原位雜交原理及具體操作

1、原位雜交實(shí)驗(yàn)原理與方法一、目的本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)會(huì)原位雜交的使用方法。了解各種原位雜交的根本原理和優(yōu)缺點(diǎn)。二、原理原位雜交組化簡稱原位雜交，in situ hybridization histochemistry ; ISHH 屬于分子雜交的一種，是一種應(yīng)用標(biāo)記探針與組織細(xì)胞中的待測核酸雜交，再應(yīng)用標(biāo)記物相關(guān)的檢測系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術(shù)。原位雜交的本質(zhì)就是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補(bǔ)規(guī)如此與組織細(xì)胞內(nèi)待測 的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標(biāo)記的檢測系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來。當(dāng)然雜交分子的形成并

2、不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序即某種程度的同源性就可以形成雜交雙鏈。探針的種類按所帶標(biāo)記物可分為同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針 兩大類。目前，大多數(shù)放射性標(biāo)記法是通過酶促反響將標(biāo)記的基因摻入DNA中，常用的同位素標(biāo)記物有3H、35s 125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高，背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)， 但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會(huì)造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。 探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNAa針、cDNAW針、cRNAW針和合成寡核甘酸探針。cDNAW針又可

3、分為雙鏈 cDNA采針和單鏈cDNAW針。原位雜交又可分為菌落原位雜交和組織原位雜交。菌落原位雜交Colony in situ hybridization 菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA將NDA#干固定于膜上與 32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。組織原位雜交Tissue insitu hybridization 組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA然后進(jìn)展雜交。而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DN-

4、RNA雜交。一探針的選擇根據(jù)不同的雜交實(shí)驗(yàn)要求，應(yīng)選擇不同的核酸探針。 在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的 DNAe cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡 核甘酸探針和 RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個(gè)堿基改變時(shí)應(yīng)選用寡核甘酸探針，在檢測單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA|i鏈探針通過克隆人 M13噬菌體DNA得或RN琳針，寡核甘酸探針也可。長的雙鏈DNA針特異性較強(qiáng)，適宜檢測復(fù)雜的靶核甘酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交，因?yàn)樗灰淄高^細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)或核內(nèi)。在這種 情況下，寡核甘酸探針和短的PCRfe記探針80150bp具有較大的優(yōu)越性。在選用探針時(shí)經(jīng)常會(huì)受到

5、可利用探針種類的限制。如在建立DNA文庫時(shí)，手頭沒有篩選特定基因的克隆探針，這時(shí)就可用寡核甘酸探針來代替。但必須首先純化該基因的編碼蛋白，并測定6個(gè)以上的末端氨基酸序列，通過反推的核甘酸序列合成一套寡核甘酸探針。如果已有其它動(dòng)物的同種基因克隆，因?yàn)槿祟惡蛣?dòng)物間在同一基因的核甘酸順序上存在較高的同源性，因此可利用已鑒定的動(dòng)物基因作探針來篩選人類基因克隆。對于基因核甘酸序列背景清楚而無法獲得克隆探針時(shí)，可采用PCR方法擴(kuò)增某段基因序列， 并克隆人適宜的質(zhì)粒載體中，即可得到自己的探針。這種方法十分簡便，無論基因組DNA探針還是cDNA探針都可以容易地獲得，而且，可以建立PCR的基因檢測方法，與探針雜

6、交方法可作比照，可謂一舉兩得。二探針的標(biāo)記方法在選擇探針類型的同時(shí)，還需要選擇標(biāo)記方法。 探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時(shí)，還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。放射性探針的實(shí)際靈敏度不依賴于所采用的標(biāo)記方法，如隨機(jī)引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性 。在檢測單拷貝基因序列時(shí)，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記 方法。在對靈敏要求不高時(shí)， 可采用保存時(shí)間長的生物素探針技術(shù)和比擬穩(wěn)定的堿性磷酸酶 顯示系統(tǒng)。三探針的濃度總的來說， 隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的X圍內(nèi)，

7、隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經(jīng)驗(yàn)，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中 32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為510 ng/ml和251000ng/ml ,而原位雜交中，無論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.55.0 g/ml。探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。四雜交率在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度復(fù)雜度和探針濃度。五雜交最適溫度雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反響溫度。假如反響溫度低于Tm1015C,堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對減少。假如 反響溫度再低Tm-30C，雖然互補(bǔ)鏈之間也可

8、形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對減少， 錯(cuò)配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在50溢右或更低些的 DNA調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即最適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度與非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇與溫度對雜交的影響見表 18-3。最適復(fù)性溫度Optimunm renaturation temperature, TOR : Tor =Tm - 25 C 苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm - 10或15C非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm - 30或35C六雜交的嚴(yán)格性影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性。一般認(rèn)為在低于雜交體？七

