水稻類病斑突變體lmm4的鑒定及其基因定位

1、水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位邱結(jié)華馬寧,蔣漢偉,圣忠華邵高能唐紹清魏祥進(jìn),胡培松,(中國(guó)水稻研究所/農(nóng)業(yè)部水稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州;杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,杭州;通訊聯(lián)系人,Email:weixiangjincaascn;hupeisongcaascn)IdentificationandGeneMappingofaLesionMimicMutantlmminRiceQIUJiehua,MANing,JIANGHanwei,SHENGZhonghua,SHAOGaoneng,TANGShaoqing,WEIXiangjin,HUPeiso

2、ng,(StateKeyLaboratoryofRiceBiology,KeyLaboratoryofRiceBiologyandBreedingofMinistryofAgriculture,ChinaNationalRiceResearchInstitute,Hangzhou,China;CollegeofLifeandEnvironmentalSciences,HangzhouNormalUniversity,Hangzhou,China;Correspondingauthor,Email:weixiangjincaascn;hupeisongcaascn)QIUJiehua,MANin

3、g,JIANGHanwei,etalIdentificationandgenemappingofalesionmimicmutantlmminriceChinJRiceSci,():Abstract:ThelesionmimicmutantlmmwasidentifiedfromanEMSinducedNipponbaremutantlibraryBrownlesionswerefirstobservedonthetipoflmmleavesattheinitialtilleringstage,andspreadedgraduallydownwardtothewholeleafbladeand

4、eventheleafsheathComparedwiththewildtype,thechlorophyllandthenetphotosyntheticrateoflmmweresignificantlyreducedTheplantheight,paniclelength,seedsettingrate,grainweightwerealsodecreasedsignificantlyTheshadingassayshowedthatthelesionsonlmmleaveswereinducedbynaturallightThehistologicalstainingassayindi

5、catedthatthelesionsonlmmleaveswerecausedbyprogrammedcelldeathandhydrogenperoxideaccumulatedinlmmleavesThelmmdisplayedhigherresistancetoblastraceCandGwhencomparedwiththewildtypeInaddition,pathogenesisrelatedgenePOC,PAL,PBZ,PRwerefoundtobeupregulatedinlmmGeneticanalysissuggestedthatthephenotypeoflmmwa

6、scontrolledbyasinglerecessivenuclearlocusBasedamapbasedcloningstrategy,thelmmwasnarroweddowntoakbregionbetweenIndandIndnearthecentromereofchromosomeKeywords:lesionmimicmutant;blastresistance;genemapping;rice邱結(jié)華,馬寧,蔣漢偉,等水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位中國(guó)水稻科學(xué),():摘要:在EMS誘變的日本晴突變體庫(kù)中,篩選到一個(gè)類病斑突變體.該突變體類病斑出現(xiàn)于分蘗始期,而后慢慢擴(kuò)

7、散至葉鞘、莖稈,最后至整個(gè)植株,屬于擴(kuò)散型類病斑突變體.相比野生型,突變體的lmm的株高明顯降低,有效穗數(shù)減少,穗長(zhǎng)縮短,結(jié)實(shí)率、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重均顯著降低.遮光處理實(shí)驗(yàn)表明,突變體lmm類病斑的產(chǎn)生受自然光誘導(dǎo).突變體lmm的光合色素含量和凈光合速率明顯低于野生型.電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變體類病斑部位葉肉細(xì)胞中的葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育異常.臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)表明突變體類病斑部有大量的死亡細(xì)胞.二氨基聯(lián)苯胺染色實(shí)驗(yàn)表明類病斑部位有過氧化氫沉積.稻瘟病抗性鑒定結(jié)果表明,與野生型相比,突變體lmm對(duì)C和G等稻瘟病菌生理小種的抗性明顯增強(qiáng).實(shí)時(shí)PCR分析證明在突變體lmm中防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因POC、PAL、PBZ

8、、PR的表達(dá)量顯著提高.遺傳分析表明突變體表型符合單隱性核基因控制的遺傳規(guī)律.lmm定位在第染色體著絲粒附近Ind和Ind之間大約kb的區(qū)域內(nèi).關(guān)鍵詞:類病斑突變體;稻瘟病抗性;基因定位;水稻中圖分類號(hào):Q;Q;S文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):()植物類病變(lesionmimicmutant)突變體是指在無明顯逆境或病原物侵染時(shí),植物葉片或葉鞘上自發(fā)形成大小、形狀和顏色各異的斑點(diǎn)的一類突變體.又因?yàn)槎鄶?shù)類病變突變體形成的斑點(diǎn)與無毒病原物浸染時(shí)產(chǎn)生的病斑類似,并且大多數(shù)斑點(diǎn)的顏色為褐色,也常被稱之為類病斑(lesionsimulatingdisease)突變體.類病斑突變體的表型多與病原菌侵染后的超

