單克隆抗體制備操作方法及注意事項(xiàng)JEN

1、無(wú)菌室清潔要求：1、進(jìn)入無(wú)菌間，須更換白大褂，口罩、鞋套必須戴上，最好戴上帽子、手套；2、進(jìn)去后用酒精棉球擦洗手；3、生物安全柜常用酒精棉球擦洗，擦后棉球不顯黑；柜內(nèi)垃圾當(dāng)日及時(shí)清理；柜內(nèi)所有實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈前進(jìn)行；經(jīng)常紫外殺菌；4、無(wú)菌間物件傳遞，經(jīng)窗口紫外照射方可；5、有關(guān)試劑使用后及時(shí)用封口膜封??；6、細(xì)胞培養(yǎng)蓋子旋松，以便二氧化碳?xì)怏w進(jìn)入；拿瓶、加液體均需注意瓶口，避免污染瓶蓋；7、出門后需要用鑰匙鎖上；8、整個(gè)無(wú)菌間兩周清潔一次；免疫動(dòng)物：選擇與瘤細(xì)胞同一品系的動(dòng)物做為免疫對(duì)象，現(xiàn)在常用的是Balbc/c小鼠，6-8周齡，一種抗原一次性注射 2-3只小鼠，小鼠不宜過(guò)大，雌性相對(duì)較

2、好；首次注射抗原100微克與等體積弗氏完全佐劑混勻，在背部?jī)蓚?cè)皮下與腹腔分別 注射，形成幾個(gè)小泡；間隔兩周左右時(shí)間（14天）二次免疫注射抗原50微克與等體積弗氏不完全佐劑混勻，在背部皮下及腹腔分別注射，通常上次背部小泡仍然存在；間隔兩周左右時(shí)間（14天）三免小鼠注射抗原50微克與等體積弗氏不完全佐劑混勻，在背部皮下及腹腔分別注射，通常上次背部小泡仍然存在；間隔7-10天左右時(shí)間尾部采血測(cè)定抗體效價(jià)：方法一：手拇指和食指從背部抓住小鼠頸部皮膚，將小鼠頭朝下，小鼠保定后將其尾巴置于50°熱水中浸泡數(shù)分鐘，使尾部血管充盈。擦干尾部，再用剪刀或 刀片剪去尾尖12mm用試管接流出的血液，同時(shí)自

3、尾根部向尾尖按摩。取血 后用棉球壓迫止血并用6喊體火棉膠涂在傷口處止血。每次采血量 0.1ml。方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同時(shí)抓住尾梢協(xié)助取血，另一 個(gè)人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住 尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液槍及時(shí)吸取全血2.5微升， 加在盛有97.5微升的PB颯沖液中稀釋10倍，再稀釋一百倍，之后做倍比稀釋 測(cè)定效價(jià)，讀數(shù)到陰性血清值的2.1倍，合理效價(jià)應(yīng)高于12.8萬(wàn)倍。實(shí)際操作顯示，采血使用剪尾方法較好，一人固定小鼠，另一人直接在尾端剪掉 1-2mm從尾根部向尾尖部按摩，在尾端可見一滴血，吸取2.0微升加在

4、2ml的PBS容液中，直接稀釋1000倍，混勻，再倍比稀釋測(cè)定效價(jià)；當(dāng)日或次日，對(duì)全血用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，測(cè)定抗體效價(jià)，效價(jià)未達(dá)到規(guī)范， 則繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)免疫，效價(jià)達(dá)到規(guī)范，則選擇效價(jià)最高的一只小鼠作為脾細(xì)胞源 鼠，并在細(xì)胞融合三天前尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。隨后，取凍存好的瘤細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)、擴(kuò)瓶，直到單只小鼠細(xì)胞融合需要穩(wěn) 定良好生長(zhǎng)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液約為 120ml （大約一周可以完成），之后可進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)；在細(xì)胞融合三天前（72-96小時(shí)），直接尾部靜脈注射50微克抗原加強(qiáng)免疫； 先用燒杯固定小鼠露出尾巴，用溫水（水溫約50度左右）泡大約2分鐘，這樣能使血管充分舒張。用干棉球擦干；用1毫升

