11.環(huán)境微生物檢測(cè)(精)

1、第章環(huán)境微生物檢測(cè)11.111.1 空氣中微生物的檢測(cè)與控制11.1.111.1.1 空氣中微生物的檢測(cè)方法(1)(1)撞擊法撞擊法是采用撞擊式空氣微生物采 樣器，通過抽氣動(dòng)力作用，使空氣通過狹 縫或小孔而產(chǎn)生高速氣流，使懸浮在空氣 中的帶菌輪子撞擊到轉(zhuǎn)動(dòng)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng) 基平皿上。經(jīng) 3737C C、48h48h 培養(yǎng)，計(jì)算出每 立方米空氣中所含的細(xì)菌菌落數(shù)。后計(jì)生長的細(xì)菌菌落數(shù)。 (2)(2)自然沉降法自然沉降法是靠重力的作用將空氣中 攜帶微生物的懸浮顆粒沉陷到直徑 9cm9cm 的 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上，經(jīng) 3737C,C, 48h48h 培養(yǎng)III由于沉降法是被動(dòng)采樣，會(huì)造成很大的誤差。

2、通過前蘇聯(lián)奧梅梁斯基公式換算出。通常設(shè)置 5 5 個(gè)釆樣點(diǎn)，即室內(nèi)墻角對(duì)角 線交點(diǎn)為 1 1 個(gè)采樣點(diǎn)，該交點(diǎn)與四墻角連續(xù) 的中點(diǎn)為另外 4 4 個(gè)采樣點(diǎn)。釆樣高度為 1 1 2 21 1 5m5m。釆樣點(diǎn)心遠(yuǎn)離墻壁 1m1m 以上，并避開空調(diào)、門窗等空氣流通處。檢測(cè)點(diǎn) 數(shù)越多越準(zhǔn)確，以 20203030 個(gè)測(cè)點(diǎn)數(shù)為宜， 最少測(cè)點(diǎn)數(shù)為c=1000由于沉降法是被動(dòng)采樣，會(huì)造成很大的誤差。5 56 6。(3)(3)過濾法過濾法是在負(fù)壓下抽濾空氣，使空氣 通過經(jīng)滅菌的微孔濾膜，空氣中細(xì)菌被截 留在膜上，然后將膜轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上，使 濾膜與培養(yǎng)基完全貼緊，倒置于 3737C C恒溫 箱培養(yǎng) 24h24h

3、。通過計(jì)平板上的菌落數(shù)，測(cè)定 空氣中細(xì)菌的數(shù)量。空氣中微生物總數(shù)目前用 CFUCFU / / m3,m3, 計(jì)量。即每立方米空氣落下的細(xì)菌數(shù)， 一 般以室內(nèi)空氣中細(xì)菌總數(shù) 500-1000500-1000 CFUCFU / / m3m3 以作為空氣污染指標(biāo)。11.1.2空氣微生物污染的控制控制空氣微生物污染，必須減少空氣中微生物的來源，特別是微生物污染嚴(yán)重 的醫(yī)院，肉類加工等行業(yè)廢水廢物的處理 消毒工作； 搞好室內(nèi)外環(huán)境衛(wèi)生。減少微 生物滋生；綠化造林也是凈化市氣、除塵、殺菌和吸收有害氣體的重要途徑；另外空氣消毒和空氣凈化器對(duì)凈化空氣也起一定 的作用。日木建議的評(píng)價(jià)空氣清潔程度的標(biāo)淮見表* 1

4、1-1以細(xì)苗總釵評(píng)價(jià)空氣的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，（個(gè)/mJ清沽程度細(xì)葡總數(shù)清潔辱度細(xì)fWXltt 1清沽稅度細(xì)曲總數(shù)最清詢的夸4V?？诊暎?-2秤通空代31 125輕300清活空氣30臨界環(huán)境30111.2水的微生物檢測(cè)及控制11.2J水質(zhì)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB5749-85GB5749-85 關(guān)于飲用細(xì)菌總?cè)?0個(gè)加M2 大腸菌群密3個(gè)/L一、傷病癥：傷寒或副傷寒。表現(xiàn)：持續(xù)發(fā)燒，牽涉到淋巴組織， 脾臟腫大,軀干上出現(xiàn)紅斑， 胃腸壁潰瀉。傷寒沙門氏菌二.痢疾桿菌三、霍亂弧菌型的病例中，除腹瀉 外，癥狀還包括嘔吐、蠶聽病例中在較嚴(yán)重或較典痢疾桿菌可引起 細(xì)菌性痢疾（與阿 米巴痢疾不同）， 癥狀