9、雜交反響時(shí)間在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反響不完成；時(shí)間長了也無益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反響要進(jìn) 展20h左右。1966年Britten 和Kohne推薦用Cot =值來計(jì)算雜交反響時(shí)間。Cot值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度Co和反響時(shí)間t的乘積。實(shí)驗(yàn)明確 Cot =100時(shí)，雜交反 響根本完成。Cot=0 ,根本上沒有 雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的DNA 400d g/ml按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計(jì)算，總的吸收值為 9.6，如果反響時(shí)間為 21h, 那么對于未標(biāo)記的 DNA說，Cot =9.6/21 =100.8,雜交完成

10、了。對標(biāo)記 DN A濃度為0.1 g/ml來說Cot值為0.05,這就充分排除了標(biāo)記 DNA勺自我復(fù)性。Tm值25c時(shí)雜交 最優(yōu)，所以首先要根據(jù)公式4計(jì)算雜交體Tm值。由此式可見，通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性。八雜交促進(jìn)劑惰性多聚體可用來促進(jìn)250個(gè)堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加 3倍，而對雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo) 記的探針可增加高達(dá) 100倍。而短探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度低和分子量小，短探針本身的雜交率就高 。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種多 聚胺，平均分子量為 500 000。另一種常見的促進(jìn)劑是聚乙二醇PEG,PE

11、M子量小60008000、粘度低、價(jià)格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%- 10麻酸葡聚糖效果較好，假如用 5%- 10%PEG口此可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進(jìn)劑時(shí)有必要優(yōu) 化條件。另一種多聚體促進(jìn)劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%-4%與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉，粘度低MW=90 000。小分子化學(xué)試劑酚和硫鼠酸月瓜也能促進(jìn)雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進(jìn)劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)

12、用也是有限的。而硫鼠酸月瓜可通過降低雙鏈DNA勺Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進(jìn)RNA 的雜交，有裂解細(xì)胞而抑制 RNase的作用?？傊?，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交 是目前最常用的雜交促進(jìn)劑。七雜交反響時(shí)間在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反響不完成；時(shí)間長了也無益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反響要進(jìn)展20h左右。1966年Britten 和Kohne推薦用Cot =值來計(jì)算雜交反響時(shí)間。Cot值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度Co和 反響時(shí)間t的乘積。實(shí)驗(yàn)明確 Cot =100時(shí)，雜交反響 根本完成。Cot=0 ,根本上沒有雜交。例如在液相雜

13、交中未標(biāo)記的DNA 400d g/ml按單股DNA§微克 紫外吸收值為0.024計(jì)算，總的吸收值為 9.6，如果反響時(shí)間為21h,那么對 于未標(biāo)記的 DNA說，Cot =9.6/21 =100.8,雜交完成了。對標(biāo)記 DNA濃度為0.1科g/ml 來說Cot值為0.05 ,這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。Tm值25c時(shí)雜交最優(yōu)，所以首先要根據(jù)公式4計(jì)算雜交體Tm值。由此式可見，通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性。八雜交促進(jìn)劑惰性多聚體可用來促進(jìn)250個(gè)堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而

14、短探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度低和分子量小，短探針本身的雜交率就高。硫酸葡聚糖是一種 廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進(jìn)劑是聚乙二醇PEG , PEG分子量小60008000、粘度低、價(jià)格低廉，但它 不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%- 10喻酸葡聚糖效果較好， 假如用5%- 10%PEG如此可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進(jìn)劑時(shí)有必要優(yōu)化條件。另一種多聚體促進(jìn)劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為工% 4%與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉，粘度低MW=90000。小分子化學(xué)試劑酚和硫鼠酸月瓜也能促進(jìn)雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和

15、降 低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進(jìn)劑，只能在低DN蹴度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而硫鼠酸月瓜可通過降低雙鏈DNA勺Tm直而起作用。此外，該分子還可以促進(jìn)RNA的雜交，有裂解細(xì)胞而抑制RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前最常用的雜交促進(jìn)劑。三、主要器材醫(yī)用微波爐，恒溫水浴箱、濕盒、PNP筆等。四、試劑二試齊ij:2.5ml/L 的醋酸2.5ml/L醋酸酎：三乙醇胺13.2ml氯化鈉5g濃鹽酸4ml醋酸酎用前加2.5ml ; 2

16、0XSSC pH7.0：氯化鈉175.3g枸檬酸鈉 88.2g 雙蒸水定容至 1L; 100 XDenhardt 's: Ficoll 1g PVP1gBSA 1gddH2O定容至50ml; 雜交液：50ml用量 終濃度100煩離子甲酰胺 25ml 50%100癡聚 糖硫酸脂 5mg 10%100 Denhard 's 0.5ml 11Mtris -HCLPH8.00.5ml 10Mm5M NaCl 3ml 0.3M 0.5M EDTA PH8.00.1ml 1mM10mg/ml 變性魚精 DNA 0.5ml 100ug/mlddH2O 定容至 25ml,0.1M 甘氨酸 /P