5、注射器選擇兩側(cè)較淺的靜脈穿刺注 射抗原，位置選擇尾部中下2/31/2處比較好 從下向上扎，萬(wàn)一一次扎不進(jìn)，還 可以繼續(xù)使用此血管。具體操作是左手食指和中指上下夾注你所選擇血管的靠近 身體的一邊，無(wú)名指和小指墊起一塊紗布或者紙巾（建立一個(gè)穿刺的平面的作用）， 拇指壓住所選血管的尾尖端，上下夾住血管的距離應(yīng)以不影響右手持針上下移動(dòng) 為宜.（否則容易人為建立穿刺的角度，而使右手持穿刺針穿刺過(guò)深，導(dǎo)致穿刺失敗.） 右手持穿刺針，稍微挑起皮膚一點(diǎn)，就可以平著進(jìn)針，看到回血表明成功，還可以回 抽，見到回血后表明穿刺已進(jìn)入血管，可以給藥.穿刺結(jié)束后，用紗布?jí)鹤〈┐滩课?反折尾部進(jìn)行止血.良好并徹底的止血對(duì)于

6、血管可以起到很好的保護(hù)作用，這對(duì)于需要天天穿刺給藥是非常有用的（一般小鼠需要按壓時(shí)間很長(zhǎng)，否則易引起出 血）。如果尾部靜脈注射未能成功，則進(jìn)行腹腔注射。瘤細(xì)胞飼養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系， 這樣雜交融合率高，也便于接種雜交 瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量 McAb常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1 SP2 /0、X63 Ag8.653等。細(xì)胞的最大密度不得超106/ml, 一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1 ：4 或6進(jìn)行稀釋彳代，每35天可傳代一次。上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或 輕微貼壁生長(zhǎng)，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。1、顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，呈較亮表明細(xì)胞生長(zhǎng)良好，反之顏色較深，可見一些 小

7、黑點(diǎn)，可能細(xì)胞已大部分死亡；2、狀態(tài)良好，裝入二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng) 37C, 5%二氧化碳濃度，T25細(xì)胞 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)液可加15ml含10-20%的滅火小牛血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng) （酒精擦洗，有菌及時(shí)擦洗，常規(guī)一月一次，常開）3、每日顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，貼壁較多（細(xì)胞擠在一起幾乎無(wú)空白區(qū)域）或培 養(yǎng)液顏色變黃換液（倒出上清液，加新鮮培養(yǎng)液大體蓋住底部，細(xì)胞過(guò)多在 加新鮮培養(yǎng)基前吹打）一般3-5可重新長(zhǎng)滿4、換液2-3次5、生長(zhǎng)穩(wěn)定后，擴(kuò)瓶，先1:4 （細(xì)胞液：新鮮培養(yǎng)基）擴(kuò)瓶，之后可適當(dāng)增大比 例，擴(kuò)增到自己需要的培養(yǎng)液；6、凍存，取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞液，吹打混勻，轉(zhuǎn)到 50ml離心管中離心

8、，1000rpm 10min棄上清，底部為白色沉淀，加新鮮凍存液（ DMEM 60 FBS30 DMSO 10雙抗1）,分裝在2ml凍存管中加1ml （約每5ml細(xì)胞液原液對(duì) 應(yīng)1管一1ml）,在管子上面注明日期、名稱，先在4度中靜置數(shù)小時(shí)，再在 液氮液面上懸3060min,之后放入液氮中凍存；7、復(fù)蘇，拉線取出凍存管，用漂懸浮在盛有37度水的燒杯，燒杯置于水浴鍋中， 待融化后轉(zhuǎn)移到含有新鮮培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中混勻，進(jìn)行培養(yǎng)，在次日一定要更新培養(yǎng)基，去除DMSO,以有利于后續(xù)的培養(yǎng)；8、細(xì)胞融合時(shí)，將3瓶生長(zhǎng)良好的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移在 50ml離心管中，1000rpm 10min, 棄上清；加30ml

9、 DMEM離心洗滌一次，加10ml重懸混勻，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 計(jì)數(shù)備用；在實(shí)際培養(yǎng)中，大概三天后細(xì)胞基本可以長(zhǎng)滿，四天開始出現(xiàn)細(xì)胞死亡情況, 五天后有半數(shù)細(xì)胞死亡，六天后大部分死亡。HAT培養(yǎng)液濃度選擇商品化HAT多為50X,先用不完全培養(yǎng)基溶解后（10ml一管），按比例加到完 全培養(yǎng)基中制成HAT培養(yǎng)基；HAT一股含量偏高，做梯度培養(yǎng)瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選擇 合適的HAT培養(yǎng)液濃度；用24孔板和SP2/0進(jìn)行在各孔中加等體積的培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層細(xì)胞后依照下表添加不同量 的HAT培養(yǎng)觀察死亡情況；21.51.00.750.50.2521.5M.00.750.50.2521.51.00.750.50