5、為急性腹瀉, 通常大便中有血 及粘液，某些病 例中有發(fā)燒。病癥:“米湯樣”大便.腹 疼和昏迷等。病程短, 嚴(yán)重的常常在癥狀出 現(xiàn)后 12h12h 內(nèi)死亡。電鏡照片使用的是結(jié)晶紫 單染色，若革蘭氏染色則 為陰性紅色四、寄生蟲真菌一般通過接觸傳染，不通過水傳播，引起疾病的原生動(dòng)物和小型后生動(dòng)物也由水傳播，通常 稱為寄生蟲。在目前發(fā)現(xiàn)的幾千種原生動(dòng)物中只有能引起人類疾病傳播方式：除了飲水不衛(wèi)生外，更多的是通過食物以及 昆蟲血液傳播如瘧疾是蚊子傳播，食用生肉感染肉類寄生蟲等大腸菌群是人腸道中正常的寄生菌， 是一群需氧和兼性厭氧的，能在 3737C,C, 24h24h 內(nèi)使乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無芽

6、抱 桿菌，又稱總大腸菌群。大腸菌群作為水體被糞便污染的指標(biāo)， 也是飲水、食品等的細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢驗(yàn)指標(biāo) 之一，通常用“大腸菌群指數(shù)”和“大腸 菌群值”表示。11-2.2大腸菌群這些寄生菌通常與人體構(gòu)成互利共生關(guān)系， 當(dāng)人體免疫力下降時(shí)，他們則有可能成為引起腸 炎的致病菌，他們中的個(gè)別變種還會(huì)變?yōu)闃O具毒 性的病菌。如大腸埃希氏菌可引起幼兒腹瀉，引起美國 和日本傳染病流行的 61576157 也是大腸埃希氏菌的 變種菌株。中國水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的大腸菌群數(shù)（個(gè)/ L L）W3W3W W 100100W W 500500W W 1000010000W W 5000050000飲用水 游泳池水 地表水第一級(jí)第

7、二級(jí)第三級(jí)11.2.2.1大腸菌群檢測(cè)的目的和原理（一）生理習(xí)性與腸道病原菌類似時(shí)間基本一致 （代表性）（二）在糞便中的數(shù)量較多；（比病原菌多，不會(huì)漏 檢）（三股驗(yàn)技術(shù)較簡(jiǎn)單；（操作方便）常用的大腸菌群的檢測(cè)方法有多管發(fā)酵法與膜濾法。多管發(fā)酵法（即量大可能數(shù)法 MPNMPN ）發(fā)酵法是大腸菌群測(cè)定的國家標(biāo)準(zhǔn)方法。分為二步O11-2.2.2大腸菌群的檢測(cè)方法 A.A.初發(fā)酵目的：水中大腸菌群存在與否的初步判斷各100ml各lOinl方法為將水樣置于糖類液 體培養(yǎng)基中，在一定溫度 下.經(jīng)一定時(shí)間培養(yǎng)后. 觀察有無酸和氣體產(chǎn)生. 即有無發(fā)酵.而初步確定 有無大腸菌群存在。如采 用含有葡萄糖或甘露醇的