17、BS:甘氨酸 7.5gNa2HPO4 30.8gNaH2PO4 2.8gNaCl 8.5g 溶于800mlddH2Q 定容至 1000ml,高壓，室溫儲(chǔ)存； TSM1 1000ml： 1MTris-HCLPH8.0 100ml5M NaCl 20ml1M MgCl2 10mlddH2O 定容至 1000ml; TSM2 1000ml： 1MTris-HCL PH8.0100ml5M NaCl 20ml1M MgCl2 50mlddH2O 定容至 1000ml; 抗體稀釋液：100mlBSA1.0gTris X-100 0.4ml 疊氮鈉 0.4g0.05M PBSPH7.2調(diào)至 100ml;

18、0.05MPBSPH7.2： 1000mlNa2HPO4 15.4gNaH2PO4 1.4gNaCl 4.25多去內(nèi)源性酶液 40ml： 儲(chǔ)存液 用量 終濃度10好醛4.0ml 0.3 0.5%冰醋酸10.0ml 25.0%力口 0.05MPBS至 40ml,0.4% Triton-X 100五、操作一 脫蠟，水化：1、二甲苯10min兩次2、 無水乙醇3min兩次3、95叱醇 3min 一次 4、75叱酉I 3min 一次 5、50叱酉I 2min 一次 6、重蒸水 2min 一次 7、PBS 洗滌5min 二將組織芯片放入去內(nèi)源性酶液中浸泡30min ; PBS洗滌5min三0.1M甘氨酸

19、去游離醛基 15min ; 0.4%tritonX-100 洗10min；四 用蛋白酶K與37c孵育 30min , PBS振洗5min五 在0.1mol/L 三乙醇月堂 0.25%乙酸酎中孵育 10min ;在 2XSSC中洗5min ;六滴加預(yù)雜交液42C,30min；將RN琳針用預(yù)雜交液稀釋 1ng/u L2ng/ u L七 雜交1、在載玻片外表覆蓋上雜交小室，加 2050 u L的雜交液到 組織芯片 TMAk, 42C44c濕盒中過夜。2、在 4XSSC中37c洗滌15min 3、2XSSQ 參加 RNAB大致為 10ug/ml37 c 中洗滌 30min, 4、0.5XSSC,37c

20、洗滌 15min八 封閉1、1%正常山羊血清孵育 30min 2、用抗體稀釋液稀釋堿磷酶標(biāo)記的抗地高辛抗體1:50037c中孵育 3h, PBS洗三次，每次 5min 3、TSM1洗；4、 TSM冊；九顯色：用 TSM2W NBT/BCIP按2: 1稀釋進(jìn)展顯色；顯微鏡下掌握染色程度十終止顯色：用水終 止H一脫水，透明，封固1、85叱醇脫水，2min2、95叱醇月宓K 5min 3、無水乙醇脫水15min4、二甲苯20min 5、封片，鏡檢原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的根本方法點(diǎn)擊次數(shù)：236發(fā)布時(shí)間：2010-2-1 8:13:09、核酸分子雜交技術(shù)1961年Hall開拓了液相核酸雜交技術(shù)的研究，其

21、根本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對之間非共價(jià)鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛開展，特別是70年代末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA勺構(gòu)建成功，核酸自動(dòng)合成儀的誕生，大大豐富了核酸探針的來源，新的核酸分子雜交類型和方法不斷涌現(xiàn)。按其作用方式可大致分為固相雜交和液相雜交兩種：液相雜交是指參加反響的兩條核酸鏈都游離在溶液中，而固相雜交是將參加反響的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等，另一條參加反響的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交有菌落原位雜交 colony in situ

22、 hybridization 、斑點(diǎn)雜交法Dot blot、Southern 印跡雜交Southern blot、Northern 印跡雜交Northern blot 和組織原位雜交Tissue in situ hybridization ,即原位 雜交組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。液相分子雜交技術(shù)包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復(fù)性速率液相分子雜交等。、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來與開展原位雜交組織或細(xì)胞化學(xué)技術(shù)簡稱原位雜交 In situ hybridization ，如上所述， 屬于固相核酸分子雜交的X疇。但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術(shù)。菌落雜交

23、系細(xì)菌裂解釋放出 DNA然后進(jìn)展雜交。Southern印跡雜交法是以鑒定 DNA 中某一特定的基因片段，而 Norhtern印跡雜交法是用以檢測某一特定的 RNM段的。它們 都只能證明該病原體、細(xì)胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細(xì)胞或組織中存在的部位。1969年美國耶魯大學(xué)Gall和Pardue首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵 母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。與此同時(shí)， Buongiorno - Nardelli和Amaldi, John與其同事等相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)展了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)。Orth1970應(yīng)用3H標(biāo)