10、.2521.511.00.750.50.25選擇第一天死亡半數(shù)細(xì)胞；第二天死亡大部分細(xì)胞；第三天全部死亡的濃度；在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，不同梯度的 HAT均可導(dǎo)致瘤細(xì)胞的快速死亡，具體實(shí)驗(yàn)可選用 2%,亦可選用1%;飼養(yǎng)細(xì)胞制備在細(xì)胞融合前，三天內(nèi)購(gòu)買 Balb/c或KM小鼠2-3只（個(gè)體易較大），在細(xì)胞融 合當(dāng)天制備飼養(yǎng)細(xì)胞；器材與試劑：解剖工具、5ml玻璃注射器、96孔板、50ml離心管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、HAT培養(yǎng)液、75%的酒精、250ml燒杯；操作方法：1、將小鼠摘眼球或拉頸脫臼處死，浸泡在75%酉精中5min,隨即放入超凈臺(tái)內(nèi)， 小鼠腹部朝上；2、酒精棉球腹部擦拭消毒，用止血鉗將腹部皮膚拉開，完

11、全露出腹膜；3、銀子小心提起小鼠腹部皮膚，注射 5ml DMEMP，輕輕按摩腹部1-2分鐘； 4、用注射器吸出腹腔內(nèi)液體，轉(zhuǎn)于50ml離心管中，1000rpm, 10min,棄上清液； 5、用5ml HAT®養(yǎng)液重懸沉淀，細(xì)胞計(jì)數(shù)，補(bǔ)加液體至細(xì)胞濃度為2*105個(gè)/ml ;6、加在96孔板中，每孔100微升，進(jìn)行培養(yǎng)；（96孔板約為6塊）一般18-24h后細(xì)胞生長(zhǎng)良好；在制備單克隆抗體過(guò)程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼 養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞 是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 （較為常用）、小鼠脾 臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞。初始飼養(yǎng)細(xì)胞均

12、為小圓形，之后逐漸曾梭形，即巨 噬細(xì)胞，可吞噬死亡細(xì)胞殘片，梭形細(xì)胞較多時(shí)，周圍會(huì)出現(xiàn)相對(duì)空白的區(qū) 域，反之，巨噬細(xì)胞較少，在換液時(shí)應(yīng)適當(dāng)補(bǔ)充飼養(yǎng)細(xì)胞；脾細(xì)胞懸液制備免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中 B淋巴母細(xì)胞素漿母細(xì)胞。一般取最后 一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時(shí) B淋巴母細(xì)胞比例 較大，融合的成功率較高。1、解剖三天（ 72-96小時(shí)）前尾部靜脈注射（難以操作可腹腔注射），每只50 微克抗原加強(qiáng)免疫；2、解剖工具滅菌，單個(gè)牛皮紙包裹，在金屬盒內(nèi)滅菌；在小燒杯口裹上尼龍網(wǎng)， 用繩子扎緊，牛皮紙包好滅菌；玻璃注射器牛皮紙包裹滅菌；3、摘眼球處死小鼠，采血分離血清待測(cè)；小

13、鼠在 75%酒精中浸泡5min,轉(zhuǎn)到超 凈臺(tái)內(nèi)；4、解剖小鼠小心取出脾臟，剪刀碰到小鼠體外或使用次數(shù)較多則更換剪刀，以 減少污染，取出脾臟后轉(zhuǎn)移到盛有 5-10ml的不完全培養(yǎng)基平皿中清洗，一 般更換兩個(gè)平皿，然后將脾臟轉(zhuǎn)移到固定在滅菌燒杯（50ml即可）的尼龍 網(wǎng)上，用彎頭眼科剪盡量剪碎，用 5ml玻璃注射器內(nèi)芯研磨脾臟；5、用不完全培養(yǎng)基緩慢沖洗，直到將脾臟細(xì)胞完全沖下；6、將燒杯內(nèi)液體轉(zhuǎn)移到50ml離心管內(nèi)，1000rpm 10min,棄上清；7、不完全培養(yǎng)基離心洗滌一次（也可以不做）；8、用不完全培養(yǎng)基重懸沉淀（重懸要輕柔），獲得脾細(xì)胞懸液；細(xì)胞計(jì)數(shù)，一般一只小鼠可得1.0-2.5X

14、108個(gè)脾細(xì)胞；細(xì)胞融合1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0, 1000rpm離心10分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。2）同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌 2次。3）將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1 ： 10的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用 不完全培養(yǎng)液洗1次，800rpm,10分鐘。4）棄上清，用滴管（移液槍）吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。5）輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)（可將離心管在手臂上輕磕）。6）在37c下融合，用盛滿水白大燒杯，預(yù)熱到 37C,在60秒內(nèi)延管壁緩慢加入預(yù)熱的1ml45%PEG（Merek分