8、 培養(yǎng)基，則包括副大腸桿 菌；如不考慮副大腸桿菌, 則用乳糖培養(yǎng)基由于水 中除大腸菌群外.還可能 存在其它發(fā)酵糖類物質(zhì)的試驗(yàn)中的培養(yǎng)基中加入了酸堿指示劑紫色的漠甲酚紫， 產(chǎn)酸時(shí)，同時(shí)培養(yǎng)基中口朝下放置了裝滿同樣培養(yǎng)基的小試管，產(chǎn)氣時(shí)小試管中會(huì)封閉一段氣體， 被作為培養(yǎng)中是否產(chǎn)氣的依據(jù)。24小時(shí)48小時(shí)aifi r r-748小時(shí)內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn) r不產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)酸不產(chǎn)氣0J進(jìn)行下兩階段的檢驗(yàn)陰性無人腸菌水中含有大腸苗群， 還需 根據(jù)這類細(xì)菌的其它特性細(xì)菌，所以培養(yǎng)后如發(fā)現(xiàn) 氣體和酸并不一定能肯定48小時(shí)貝的：鑒定產(chǎn)酸產(chǎn)代茵的染色特征.好氣與否. 芽抱特征。根據(jù)：人腸菌群在固體培養(yǎng)基上可以在空氣

9、生 長，革蘭氏染色呈陰性和不生勞鞄的特性在此階段.先將上一試驗(yàn)產(chǎn)酸的菌種移植于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（遠(yuǎn)藤氏培 養(yǎng)基） 或伊紅美藍(lán)培 養(yǎng)基表面 （劃線接種是為了分離出單菌落，防治菌落不 純干擾結(jié)果） ，這 一步氧氣可以阻止 厭氧芽抱桿菌的生 長，而上述培養(yǎng)基所含染料物質(zhì)也有抑制許多其它細(xì)菌生長的作用。結(jié)論：無大腸菌群遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基 劃線分離單菌落特征菌落X陰性結(jié)論:復(fù)發(fā)酵C.C.復(fù)發(fā)酵目的*IHE陰件反應(yīng)X袞表計(jì)數(shù)結(jié)論：無大腸菌群膜濾法使用的濾膜是孔徑為0.450.65p m的微孔濾膜；轉(zhuǎn)移至伊紅美蘭 平板上。379培養(yǎng)24小時(shí)陽性反應(yīng) 7nan處展轉(zhuǎn)住及絡(luò)檸細(xì)果料可疑的菌落再移植于糖類培養(yǎng)基中，平

10、板價(jià)冉 觀察其是否發(fā)酵，是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣，最菌幺笄黑墊傳 后肯定有無大腸菌群存在。圉潘牛-5 巴對(duì)于自來水廠出水，初步發(fā)酵試驗(yàn)一 般都在10個(gè)小發(fā)酵管和2個(gè)大發(fā)酵管 （或發(fā)酵瓶）內(nèi)進(jìn)行，復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)則在 小發(fā)酵管內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)肯定有大腸菌群存在的初步發(fā)酵 試驗(yàn)的發(fā)酵管或瓶的數(shù)目及試驗(yàn)所用 的水樣量，即可利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)原理， 査表得出結(jié)果。11.2.311.2.3 水微生物污染的控制控制水體微生物的污染首先必須從源頭 做起，即控制排放廢水， 尤其是醫(yī)院廢水 等微生物的含量，避免大量有害微生物進(jìn)入 水體；其次，消除微生物茲生的環(huán)境。凈化水 體，對(duì)地表水、游泳池水要進(jìn)行定期檢測(cè)， 必要時(shí)加入消毒劑以殺滅微生物

11、。發(fā)光細(xì)菌法是 2020 世紀(jì) 7070 年代后期提出的 一種微生物檢測(cè)環(huán)境水質(zhì)毒性的新方法。 發(fā)光細(xì)菌法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、精度高， 凡有毒化合物、廢水、廢物的生物毒性均 可測(cè)定。發(fā)光細(xì)菌法已被中國國家環(huán)境保護(hù)總局 規(guī)定為測(cè)定水環(huán)境急性毒性的國家標(biāo)準(zhǔn)。11.3發(fā)光細(xì)菌的微毒檢測(cè)11.3.111.3.1 發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)的原理細(xì)菌的發(fā)光過積是菌體內(nèi)一種新陳代謝的生理過程。菌體含有熒光素、熒光酶、ATPATP 等發(fā)光要 素，在有氧條件下通過細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)而產(chǎn)生微弱熒光。毒物濃度與菌體發(fā)光強(qiáng)度呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系,發(fā)光細(xì)菌法就是利用靈敏的光電測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定毒物對(duì)細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制程度進(jìn)而反映環(huán)境中毒物毒性大小