24、記的兔乳頭狀瘤病毒 cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)展雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNAS細(xì)胞中的定位，但當(dāng)時(shí)的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞，探針均采用同位素標(biāo)記。由于同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進(jìn)展原位雜交。Bauman 1981等首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記 cRNAB針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer1982報(bào)道用2, 4二硝基苯甲醛DNP標(biāo)記DNA針，使該DN琳針具有抗原性，然后用兔抗 DNP勺抗體來識別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種

25、方 法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應(yīng)用不夠普遍。Pezzella1987創(chuàng)建了用磺基化DN琳針來做細(xì)胞或組織原位雜交的方法，其根本原理是使DNA探針的胞喀咤堿基磺基化，利用單克隆抗體識別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結(jié)合的單克隆抗體，從而對雜交結(jié)合的探針進(jìn)展定位。 本法的優(yōu)點(diǎn)是磺基化 DANB針標(biāo)記簡便，不需作缺口平移標(biāo)記， 敏感 度也較高。但自生物素和高辛標(biāo)記探針技術(shù)建立后，已有取而代之的趨勢。生物素標(biāo)記探針技術(shù)是Brigat1983首先建立的，它利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測了病毒DNA通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNM細(xì)胞中的定位。生物

26、素標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)的臨床診斷中。這種生物素標(biāo)記技術(shù)又叫酶促生物素標(biāo)記技術(shù)。另一種叫光促生物素標(biāo)記核酸技術(shù)，該技術(shù)是用光敏生物素Photobiotin 標(biāo)記核酸。目前應(yīng)用的光敏生物素有乙酸鹽和補(bǔ)骨脂素生物 素，它們都是由三個(gè)局部組成：光敏基團(tuán)、連結(jié)臂和生物素圖 20-1。在強(qiáng)光下，不需 酶反響，光敏生物素的光敏基團(tuán)即可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標(biāo)記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標(biāo)記效率不高，每100150個(gè)堿基才能標(biāo)記一個(gè)生物素，對于短的基因探針特別是寡核甘酸探針不宜使用，以免因標(biāo)記數(shù)過少而影響靈敏度 Forster et al 1985。近年來，地高

27、辛Digoxigonin 標(biāo)記技術(shù)引起科技工作者的極大興趣。Boeringer MannhemBio - chemisca于1987年將地高辛標(biāo)記的有關(guān)試劑與藥盒投放市場。和其它非放射性標(biāo)記物一樣，地高辛較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時(shí)間。同時(shí)在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標(biāo)記技術(shù)要優(yōu)越，可以檢測出人基因組 DNA中的單拷貝基因。地高辛標(biāo)記法顯示的顏色為紫藍(lán)色標(biāo)記堿性磷酸酶 -抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)，有較好的反差背景。核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同可分為 DN琳針、RN琳針、cDNAW針、cRNA探針和寡核甘酸探針等。DN琳針還 有單鏈

28、DNASingle stranded, ssDNA 和雙鏈 DNADouble stranded, dsDNA 之分詳 見十九章。早期應(yīng)用的主要是DNA探針，繼之Temin在70年代研究致癌 RNAW毒時(shí)制備了 cDNAW針plementary DNA，其根本原理是以 RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶reverse transcriptase 又稱為RNA旨導(dǎo)的DN咪合酶催化產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，按照 RNA的核甘酸順序合成 DNA這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄。CDN幅指互補(bǔ)于mRNA勺DNA分子。RNA探針是將特異性的 cDNA片段插入含有相當(dāng)?shù)?RN咪合酶啟動(dòng)子 的轉(zhuǎn)錄性載

29、體。這類載體包括pSP64和pSP65,它們具有不同的啟動(dòng)子在多克隆位點(diǎn)的各側(cè)。Psp64和pSP65在sP6啟動(dòng)子的多克隆位點(diǎn)的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制 RNA勺轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條 DNAK為模反轉(zhuǎn)錄 RNA從 而可以得到與 mRN洞序列白同義 RN琳針Sense probe和與mRNAE補(bǔ)的反義 RN琳針 antisense probe ,又稱互補(bǔ) RN琳針plementary RNA probe , cRNA 。通常用同義 RN琳針做為反義 RN麻針的陰性對照。由于 RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交 反響極高。有報(bào)告認(rèn)為其雜交率

30、高于DN琳針的8倍。DNA合成儀的誕生使制造寡核甘酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核甘酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核甘酸序列合成的。具有制造方便，價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，也可進(jìn)展放射性與非放射性標(biāo)記，但其特異性不如克隆性探針強(qiáng)，亦不如其雜交信號高。原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在近20年的開展可以說是飛躍的，其突出的特點(diǎn)是由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加，探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大開展了，更重要的是非放射性標(biāo)記物的開展使原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在不久的將來將和現(xiàn)今的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一樣成為實(shí)驗(yàn) 室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。新的非放射性標(biāo)記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。Cou