9、敏反應(yīng)(hypersensitiveresponse,HR)癥狀類似,而且許多類病變突變體對(duì)某些植物病原物表現(xiàn)出了一定的抗性.因此,對(duì)這類突收稿日期:;修改稿收到日期:.基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(,);國(guó)家計(jì)劃資助項(xiàng)目(AAA,AA).中國(guó)水稻科學(xué)(ChinJRiceSci),():http:/wwwricescicnDOI:/jissn變體的研究可以為水稻抗病防御體系和細(xì)胞程序性死亡機(jī)制的研究提供借鑒,同時(shí)可以為水稻抗性育種提供有用的種質(zhì)資源.水稻類病斑突變體的研究已有大量報(bào)道,到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)類病斑突變體.其中,絕大部分呈單隱性核基因遺傳規(guī)律,少部分表現(xiàn)為雙隱性核基因或

10、顯性核基因遺傳規(guī)律,但被克隆的類病斑基因卻為數(shù)不多.在水稻中第一個(gè)被克隆的類病斑基因是SPL,該基因編碼一個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子,spl突變體在該基因非常保守的DNA結(jié)合域發(fā)生突變,從而導(dǎo)致其斑點(diǎn)葉表型的發(fā)生.隨后不同研究者利用圖位克隆、同源基因克隆、TDNA序列標(biāo)簽等方法克隆與分離了Spl、Spl、Spl、OsLSD、OsPtia、OsNPR、OsSSI、OsACDR、RLIN、RLS等多個(gè)水稻類病斑性狀相關(guān)基因.這些已經(jīng)克隆基因的突變體表現(xiàn)出不同類型、不同程度的類病斑表型,部分突變體還表現(xiàn)出比其野生型更好的稻瘟病、白葉枯病抗性.如水稻類病斑突變體lsd對(duì)毒性稻瘟病菌小種的抗性明顯增強(qiáng);而水稻突變體

11、npr和acdr對(duì)白葉枯病的抗性提高,.水稻類病斑突變體spl、spl、ttm、spl和ssi同時(shí)對(duì)稻瘟病和白葉枯病產(chǎn)生抗性.同時(shí),類病斑基因大多直接調(diào)控或間接影響水稻的防衛(wèi)反應(yīng)與細(xì)胞程序性死亡過程.類病斑基因的克隆與功能研究表明類病變過程非常復(fù)雜,涉及到許多生化代謝過程.因此,挖掘更多的類病斑突變體,克隆更多的相關(guān)基因,并開展詳細(xì)的功能研究,有助于全面了解類病變發(fā)生機(jī)制,同時(shí)為研究水稻細(xì)胞程序性死亡和抗病機(jī)制提供借鑒.本研究以粳稻品種日本晴EMS誘變產(chǎn)生的一個(gè)穩(wěn)定遺傳的類病斑突變體lmm為材料,詳細(xì)描述了該突變體的形態(tài)學(xué)特征、生理學(xué)特性,并對(duì)該突變基因進(jìn)行了精細(xì)定位,以期為該基因的克隆、功能

12、研究及應(yīng)用提供理論依據(jù).材料與方法實(shí)驗(yàn)材料從日本晴EMS誘變突變體庫(kù)中篩選到一個(gè)類病斑突變體lmm,經(jīng)多代自交后類病斑性狀在海南和杭州都能穩(wěn)定遺傳.以lmm與秈稻品種南京和培矮雜交衍生的F及F群體對(duì)lmm進(jìn)行遺傳分析,利用lmm與南京、培矮衍生的F群體對(duì)突變體基因進(jìn)行分子定位.所有材料均于正季種植于中國(guó)水稻研究所富陽試驗(yàn)基地,田間管理同大田生產(chǎn).遮光處理在大田自然條件下,用寬度約cm的錫箔紙對(duì)突變體lmm分蘗時(shí)期的葉片進(jìn)行包裹遮光,分別對(duì)未發(fā)和已發(fā)生類病斑的葉片遮光一周;然后對(duì)遮光處揭掉錫箔紙恢復(fù)光照,跟蹤觀察類病斑變化.葉綠素含量的測(cè)定分別取大田自然條件下突變體lmm及其野生型分蘗期、抽穗期