12、，用發(fā)光度表征毒物所在環(huán)境的急性毒件。圖11-3 DXY 2乞牛物發(fā)光光度計(jì)測(cè)試系統(tǒng)1發(fā)光細(xì)2a 3456-光閘】；一龍子；“ 一光電誓，9不透尤外允,IO-電夕設(shè)備：11發(fā)尢水12敗iUft：13擬記錄位目前國內(nèi)外發(fā)光細(xì)菌的測(cè)定常用的有兩種方法。新鮮發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)測(cè)定法即將發(fā)光菌接種于液體培養(yǎng)基中，在適當(dāng)條件下（2020 土 0 0 5 5）C C 振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長期，配制含3%NaC3%NaCI I鹽度的適當(dāng)濃度的菌懸液加入測(cè)試管中，再加入待測(cè)液， 使之與菌液接觸，作用 5 515min15min后，讀出并記錄對(duì)照管和樣品管發(fā)光強(qiáng)度。此法 操作較為簡(jiǎn)便。2冷凍干燥發(fā)光細(xì)菌制劑測(cè)定法即把培養(yǎng)

13、到對(duì)數(shù)生長期的發(fā)光細(xì)菌， 以冷凍干燥法制成干粉劑，使用時(shí)加入冷 的 2%NaCI2%NaCI 溶液復(fù)蘇，使其恢復(fù)到原來的生 理狀態(tài)和發(fā)光水平，然后用于測(cè)定。這是 國家標(biāo)準(zhǔn)方法，其優(yōu)點(diǎn)是可實(shí)行測(cè)定的質(zhì) 量控制。凍干粉可長期保藏方便使11.3.211.3.2 發(fā)光細(xì)菌法檢測(cè)的操作C-用，操 作簡(jiǎn)便，節(jié)約時(shí)間。11.3.311.3.3 發(fā)光細(xì)菌法的應(yīng)用1在水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用2在工業(yè)廢水、固體廢物、廢氣的急性毒性檢測(cè)中的應(yīng)用3對(duì)重金屬急性毒性效應(yīng)的測(cè)定和評(píng)價(jià)4對(duì)化學(xué)品的毒性評(píng)價(jià)和安全性評(píng)價(jià)11.411.4 污染物致突變性檢測(cè)(Ames)(Ames)試驗(yàn)該試驗(yàn)是通過測(cè)定有污染物存在時(shí)鼠傷寒沙門菌(Salm

14、onella typhimurium)的組 氨酸營養(yǎng)缺陷型(his(his )菌株發(fā)生回復(fù)突變的概率來判斷污染物的致癌、致突變效應(yīng)。 其陽性結(jié)果與致癌物吻合率高達(dá) 83%83%。列為評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)安全性的首選力法。11.4.1 Ames試驗(yàn)的原理和方法鼠傷寒沙門菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，在 不含組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長。但當(dāng)受到致突 變物作用后， 大量細(xì)胞在遺傳物質(zhì)的特定座位發(fā) 生基因回復(fù)突變而成為野生型，能自行合成組氨 酸，此時(shí)培養(yǎng)物中雖不含組氨酸。組氨酸缺陷型 4 株亦能生長并形成菌落。AmesAmes 試驗(yàn)就是通道在培養(yǎng)物中加入待測(cè)物, 根據(jù)不含組氨酸的培養(yǎng)基上組氨酸營養(yǎng)缺陷型茵 株長出回

15、復(fù)突變菌落數(shù)目的多少判斷待測(cè)物的致 突變性。(1)(1)試驗(yàn)菌株 釆用鼠傷寒沙門菌變異株 TA97,TA97, TATA 98,98,TAI00,TAI00, TAI02TAI02 四種菌種，又增加了TA1535,TA1535, TA1537,TA1537, TA1538TA1538 共七株。試劑牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基1000mL.pH7.21000mL.pH7.2 7 7 4 4S9mixS9mix大鼠肝勻漿 S9S9 與 NADPNADP、 G G 6 6 P P、 KCIKCI、 NaNa2 2HPO4HPO4、KHKH2 2POPO4 4和水配成混合液。在試驗(yàn)之前都要進(jìn)行全面的生物學(xué)特性和