31、lton 1991建議將非放射性標(biāo)記技術(shù)更名為親合復(fù)合物標(biāo)記技術(shù) Affinity - plex Labelled Probes, ACLP。因?yàn)椤胺莕on”在英文里是一個(gè)否認(rèn)的名詞，而且根據(jù)非 放射性標(biāo)記技術(shù)的原理是將一個(gè)標(biāo)記物利用其親合性，應(yīng)用直接或間接的方法結(jié)合在核甘酸分子上。原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)的研究中可視為一項(xiàng)革命性的技術(shù)。它使它們的研究從器官、組織和細(xì)胞水平走向分子水平。 為各個(gè)學(xué)科的研究帶來突破性的進(jìn)展。 其中特別突出的 是細(xì)胞或組織的基因表達(dá)、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學(xué)。我們在下節(jié)將詳加表示。三、位雜交組織化學(xué)技術(shù)的根本方法如前所述，由于核酸探針的種類和標(biāo)記物的

32、不同，在具體應(yīng)用的技術(shù)方法上也各有差異，但其根本方法和應(yīng)用原如此大致一樣。大致可分為：雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和 組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等；雜交；雜交后處理；顯 示visual ization ：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。a固定原位雜交組織化學(xué)技術(shù)In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH 在固定劑的應(yīng)用 和選擇上應(yīng)兼顧到三個(gè)方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA RNA勺水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA比擬穩(wěn)定的，mRN渥相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此

33、，對于DNA勺定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA勺定位上，如果要使 RNA勺降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的 種類濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮到取材至進(jìn)入固定劑或冰凍這段時(shí)間對RNA呆存所帶來的影響，因組織中mRNA勺降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑如戊二醛不同，多 聚甲醛不會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì)影響探針穿透入細(xì)胞或組織。其它如醋酸-酒精的混合液和 Bouin' s固定劑也能獲得較滿意的效果。對于mRNA勺定位，我們常采用的方法是將組織固定于 4腦聚甲醛磷酸

34、緩沖液中 12h,在冷凍前浸入15滯糖溶液中， 置4c冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。組織也可在 取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4腦聚甲醛約10min,空氣枯燥后保存在-70Co如冰箱溫度恒定，在-70C可保存數(shù)月之久不會(huì)影響雜交結(jié)果。在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對檢測DN用口 mRNAt時(shí)也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時(shí)，在包埋的過程中可減低mRNA勺含量。其它固定劑如應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定枯燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。各種固定劑均有各自優(yōu)缺點(diǎn)，

35、如沉淀性Precipitating 固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin' s液、Carnoy' s液等能為增加核酸探針的穿透性提供 最優(yōu)條件，但它們不能最大限度地保存RNA而且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。戊二醛能較好地保存RN用口組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認(rèn)為ISHH較為理想的固定劑。b玻片和組織切片的處理1 .玻片的處理玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h,清水洗凈烘干，95%酉精中浸泡24h后蒸儲(chǔ)水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150c或以上過夜以去除任何 RNA酶。蓋玻片

36、在有條件時(shí)最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放由于ISHH的實(shí)驗(yàn)周期長，實(shí)驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，枯燥后待切片時(shí)應(yīng)用，以保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有銘磯-明膠液，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉易得，但在長周期實(shí)驗(yàn)過程中，粘附效果不夠理想。多聚賴氨酸液具有較好的粘 附效果，但價(jià)格昂貴，需進(jìn)口。2 .增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應(yīng)用較強(qiáng)的增強(qiáng)組織通透性的試劑。增強(qiáng)組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑detergent或稱清洗劑

37、Triton X-100 、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、 胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶 diastase等。這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強(qiáng)組織的 通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時(shí)也會(huì)減低RNA的保存最和影響組織結(jié)構(gòu) 的形態(tài)，因此，在用量與孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。蛋白酶 K Proteinase K 的消化作用 在ISHH中是應(yīng)用于蛋白消化的關(guān)鍵步驟，其濃度與孵育時(shí)間視組織種類、應(yīng)用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應(yīng)用酶K1g/ml于0.1mol/L Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0 緩沖液中，37C孵育1520min,以達(dá)到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為

38、目的。蛋 白酶K還具有消化包圍著靶 DNA勺蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號。在蛋白酶K消化后,應(yīng)用0.1mol/L的甘氨酸溶液在 PBS中清洗以終止蛋白酶 K的消化作用，甘氨酸是蛋白 酶K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4腦聚甲醛再固定。Burns等 1987報(bào)告應(yīng)用胃蛋白酶Pepsin20100g/ml用0.1N HCl配37C、30min進(jìn)展消化，所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 優(yōu)于蛋白酶Ko不少實(shí)驗(yàn)工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酎 acetic anhydride 和三乙醇胺tri ethanolamine中以減低靜電效應(yīng)， 減少探針對組織的非特異性背景染色。有的作者除在室溫下浸于上述溶液 10min外

