù)量的方法。、實驗儀器及藥品：1.菌種：大腸桿菌。2.培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基100ml，分裝兩支大試管（5ml/支），剩余90ml裝入250ml三角瓶3.儀器和其他藥品：722型分光光度計，水浴振蕩搖床，無菌試管和無菌吸管等。四、基本原理：在合適的

2、條件下，一定時期的大腸桿菌細胞每20min分裂一次，將一定量的細菌轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)液 中，在適宜的培養(yǎng)條件下細胞要經(jīng)歷延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定器和衰亡期4個階段。以培養(yǎng)時間為橫坐 標(biāo)，細菌數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)所繪制的曲線成為該細菌的生長曲線。 不同的細菌在在相同 的培養(yǎng)條件下其生長曲線不同，同種細菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長曲線也不同。當(dāng)光線微生物菌懸液時，由丁菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定范圍內(nèi)，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比；而光密度或透光度可以通過光電池精確測出。因此， 可利用一系列菌懸液測定的光密度及其含菌量， 做出光密度一菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣品

3、液所測 得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查處對應(yīng)的菌數(shù)。本實驗用分光光度計進行光電比濁，測定不同時間細菌懸浮液的OD值，繪制生長曲線。五、關(guān)鍵步驟及注意事項：1.測定OD值時，要求從低濃度到高濃度測定2.嚴格控制培養(yǎng)時間六、操作步驟：2 / 41.標(biāo)記取11支無菌試管，用記號筆分別標(biāo)明培養(yǎng)時間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。2.分別用5ml無菌吸管吸取2.5ml大腸桿菌過夜培養(yǎng)液（培養(yǎng)1012h）轉(zhuǎn)入盛有90mlLB培養(yǎng)液的 三角瓶，混合均與后分別取5ml混合液放入上述標(biāo)記的11支無菌試管中。2.培養(yǎng)將已接種的試管置丁搖床37C振蕩培養(yǎng)（振蕩頻率250r/min），分別

4、培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h,將標(biāo)有相應(yīng)時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測定其光密 度值。3.比濁測定用未接種的LB培養(yǎng)基作空白對照，選用600nm波長進行光電比濁測定。從早取出的培養(yǎng)液開始 依次測定，對細胞密度大的培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測定，使其光密度值在0.10.65之間。七、詳細實驗過程記錄：時間實驗進度要求具體操作備注2011-06-20上午分組（2人/組）；準(zhǔn)備、活洗實驗儀器。小試管3支，大試管3支，250ml三角 瓶1個，5ml吸管3支，洗凈干燥。2011-06-20下午準(zhǔn)備、活洗實驗儀器； 配置LB培養(yǎng)基。（1）活洗儀器：

5、6cm小 g 也8套，9cmWFM 48套，4個150ml二角瓶+玻珠，5ml吸管1支，0.5ml吸管12支，1ml吸管12支，洗凈干燥。（2）配置1000mlLB培養(yǎng)基（5組用量）：蛋白豚10g,酵母菖5g,NaCL10g蒸僻水1000ml, NaOK溶液調(diào)節(jié)PH至7.0后，分裝入250ml三角瓶封裝，丁120C滅菌20min。LB培喬在?不加瓊脂。2011-06-20晚上一次接種。取濕熱滅菌后LB液分裝2支試管 各5ml,一支接入E.coli斜面菌種，一 支做空白對照，靜置培喬。2011-06-21上午觀察一次接種生長情 況；二次接種。用5ml無困吸管吸取3 ml大腸桿菌過夜 g液（培養(yǎng)1

6、012h）轉(zhuǎn)入盛有90mlLB培養(yǎng)液的三角瓶， 混合均與后分別取5ml混合液放入編號為1#11#勺11支 無困試菅中，置丁搖床37 C振蕩培喬頻率250r/min）。一次接種中接入E.coli的LB培養(yǎng)液渾濁，未接 種的對照組培養(yǎng) 液澄活。2011-06-21上午2011-06-22上午接種困液分別培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h,將標(biāo) 有相應(yīng)時間的試管取 出，立即放冰箱中貯存。按編號將各組相同培養(yǎng)時間編號的試 管分組放置丁搖床中，按時取出置 丁冰箱保存。2011-06-22上午光電比濁測定各培喬時問段的細菌培養(yǎng)液OD用未接種的LB培養(yǎng)基作仝白對照，選 用600n

7、m波長進行光電比濁測定。從早3 / 4值。取出的喬液開始依次測定，對細胞密 度大的培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀 釋后測定，穌光密度值在0.10.65之間。2011-07-04整理實驗數(shù)據(jù)，分析實 馭紿果，兀成頭馭報口 撰寫。八、實驗報告：1.結(jié)果(1)將測定的OD值填入表V-1:表V-1細菌培養(yǎng)液OD值測定結(jié)果培養(yǎng)時間/h對照01.534681012141620取出時間12:3012:3013:1514:4515:4517:4519:4521:4523:4501:4503:4507:45OD值00.0480.0940.2780.5040.5330.7230.7731.0651.2171.291

8、1.160(2)繪制大腸桿菌的生長曲線：見0圖V-4實驗結(jié)果分析：通過比濁測定法和稀釋平板菌落計數(shù)法對大腸桿菌生長曲線進行了測定，測定結(jié)果顯示：大腸桿菌生長曲線基本符合延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個時期的劃分，但是與典型生長曲線存在明 顯差異，延緩期較短，穩(wěn)定期延長到十小時以上。本次試驗因采用以培養(yǎng)1012小時的大腸桿菌，故延遲期較短。在培養(yǎng)3小時之后進入對數(shù)期， 生長速率逐漸增大，在培養(yǎng)15小時之后，菌數(shù)不再發(fā)生變化，進入穩(wěn)定期。由丁培養(yǎng)時期較短，故 無衰亡期。大腸桿菌生長曲線系歹04 / 42.思考題(3)細菌生長繁殖所經(jīng)歷的4個時期中哪個時期的時代最短？若細胞密度為103個/ml,培

9、養(yǎng)5小時 候其密度高達2X1C8個/ml,計算出其代時。答：對數(shù)生長期時間最短。細菌經(jīng)過遲緩期進入對數(shù)生長期，并以最大速率生長和分裂，導(dǎo)致細菌數(shù) 量呈對數(shù)增長，此時細菌生長呈平衡生長，即細胞內(nèi)各成分按比例有規(guī)律的增加，所有細胞組分呈彼此相對穩(wěn)定速度合成。對數(shù)生長期細菌的代謝活性及酶活性高而穩(wěn)定，細胞大小比較一致，生活力強。在細菌個體生長里，每個細菌分裂繁殖一代所需時間為代時，以G表示。細菌的比生長速率小=(lgNt-lgNo) / (t-to) X 2.303= (8lg2-3) / 5 x2.303=2.4417hG=t-to lnNt-lnNo= ii (t1-to) G= (lnNt-lnNo) / =ln (Nt/No ) / = (5+ln2) / 2.4417=2.3316 (h)(4)次生代謝產(chǎn)物的大量積累在哪個時期？根據(jù)細菌生長規(guī)律，采用哪些措施可以使次生代謝產(chǎn)物 積累更多？答：穩(wěn)定期次級代謝產(chǎn)物大量積累。由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和PH等環(huán)境變化，環(huán)境條件