16、敏感性鑒定，符合要求才能使用。脂多糖屏障丟失判定是否是缺陷型牛肉蛋白(3)(3)菌種鑒定R R 因子判斷菌體是否存在或失去了某種 抗藥性質(zhì)粒。紫外線損傷修復(fù)缺陷自發(fā)回變6組氨酸營養(yǎng)缺陷型 (4)(4)操作方法AmeAmes s 試驗(yàn)的典型操作方法有平板摻入 試驗(yàn)和斑點(diǎn)試驗(yàn)兩種。11.4.2 Ames試驗(yàn)的應(yīng)用1檢測(cè)食品添加劑、化妝品等的致突變性， 由此推測(cè)其致癌性。2檢測(cè)水源水和飲用水的致突變性，探索較 現(xiàn)行方法更加衛(wèi)生安全的消毒措施。3檢測(cè)城市污水和工業(yè)廢水的致突變性，結(jié) 合化學(xué)分析，追蹤污染源，為研究防治對(duì) 策提供依據(jù)。5回變?cè)\斷4檢測(cè)土壤、污泥、工業(yè)廢物堆肥、廢物灰燼的致 突變性。以防止

17、維系生命的土壤受致突變物污染 后，再通過農(nóng)作物危害人類。5檢測(cè)氣態(tài)污染物的致突變性，防止污染物經(jīng)出大 氣，通道呼吸對(duì)人體發(fā)生潛在危害。6研究化合物結(jié)構(gòu)與致突變性的關(guān)系。為合成對(duì)環(huán)境無潛在危害的新化合物提供型論依據(jù)O7檢測(cè)農(nóng)藥在微生物降解前后的致突變性, 了解農(nóng)藥在施用后代謝過程中對(duì)人類有無 隱患。8篩選抗突變物，研究開發(fā)新的抗痛藥。抗誘變因素在抗癌作用上至關(guān)重要、隨著遺傳毒理學(xué)的發(fā)展，通過篩選已發(fā)現(xiàn)天然食物如蔬菜類、茶葉、中草藥等都員有抗誘 變作用。11.5生物傳感器11-5.111-5.1 生物傳感器的定義與分類傳感器是能感受特定的被測(cè)量的物質(zhì)并按照一定規(guī)律將其轉(zhuǎn)換成可用信號(hào)的器 件或裝置。

18、生物傳感器是用固定化生物成分或生 物體作為敏感元件的傳感器。生物傳感器的分類主要有三種方式。1根據(jù)生物傳感器中分子識(shí)別元件即敏感元 件可分為五類：酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器?細(xì)胞傳感器、組織傳感器和免疫傳感器。2根據(jù)生物傳感器的換能器即信號(hào)轉(zhuǎn)換器分 類有：生物電極傳感器、半導(dǎo)體生物傳感 器、光生物傳感器、熱生物傳感器、壓電 晶體生物傳感器等。3以被測(cè)目標(biāo)與分子識(shí)別元件的相互作用方式進(jìn)行分類有：生物親和型生物傳感器和代謝型或催化型生物傳感器 O O三種分類方法之間互相交義，相互滲 透。11.5.211.5.2 生物傳感器基本結(jié)構(gòu)和工作原理生物傳感器通常由敏感元件（生物分子）、轉(zhuǎn)換元件及相應(yīng)的機(jī)械結(jié)構(gòu)和電子線路所 組成，它以生物分子所發(fā)生的物理或化學(xué) 變化轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電信號(hào)予以放大輸出, 從而得到檢測(cè)結(jié)果。力子識(shí)別!測(cè)定對(duì)象敏感元件圖U-7土物傳感器示意生物傳感器的工作原理主要有以下幾 種：(1)(1)將化學(xué)變化轉(zhuǎn)變成電信號(hào)(2)(2)將熱變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)(3)(3)將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)(4)(4)直接產(chǎn)生電信號(hào)方式其他物質(zhì)信號(hào)變換物理變化化學(xué)變化換能器電信號(hào)11.5.311.5.3 生物傳感器在環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用 (1)BOD(1)BOD 生物傳感器應(yīng)用 BOD