15、子量1500）含5%DMSO,邊加邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管；靜置作用60秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至 90鐘；加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液， 終止PEG作用，每隔1分鐘分別加入1ml, 2ml, 3ml, 4ml, 5ml。7）離心，800rpm, 6分鐘。8）棄上清，用已經(jīng)配制好的HAT培養(yǎng)液取少量輕輕混懸融合細(xì)胞，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開，再混入培養(yǎng)液中；9）根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液。10）將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的 96孔板，200仙/孔，37C、5%CO2 在中間適當(dāng)時(shí)間，制備飼養(yǎng)細(xì)胞，離心、重懸，并混入到HAT培養(yǎng)液中，與融合細(xì)胞一起鋪到96孔板中；選擇性

16、培養(yǎng)（篩選雜交瘤）一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)三天，進(jìn)行換液，每孔取 100微升加100微 開（這時(shí)可以考慮適當(dāng)補(bǔ)充飼養(yǎng)細(xì)胞），觀察見梭形細(xì)胞較多或原細(xì)胞被吞噬較 多較好；在培養(yǎng)三天，孔內(nèi)相對(duì)空白較好，進(jìn)行再次換液或直接進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)有陽(yáng)性孔，則及時(shí)進(jìn)行克隆化。檢測(cè)一般取樣100微升，選擇效價(jià)在2.0以上者，在觀察對(duì)應(yīng)孔細(xì)胞是否存活，存活則可克隆化，不存活可考慮放棄或在 24孔板內(nèi)加飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間，這時(shí)改用HT培養(yǎng)液；抗體的檢測(cè)篩選雜交瘤細(xì)胞通過(guò)選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免 疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(shí)，即可開始檢測(cè)特 異性抗體，

17、篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。常用的方法有：ELISA、RIA、FACS（熒光激活細(xì)胞分類儀）、IFA;雜交瘤的克隆化有限稀釋法的程序1）制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液（同融合前準(zhǔn)備）2）陽(yáng)性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在 15Xl03/ml3）取130個(gè)細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞/ ml, 100 屋/孔加A、B、C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼 養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)為10個(gè)/ml, 100仙l/孔加D、E、F三排，為每孔 1個(gè)細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù) 5 個(gè)/ml, 100仙l/孔，加G、H兩排，為每

18、孔0.5個(gè)細(xì)胞。4）培養(yǎng)45天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液200仙l/孔。5）第89天時(shí)，肉眼可見細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。直接稀釋法：1、制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液；2、陽(yáng)性孔細(xì)胞計(jì)數(shù)，用不完全培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋，可選用 1.5ml離心管，每 組1ml,將細(xì)胞濃度控制在100-1000/ml,吸取含100個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液加在20毫 開混有飼養(yǎng)細(xì)胞的HA培養(yǎng)液中，均勻鋪在一塊96孔板中，理論值每孔含有一 個(gè)細(xì)胞；3、培養(yǎng)一周左右，進(jìn)行效價(jià)測(cè)定；4、每板選擇一孔效價(jià)較高的進(jìn)行二次克隆化，這次可不加HT和飼養(yǎng)細(xì)胞；培養(yǎng)一周左右，再次

19、進(jìn)行效價(jià)測(cè)定；5、如此，直到所有測(cè)定孔均為陽(yáng)性，選擇測(cè)定孔最好是單細(xì)胞群落，這最可能 是單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成的群落，即單抗菌株；6、重復(fù)測(cè)定全部顯示陽(yáng)性，則進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，生長(zhǎng)穩(wěn)定后 可進(jìn)行細(xì)胞凍存，保留該雜交瘤細(xì)胞株；待用；進(jìn)行后續(xù)攻瘤實(shí)驗(yàn)；瘤細(xì)胞的凍存雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安甑 含1X106以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在 24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿孔底時(shí)，一孔就可以凍一支安甑。凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降到0C,再降溫時(shí)一般按每分鐘降溫23C,待降至-70C可放入液氮中?；蚣?xì)胞管降至 0c后 放-70C超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存 細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性， 在液氮中細(xì)胞可保存數(shù) 年或更長(zhǎng)時(shí)間。單抗制備簡(jiǎn)要流程：免疫動(dòng)物四次間隔兩周達(dá)到一定效價(jià)加強(qiáng)免疫三天后細(xì)胞融合96孔板 三天后換液 HAT培養(yǎng)（可適當(dāng)添加飼養(yǎng)細(xì)胞）三天后換液 三天后直到孔底細(xì)胞生長(zhǎng)良好測(cè)定效價(jià)選擇陽(yáng)性孔克隆化 HT培養(yǎng) 24孔板（陽(yáng)性孔取100微升加到0.5ml中混勻，