實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法課件

1、實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法幾種特殊顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法幾種特殊顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與幾種細(xì)胞器的觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與幾種細(xì)胞器的觀察實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜て胀ü鈱W(xué)顯微鏡的主要結(jié)構(gòu)和基本性能。掌握低倍鏡、高倍鏡和油鏡的正確使用方法。初步了解光學(xué)顯微鏡的維護(hù)方法。在普通光學(xué)顯微鏡下識(shí)別細(xì)胞和細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)，掌握生物繪圖的方法。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 詳見講義實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法目鏡目鏡鏡筒鏡筒物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡物鏡

2、聚光器聚光器光圈光圈燈室燈室標(biāo)本移動(dòng)器螺旋標(biāo)本移動(dòng)器螺旋鏡座鏡座栽物臺(tái)栽物臺(tái)鏡臂鏡臂粗調(diào)節(jié)器粗調(diào)節(jié)器細(xì)調(diào)節(jié)器細(xì)調(diào)節(jié)器實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法幾種特殊顯微鏡的使用 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?了解相差顯微鏡、熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡的原理、構(gòu)造以及應(yīng)范圍廣泛；掌握這幾種顯微鏡基本的操作步驟。 實(shí)驗(yàn)要求： 了解普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及其原理，并熟練掌握其操作方法。具備一定的物理學(xué)光學(xué)知識(shí)。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法一、相差顯微鏡 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 人的眼睛只能感覺(jué)光波的波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度）的變化?；畹募?xì)胞和未染色的標(biāo)本多為無(wú)色透明，光波通過(guò)時(shí)，光波和

3、振幅并不發(fā)生變化，因而，常采用固定和染色等各種理化措施，使被檢物體的顏色和亮度發(fā)生變化，以利識(shí)別。另一方面，即使是近于無(wú)色透明的細(xì)胞和標(biāo)本，各部分的折射率和厚度也會(huì)有微小的差異。當(dāng)光波通過(guò)時(shí)，在各部分的滯留時(shí)間就會(huì)不同，即光程會(huì)有微小的不同，因而光波的相位會(huì)發(fā)生微小的變化。 人眼不能識(shí)別相位的差異，但相差顯微鏡能夠?qū)⑾嗖钭優(yōu)檎穹靼担┎?，從而使我們可以利用相差顯微鏡直接觀察活細(xì)胞或未染色的標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法 相差顯微鏡將相位差轉(zhuǎn)變振幅差，是利用了光的衍射和干涉現(xiàn)象。 光源射出的光線通過(guò)被檢物體時(shí)，如果是完全均質(zhì)透明的物體，光線將繼續(xù)沿直線前進(jìn)，稱為直射光；如果是

4、含有折射率略有不同的物體，一部分仍為相位和振幅相同的直射光，另一部分由于光的衍射現(xiàn)象則向周圍側(cè)方分散前進(jìn)，這種光稱為衍射光。衍射光速度比衍射光大約低1/4波長(zhǎng)。當(dāng)直射光和衍射光同時(shí)到達(dá)一點(diǎn)時(shí)，兩者相互干涉，形成合成波。合成波的大小取決于兩個(gè)光波的振幅和相差。如果振幅相等，相差為零，即波峰與波峰相遇，其合成波則有兩倍的振幅，產(chǎn)生的相長(zhǎng)干涉（同向量），最為明亮。若一個(gè)光的相位推遲，其合成波減小，光度漸暗，當(dāng)恰好推遲半個(gè)波長(zhǎng)（1/2）時(shí)，即波峰與波谷相遇，則兩個(gè)光波的振幅相互抵消，合成波發(fā)生相消干涉（異向量），則成為黑暗狀態(tài)。 在普通光學(xué)顯微鏡中，盡管光波通過(guò)被檢物體后也發(fā)生了衍射，直射光與衍射光也

5、發(fā)生了干涉而形成合成波，但因衍射的速度比直射光大約低1/4（而不是1/2或0）波長(zhǎng)，所以合成波的振幅與直射光的振幅相同，即被檢物體與背景間不能形成明暗反差，我們很難看到被檢物體。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法 若在直射光的通過(guò)點(diǎn)放置推年遲相位的物質(zhì)，將直射光推遲1/4波長(zhǎng)，使之與衍射光保持同一像相位，合成波等于直射波與衍射波振幅之合，振幅加大被檢物體亮度提高。若同時(shí)在直射光的通過(guò)點(diǎn)放置吸收光的物質(zhì)，則直射光的振幅減弱，致使僅由直射光照射的背底變暗，被檢物體的亮度相對(duì)年進(jìn)一步提高。 相反，若在大部分衍射光的通過(guò)面放置推遲相位的物質(zhì)，把衍射光推遲1/4波長(zhǎng)，兩者的相差變?yōu)?/2波長(zhǎng)，合成波的振幅