39、，還在預(yù)熱37c的50%?酰胺/2XSSC液中預(yù)雜交15min,然后 用 2XSSC 0.30mol/L NaAc/0.030mol/L 枸檬酸鈉液中浸 15min。但 Heinz、Hofer 等一些著名學(xué)者卻對此持有異議，根據(jù)他們的實(shí)驗(yàn)和經(jīng)驗(yàn)證明，乙酸酎和三乙醇胺液的處理并不能 起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。3 .減低背景染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色一樣 ISHH實(shí)驗(yàn)程序中，如何減低背景染色是一個(gè)重要的問題。ISHH中背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。雜交后 Posthybridization 的 酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。預(yù)雜交Prehybridization

40、是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖 Dextran sulphate。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封 閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。有的實(shí)驗(yàn)室在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液20g/ml洗滌一次，以減低殘留的和內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。4 .防止RNAB的污染由于在手指皮膚與實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿上均可能含有RNAB,為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿與鐐子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫240C 烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的。要破壞 RNA酶，其最低溫度必須在150c左右。有條件的國外實(shí)驗(yàn)室在

41、消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標(biāo)記和防止取出時(shí)空氣污染。在無高溫消毒的烤箱時(shí)，亦可用國內(nèi)出產(chǎn)的衛(wèi)生蒸汽消毒鍋某某新華醫(yī)療器材廠生產(chǎn)。雜交前與雜交時(shí)所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。c雜交Hybridisation 在ISHH,整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期是比擬長的，實(shí)驗(yàn)程序也比擬繁雜，而雜交在ISHH整個(gè)實(shí)驗(yàn)中可被認(rèn)為是“短兵相接'的一步。雜交前的一切準(zhǔn)備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進(jìn)入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核甘酸相結(jié)合。因此，雜交是 ISHH中關(guān)鍵的 而且是最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。國內(nèi)向正華等采用無菌的蠟?zāi)ご婀杌纳w玻片也可獲得滿意

42、的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫50c左右導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。 因此，也有為穩(wěn)妥起見， 在蓋玻片周圍加液體石蠟封固的，但作者認(rèn)為 這并不十分必要，因封固的石蠟在高溫下融解反易導(dǎo)致雜交液的污染，必要時(shí)可加橡皮泥封固蓋片四周。硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)是清潔無雜質(zhì)，光滑不會(huì)產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達(dá)到覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。在孵育時(shí)間較長時(shí)，為保證雜交所需的濕潤環(huán)境，可將復(fù)有硅化蓋玻片進(jìn)展雜交的載片放在盛有少量5X SSC或2XSSC standard saline citrate, SSC 溶液的硬塑料盒要能防止高溫破壞中進(jìn)展孵育。雜交液的

43、成分和預(yù)雜交液根本一樣，所不同的是參加了標(biāo)記的核酸探針和硫酸葡聚糖。如前所述，雜交前的準(zhǔn)備只是為雜交的成功奠定根底，要獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在雜交這一實(shí)驗(yàn)過程中還須注意以下的環(huán)節(jié)。1 .探針的濃度很難事先確定每一種實(shí)驗(yàn)探針的濃度，但要掌握一個(gè)原如此，即探針濃度必須給予該實(shí)驗(yàn)最大的信 /噪比值。背景染色的上下也與探針濃度有關(guān)。根據(jù)國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)工作者的經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為最優(yōu)原如此應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達(dá)到與靶核甘酸的最大飽和結(jié)合度為目的。這和我們在免疫細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)中選擇抗血清的最優(yōu)工作濃度的原如此一樣。探針濃度依其種類和實(shí)驗(yàn)需要略有不同，根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)與所查閱文獻(xiàn)，在原位雜交細(xì)胞化學(xué)中，探針濃度為 0.55.

44、0g/ml即0.55.0ng/ 口。根據(jù) Heinz、Hofelt實(shí)驗(yàn)室經(jīng) 驗(yàn)，對放射性標(biāo)記的 dsDNA或cRNA探針，其濃度在 25ng/wl。Conlton認(rèn)為生物素標(biāo)記 探針，其最優(yōu)濃度在 0.55ng/ 小。作者在英皇家研究生院Polak教授實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于放射性標(biāo)記cRNAB針的濃度為0.5ng/l ,而在非放射性標(biāo)記生物素或地高辛cRNA探針濃 度為2.5ng/ 口，放射性標(biāo)記 DN琳針濃度為1.0ng/ 小。向正華等應(yīng)用地高辛標(biāo)記生長抑 素cRNAW針獲得滿意結(jié)果，其探針濃度為 0.5ng/ 口。必須強(qiáng)調(diào)的是，國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室都證明加雜交液的量要適當(dāng)，以1020/每X切片為宜。雜交液過