13、和成熟期的葉片進(jìn)行葉綠素含量測(cè)定.將g待測(cè)樣品剪成mm的小片浸泡于mL乙醇,黑暗條件下放置于的冰箱中,浸提h左右.利用分光光度計(jì)測(cè)量乙醇溶液的吸光值,每組取份樣品,每份樣品重復(fù)測(cè)量次.按Lichtenthaler等修正的Arnon法計(jì)算葉片葉綠素含量.光合作用相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定使用Li型便攜式光合測(cè)定儀,于始穗期晴天上午:分別測(cè)定突變體lmm及其野生型葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO濃度(Ci).突變體和野生型各測(cè)定片具代表性的劍葉,光合測(cè)定儀使用紅藍(lán)光源,光量子密度mol/(ms),流速mol/s.葉綠體結(jié)構(gòu)電鏡觀察分別取分蘗期野生型正常葉片與突變體lmm發(fā)

14、生類病斑葉片,置于戊二醛固定液中,抽真空使固定液完全滲入葉片中,電鏡樣品制備參照呂典華等的方法,樣品制備好后利用HITACHI型透射電子顯微鏡對(duì)葉肉細(xì)胞中葉綠體的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察.葉片死亡細(xì)胞檢測(cè)參照Yin等的方法分別取分蘗期有類病斑表型的突變?nèi)~片以及相應(yīng)位置的野生型正常葉片用臺(tái)盼藍(lán)染色,使用體視鏡(LeicaDM)觀察突變體和野生型葉片中染色情況并拍照.葉片HO沉積檢測(cè)參照ThordalChristensen等的方法檢測(cè)突變體葉片中是否有HO的積累.中國(guó)水稻科學(xué)(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)突變體抗性鑒定為了了解類病斑突變體lmm對(duì)稻瘟病的抗性,將lmm和野生型品種浸種、催芽后

15、,按順序分別播種在××的有孔、裝有細(xì)土的塑料盤中,每盆播個(gè),每個(gè)供試品種播粒粒,設(shè)個(gè)重復(fù),接種前d施氮肥,保持嫩綠;在秧苗葉期接種;選擇A、A等致病性較強(qiáng)和致病頻率較高個(gè)菌株對(duì)lmm及其野生型秧苗噴霧接種,病菌濃度約為×個(gè)孢子/mL.接種量以所有葉片上布滿孢子液為限,覆蓋黑色濕布保濕h,然后取出,定時(shí)噴霧保濕.d后當(dāng)感病對(duì)照品種麗江新團(tuán)黑谷病級(jí)達(dá)級(jí)以上時(shí)進(jìn)行調(diào)查.基因定位從突變體lmm與南京衍生F群體中首先挑選出株表型為類病斑的分離單株用于lmm的連鎖分析.利用本實(shí)驗(yàn)室均勻分布于條染色體的對(duì)公共引物對(duì)親本進(jìn)行篩多態(tài)分析,所用引物來自Matsumoto等采用的公共序

16、列.初步確定目標(biāo)基因所在的染色體位置.然后在與目標(biāo)基因連鎖標(biāo)記附近進(jìn)一步開發(fā)了對(duì)存在多態(tài)的SSR標(biāo)記或Indel標(biāo)記(表),以株表現(xiàn)出類病斑表型的分離單株對(duì)突變體基因lmm進(jìn)行進(jìn)一步定位.為了更精細(xì)定位lmm突變體基因,同時(shí)利用突變體與培矮衍生的F群體中表現(xiàn)突變體性狀的個(gè)分離個(gè)體對(duì)突變體基因進(jìn)一步精細(xì)定位.親本和定位群體F的植株基因組的DNA采用SDS法提取,L的PCR體系包括DNAL,×PCR緩沖液L,正反向引物(mol/L)各L,dNTPs(mol/L)L,Taq酶L,加ddHO補(bǔ)足L.PCR程序如下:下預(yù)變性min;下s,下s,下s,個(gè)循環(huán);最后在下延伸min.PCR產(chǎn)物在非變

17、性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后銀染顯色并讀膠.防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)分析采用Trizol法提取突變體和野生型植株分蘗期葉片總RNA.以經(jīng)過DNase處理過的總RNA為模板,采用ReverTraAceFskkit(TOYOBO)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第鏈.然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析各基因在突變體和野生型中的表達(dá)量.內(nèi)參基因?yàn)锳ctin(GenBank登錄號(hào)為X).實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系(L)包含cDNA模板L,×SYBRqPCRMix(TOYOBO)L,前后引物(mol/L)各L,ddHOL.每個(gè)樣品個(gè)重復(fù).PCR擴(kuò)增程序如下:下s;下s,下s,下s,個(gè)循環(huán).以CT

18、計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量.用于檢測(cè)防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)引物見表.結(jié)果與分析突變體lmm的表型在大田自然條件下,突變體lmm苗期葉片與表定位突變體基因lmm所用的引物序列TablePrimersequenceusedforlmmmapping標(biāo)記Marker前引物Forwardprimer后引物ReverseprimerQTTCCATGGCACACAAGCCCTGTGCACGAACTTCCAAAGQTGGCGCAATATCTCTCTCATTCCTGCCACTTGTGTGTTGTTCTGCQCGAGGGGATTCGATCGACATCCCTTCACACTGCTCCACQGGCGTAAAGGTTTT