6、等于兩波的振幅差，這時(shí)，被檢物體亮度低于周圍介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法 下面介紹相差顯微鏡的構(gòu)造： 1. 環(huán)狀光闌： 由大小不同的環(huán)狀孔組成的光闌，與聚光器一起組成轉(zhuǎn)盤聚光器。外面標(biāo)有10 x，20 x，40 x，100 x字樣，相應(yīng)地與不同倍率的物鏡配合使用。環(huán)狀光闌的作用是將直射光所成的像與衍射光旁像分開。 2. 相板： 安裝在相差物鏡后焦面上。相板分為兩部分，即通過(guò)直射光的共軛面和通過(guò)衍射的補(bǔ)面。相板上鍍有吸收膜和相位膜，以推遲直射光（衍射光的相位）并吸收直射光（或衍射光），從而使亮度發(fā)生變化。 相板的種類很多，相差物鏡種類的也很多。 3. 合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡： 用以調(diào)整環(huán)狀光闌

7、所造成的像與相板共軛面完全吻合。相差顯微鏡在使用時(shí)，聚光鏡下面的環(huán)狀光闌的光環(huán)，應(yīng)與相差物鏡中的相位相互吻合，完全一致，否則，直射光和衍射光的光路紊亂，應(yīng)被吸收的光不能被吸收，相位該推遲的光波不能被推遲，失去相差顯微鏡的作用。由于環(huán)狀光闌的光環(huán)與物鏡相板的環(huán)孔甚小，為使二者相互對(duì)準(zhǔn)，完全重合，必須使用合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 1. 安裝好環(huán)狀光闌和相差物鏡。 2. 在明視野條件下對(duì)光，調(diào)焦。 3. 拔出目鏡，插入合軸望遠(yuǎn)鏡，用左手指固定其外筒，一邊看著望遠(yuǎn)鏡，一邊用右手轉(zhuǎn)動(dòng)內(nèi)筒升降，對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)叫能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板黑環(huán)，將望遠(yuǎn)鏡固定，升降聚光器并調(diào)節(jié)

8、其下的螺旋，使亮環(huán)的大小與黑環(huán)一致，再旋轉(zhuǎn)聚光器兩側(cè)的條調(diào)節(jié)鈕，使光環(huán)和黑環(huán)完全重合。 4. 拔出望遠(yuǎn)鏡，插入目鏡，即可觀察。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 在更換不同倍率相差物鏡和不同種類的相差板時(shí)，要重新合軸調(diào)中。使用油物鏡時(shí)，聚光器上透鏡表面與栽片之間要同時(shí)上鏡油。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法二、熒光顯微鏡 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 熒光是熒光物質(zhì)受光或其它射線時(shí)所發(fā)出的可見光，其特點(diǎn)是：吸收了能量即刻發(fā)光，光或其它射線停止照射時(shí)也叫立即停止發(fā)光。 熒光分為兩種：自發(fā)性熒光和繼發(fā)性熒光。自發(fā)性熒光指動(dòng)植物組織和細(xì)胞內(nèi)的某些成分經(jīng)短波照射后發(fā)出的微弱熒光；繼發(fā)性熒光

9、指某些細(xì)胞成分與熒光染料結(jié)合而在照射后呈現(xiàn)出的熒光。熒光染料的種類很多，并且對(duì)年各種被檢物體表現(xiàn)出不同的親和性。 熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)濾色系統(tǒng)，發(fā)出一定波長(zhǎng)的光（紫蘭光42mm或紫外光365mm）做為激發(fā)光，激發(fā)標(biāo)本的熒光物質(zhì)使其發(fā)出熒光，再經(jīng)過(guò)物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。 熒光顯微術(shù)是生物，醫(yī)學(xué)中的重要研究手段，可以研究細(xì)胞內(nèi)的自發(fā)熒光物質(zhì)，更重要的是可以研究不同熒光探針標(biāo)記后的細(xì)胞及其化學(xué)成分。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法 下面介紹熒光顯微鏡的構(gòu)造： 1. 熒光光源：一般用超高壓汞燈，它的紫外和紫蘭部分有很強(qiáng)的發(fā)射。 2. 濾色系統(tǒng)：由激發(fā)濾光片和吸收濾光片組成。

10、 3. 激發(fā)濾光片：提供一定波長(zhǎng)的激發(fā)光。激發(fā)光的波長(zhǎng)根據(jù)備激發(fā)的熒光物質(zhì)而定。 4. 吸收濾光片：把不需要的激發(fā)光吸收掉而只讓所需要的熒光通過(guò)，同時(shí)也保護(hù)眼睛不受激發(fā)光的影響。吸收濾光片必須與激發(fā)濾光片配合使用。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 1. 制備標(biāo)本：取蛙血作血涂片，注意涂片時(shí)使血滴位于兩片栽片的夾角中，移動(dòng)上面的栽片時(shí)，代動(dòng)血液前進(jìn)，而不能推進(jìn)血滴。將涂片浸入甲醇中固定5min，然后再轉(zhuǎn)入1/1000丫啶橙 （熒光染料）水溶液中染色35min，水沖洗，干燥。 2. 打開熒光顯微鏡燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮。注意：超高壓汞燈不能反復(fù)開關(guān)，點(diǎn)燃15min