45、多不僅造成浪費(fèi)，而且液量過多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導(dǎo)致高背景染色等不良后果。2 .探針的長度一般應(yīng)用于ISHH探針的最優(yōu)長度應(yīng)在 50100個(gè)堿基之間。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。據(jù)報(bào)告，長500個(gè)堿基的探針，其雜交時(shí)間約需 20h左右。 200500個(gè)堿基的探針仍可應(yīng)用，如超過500個(gè)堿基的探針如此在雜交前最好用堿或水解酶進(jìn)展水解，使其變成短的片段，達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需求的堿基數(shù)。3 .雜交的溫度和時(shí)間雜交的溫度也是雜交成功與否的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。在第十八章概述中曾提到DNA RNAI1加熱或變性、解鏈后才能進(jìn)展雜交。能使50%勺核甘酸變性解

46、鏈所需的溫度，叫解鏈溫度或融解溫度melting temperature, 簡稱TmJ 。原位雜交中，多數(shù)DNA探針需要的Tm是90C,而RNA如此需要95Co這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切 片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交的程序中常規(guī)的參加30%- 50卿酰月堂for mamide于雜交液中。McConaughy報(bào)告，反響液中每增加 1%勺甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72 C。因此，可用調(diào)節(jié)鹽濃度的方法來調(diào)節(jié)Tm Tm的計(jì)算公式在第十九章有介紹，由公式的列出也明確了它與鹽的濃度、探針的長度、甲酰胺的百分比等諸多因素有關(guān)。由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié)等因素， 實(shí)際采用的原位雜交的溫

47、度在Tm-25c左右，即比Tm減低25C,大約在3060c之間，根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異，RN用口 cRNA探針一般在3742c左右，而DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核甘酸為DNA的，如此必須在 8095c加熱使其變性，時(shí)間515min,有作用報(bào)告在 105c微波爐加熱使之變性，然后在冰上擱置1min,使之迅速冷卻，以防復(fù)性，再置入盛有2XSSC的溫盒內(nèi)，在3742c孵育雜交過夜。雜交的時(shí)間如過短會(huì)造成雜交不完全，而過長如此會(huì)增加非特異性染色。從理論上講，核昔酸雜交的有效反響時(shí)間在3h左右。Barns等1987報(bào)告用DNA探針雜交，其反響完成時(shí)間為24h。但為穩(wěn)妥起見，一般將雜交反響時(shí)間定為16

48、20h,或?yàn)楹啽闫鹨婋s交孵育過夜，從現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)告看無不良結(jié)果。當(dāng)然，雜交反響的時(shí)間與核酸探針長度與組織通透性有關(guān)，在確定雜交反響時(shí)間應(yīng)予考慮，并經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定。 有作者主X雜交反響的孵育應(yīng)在黑暗環(huán)境中進(jìn)展，因?yàn)楣饩€會(huì)促進(jìn)甲酰胺的電離作用。4 .雜交嚴(yán)格度Hybridization stringency 雜交條件的嚴(yán)格度stringency 表示通過雜交與沖洗條件的選擇對完全配對與不完全配對雜交體的鑒別程度。錯(cuò)配對mismatch雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等， 可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強(qiáng)，但敏感性降低， 反響

49、亦然。一般來說，低嚴(yán)格度low stringency 雜交與沖洗條件在 Tm-35c至Tm- 40 C 之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70%- 90%勺同源性核甘酸序列被結(jié)合，其結(jié)果是導(dǎo)致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。中嚴(yán)格度，Tm - 20c至Tm-30c的X圍。高嚴(yán)格度high stringency 為Tm-10c至Tm-15C ,低鹽和高甲酰胺濃度。在這種條件下，只有 具有高同源性的核甘酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。麥躍行裝用地高辛標(biāo)記原位雜交技術(shù)檢測鋒利濕疣中人乳頭瘤病毒DNAS1別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)格條件下Tm-12C各型病毒 DNA勺檢出率和陽性率明顯低于非嚴(yán)格條件下Tm-35C

50、,其相差非常明顯P<0.001。因?yàn)?，在?yán)格條件下只有同源性很強(qiáng)的DNM被檢出，而在非嚴(yán)格條件下同源性較低的DNA列也被檢出。因此，他建議對病毒 DN酚型需在高嚴(yán)格條件下進(jìn)展，而低嚴(yán)格條件如此可用于對病毒感染進(jìn)展篩選。由于原位雜交技術(shù)多數(shù)是在 Tm-25c進(jìn)展的，不屬于高嚴(yán)格 X圍，無疑會(huì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合導(dǎo)致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強(qiáng)雜交后處理洗滌的嚴(yán)格度使非特異性的雜交體減少。由于RNA雜交的穩(wěn)定T應(yīng)用 cRNA探針進(jìn)展細(xì)胞或組織的原位雜交時(shí)的雜交溫度比其它核酸探針要高 1015C。實(shí)驗(yàn)證明，cRNA產(chǎn)生的信號比雙鏈 cDNA要強(qiáng)。單鏈的 RNA探針其雜交信號大于雙鏈的 cD

51、NA的28 8倍。5 .硫酸葡聚糖Dextran sulphate和甲酰胺formamide硫酸葡聚糖是核酸雜交液50虬右，而硫酸葡聚糖占10批hydrate作用，因而能大大增加特別是對雙鏈核酸探針。這是應(yīng)用中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占 右。它是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強(qiáng)的水合 雜交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促進(jìn)雜交率, 硫酸葡聚糖于雜交液中的主要目的。甲酰胺的主要作用在上節(jié)已提與，在調(diào)節(jié)雜交反響溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。甲酰胺還可防止在低溫時(shí)非同源性片段的結(jié)合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩(wěn)定的作用。d

52、雜交后處理post hybridisation treatment雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)程序中，這也是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。特別因?yàn)榇蠖鄶?shù)的原位雜交實(shí)驗(yàn)是在低嚴(yán)格度條件下進(jìn)展的， 非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強(qiáng)了背景染色。RN琳針雜交時(shí)產(chǎn)生的背景染色特別高，但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。 在雜交后漂洗中的RNAB液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時(shí)間因核酸探針的類型和標(biāo)記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原如此是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注

53、意的是在漂洗的過程中，切勿使切片枯燥?？菰锏那衅词勾罅康娜芤浩匆埠茈y減少非特異性結(jié)合，從而增強(qiáng)了背景染色。 放射性標(biāo)記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法檢測背景染色非特異性標(biāo)記的多少作為改善漂洗程序的指針。在35S標(biāo)記的核酸探針在漂洗液中須參加14mmol/L的3 -疏基乙醇3 -mercaptoethanol 或硫代硫酸鹽thiosulphate ，以防止35S標(biāo)記的核酸探針被 氧化?？傊绾慰刂破吹膰?yán)格度從而達(dá)到理想的信/噪比無既定方案可循，必須從反復(fù)的實(shí)踐中取得經(jīng)驗(yàn)。e顯示Visualization顯示又可稱為檢測系統(tǒng)Detection system。根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類

54、分別進(jìn)展放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進(jìn)展不同顯色處理。細(xì)胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進(jìn)展半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計(jì)算機(jī)輔助的圖象分析檢測儀 puter - assisted image analysis檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織可利用酶檢測系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計(jì)或圖像分析儀對不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強(qiáng)度進(jìn)展檢測。但利用ISHH做半定量測定必須注意嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)的同一條件，切片的厚度和核酸的保存量如取材固定的間隔時(shí)間等。如為放射自顯影，核乳膠膜的厚度與稀釋度等必須保持一致。對照實(shí)驗(yàn)和ISHH結(jié)果的判斷和其它實(shí)驗(yàn)方法一樣，并非 ISHH

55、的任何陽性信號都是特異性的，故必須同時(shí)有對照試驗(yàn)以 證明其特異性。對照試驗(yàn)的設(shè)置須根據(jù)核酸探針和靶核甘酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選 定。從理論上講，對照試驗(yàn)設(shè)置愈多其靶核甘酸特異性確定愈可靠，但現(xiàn)實(shí)是不可能的。因 此，在上述對照試驗(yàn)中應(yīng)任選設(shè)至少34種用以證實(shí)ISHH結(jié)果的可靠性。在上述試驗(yàn)中，標(biāo)明*者為比擬可靠的對照試驗(yàn)。Northern和 Southern印跡雜交法證明的方式和用 Western印跡法檢測抗體蛋白質(zhì)的特異性一樣，是比擬可靠的。如果具備相當(dāng)?shù)拿庖?組化抗血清，可用結(jié)合的免疫組織化學(xué)和ISHH法從蛋白質(zhì)或多肽水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應(yīng)mRN耿存于同

56、一細(xì)胞中。預(yù)先將切片用 DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是 DNA或RNA如同免疫組化的吸收試驗(yàn)一 樣，事先與特異性的 cRNA cDNAS展雜交。再進(jìn)展ISHH,其結(jié)果應(yīng)為陰性。 由于同義RNA 探針和組織內(nèi)mRN際列順序是一樣的，應(yīng)用其進(jìn)展ISHH,結(jié)果應(yīng)為陰性。檢測系統(tǒng)的對 照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無標(biāo)記探針的情況下進(jìn)展。ISHH的最大優(yōu)點(diǎn)是它的高度特異性，它可測定組織、培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞提取物中的核甘酸含量。應(yīng)用高敏感度的放射性標(biāo)記cRNAa針在理想的ISHH的實(shí)驗(yàn)條件下檢測 mR- NA其敏感度可達(dá)到 20個(gè)mRNA貝/ 每個(gè)細(xì)胞。由于雙鏈 DNA的穩(wěn)定性，在用ISHH定位DNA寸很少發(fā)生丟失，降解。在靶核昔 酸序列比擬伸展的情況如染色體鋪片，長于2kb的探針可以應(yīng)用。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時(shí)甚