11、后才能關(guān)；關(guān)閉5min后才能開。汞燈開時(shí)，不能開室內(nèi)照明燈。 3鏡檢標(biāo)本，可見紅細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)橙色熒光，胞漿暗綠色，有時(shí)可見細(xì)胞核呈不規(guī)則的白細(xì)胞。注意：標(biāo)本照射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)發(fā)生熒光減弱現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法三、暗視野顯微鏡 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 暗視野顯微鏡是以丁達(dá)爾現(xiàn)象（即光的微粒散射現(xiàn)象）為基礎(chǔ)，利用特殊的聚光器（如拋物面聚光器）進(jìn)行斜射照明，它不讓光柱自下面而上地通過(guò)標(biāo)本，不讓強(qiáng)度很大的光線直接進(jìn)入物鏡，到達(dá)觀察者的眼睛。因此，我們?cè)诎狄曇爸兴吹降募炔皇钦彰鞯墓饩€，也不是標(biāo)本本身，而是備檢物體的衍射光圖象。 由于以上原因，暗視野顯微鏡只能看到物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能辯清

12、物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。但普通光鏡的最大分辨率僅為0. 2m，而在暗視野顯微鏡下，盡管看不清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)的，卻可以分辯小至0. 004m，據(jù)此我們可以說(shuō)暗視野顯微鏡的分辨率高于普通光鏡。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法 下面介紹暗視野顯微鏡的構(gòu)造： 暗視野顯微鏡與普通光鏡相比，在構(gòu)造上的差別就在于用暗視野聚光器代替普通聚光器，并且所用的物鏡的鏡口率一般小于0. 85，這樣使照明的線不進(jìn)入物鏡，造成暗視野。 暗視野聚光器的種類很多，常見的為拋物面聚光器，這種聚光器的下面設(shè)有中央遮光板，以遮掉光源中部的光柱，只讓邊緣的筒狀光柱通過(guò)，拋物面使筒狀光束改變行走方向，呈斜射途徑前進(jìn)，會(huì)聚于標(biāo)本的位置上，但不進(jìn)

13、入物鏡，而標(biāo)本散射出來(lái)的光進(jìn)入物鏡。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法 1. 安裝暗視野聚光器，并選用強(qiáng)光源。 2. 在聚光器和載玻片之間滴加香柏油，目的是防止照明光線于聚光鏡上面進(jìn)行全反射，達(dá)不到被檢物體，從而得不到暗視野照明。 3. 調(diào)節(jié)聚光器的焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)被檢物。首先調(diào)節(jié)聚光器的中心，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴(yán)格地在一條線上，然后操縱聚光器調(diào)節(jié)螺旋，使其升降，把焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)被檢物體，以圓錐形光束頂點(diǎn)照射物體。 4. 示范觀察：示范觀察變形蟲裝片及葉片柵欄細(xì)胞裝片。暗視野顯微鏡在下觀察活的動(dòng)植物細(xì)胞，看不清內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)，只能觀察到細(xì)胞，細(xì)胞器的輪功廓。尤如黑夜里看星星，在黑暗的背景里看到細(xì)胞所

14、反射或衍射的光線形成的像。變形蟲細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)及柵欄細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)的流動(dòng)均可看到。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟人血涂片細(xì)胞觀察 分別用低倍鏡和高倍鏡觀察血細(xì)胞的形態(tài)。洋蔥根尖切片細(xì)胞的觀察 先用低倍鏡觀察，尋找細(xì)胞形狀規(guī)則、形態(tài)清晰的區(qū)域，換高倍鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。馬蛔蟲受精卵切片中心體的觀察實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法作業(yè)作業(yè)為什么使用高倍鏡和油鏡時(shí)，必須從低倍鏡開始？顯微鏡下看到的物像是正像還是反像？物像與玻片的移動(dòng)方向是否一致？為什么？簡(jiǎn)述使用顯微鏡的注意事項(xiàng)。繪制你所看見的各種細(xì)胞和細(xì)胞器，并標(biāo)示出各部分（注意：細(xì)胞器外形特點(diǎn)、大小、分部、位置、數(shù)目）。實(shí)驗(yàn)二顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法 1. 相差顯微鏡有哪些特有的附件？其構(gòu)造如何？ 2. 為什么相差顯微鏡可以直接觀察活體樣本？ 3. 簡(jiǎn)述相差顯微鏡，熒光顯