19、GCATGTATGATGCCATGAAGGTCAGCQCGTAAACACGAGCACACAAAGGACACACAACAGCTGCTCACTGGIndATGTCCTAATTTTCACCCAGATTTCCATAGCAGACTTATTTCAGIndGCCTAGTGGTGGAAGCATTTAAACCGGCAGGTCTGAIndTGGTTACAATAGTGCCTCACACATAATTGCTAGTAGTTAGAGIndAGTTTCTGGGTTAGGGATGTTATGAGGGTGCTGTTGGIndAAAGTCAAACGTGGACAAGCACTGGCAATTCGCTCAIndCCAAAAGTCAACCTGG

20、AACACAAATTAAATTAGGCATGIndAAATCCGAAGCGCCACTATTGATGCGGCACATCCTAQQ是SSR標(biāo)記;IndInd是插入缺失標(biāo)記.QtoQareSSRmarkers;IndtoIndareinsertdeletemarkers邱結(jié)華等:一個(gè)水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位A野生型(左)和突變體lmm(右)分蘗期的植株表型;B野生型(左)和突變體lmm(右)的分蘗期葉片;C野生型(左)和突變體lmm(右)成熟期的植株表型;D野生型(左)和突變體lmm(右)的成熟期葉片.A,Phenotypeofwildtype(left)andthelmm(righ

21、t)duringthetilleringstage;B,Leafphenotypeofwildtype(left)andthelmm(right)duringthetilleringstage;C,Phenotypeofwildtype(left)andthelmm(right)duringthematuritystage;D,Leafphenotypeofwildtype(left)andthelmm(right)duringthematuritystage圖類病斑突變體lmm的表型FigPhenotypesoflmmmutant其野生型一致,并沒有類病斑,但是在分蘗期后期lmm植株上部葉片

22、從葉尖開始出現(xiàn)紅褐色類病斑(圖AB).隨著水稻的生長(zhǎng),類病斑的數(shù)量逐漸增加并向整片葉片擴(kuò)張,同時(shí)單個(gè)類病斑的面積也會(huì)不斷變大(圖CD),因此,突變體lmm屬于擴(kuò)散型類病斑突變體.另外,相比野生型突變體,lmm植株較為矮小,株高明顯降低,結(jié)實(shí)率顯著降低,每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重均減少.相對(duì)于野生型,表防衛(wèi)反應(yīng)標(biāo)記基因表達(dá)分析引物TableTheprimersforRTPCRofpathogenesisrelatedmarkergenes基因Gene前引物Forwardprimer后引物Reverseprimer登錄號(hào)AccessionNoPRGTAAACAGGTCCACGGTCCATACCCCAGTG

23、ACAACTGACAAGGCAAAUPBZCGGGCACCATCTACACCAGCCATAGTAGCCATCCACDPALGGCATCCAGGGCGGCTTCTTCGGTCTTGCTTCGGCTTCATCAGXPOCTTCAACAACGGCAGCACGGACAATGGAACAAGAAACAGAGCAAGGCAAATCAFPOXAGTGCCAGAACTTCAGGGACAGGATCTACAACAACGAACGCATCCCGTCATACTACTCCAFActinCATGCTATCCCTCGTCTCGACCTCGCACTTCATGATGGAGTTGTATX表突變體和野生型的主要農(nóng)藝性狀TableThe

24、agronomictraitsoflmmandwildtype(WT)材料Material株高Plantheight/cm結(jié)實(shí)率Seedsettingrate/千粒重grainweight/g每穗實(shí)粒數(shù)Nooffilledgrainsperpanicle野生型WT±±±±突變體lmm±±±±,分別表示野生型與突變體在和水平下差異顯著.,significantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectively;Mean±SD(n)中國(guó)水

25、稻科學(xué)(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)表突變體lmm與野生型始穗期劍葉的光合特性TablePhotosyntheticcharactersoflmmmutantandwildtype(WT)atheadingstage材料Material凈光合速率(Pn)Netphotosyntheticrate氣孔導(dǎo)度(Gs)Stomatalconductance蒸騰速率(Tr)Transpirationrate胞間CO濃度(Ci)IntercellularCOconcentration野生型WT±±±±突變體lmm±±±&#

26、177;,分別表示野生型與突變體在和水平下差異顯著.,significantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectivelyMean±SD(n)A,日本睛;B,遮光前l(fā)mm;C,未發(fā)生斑點(diǎn)部位遮光d后;D,遮光部位恢復(fù)光照d后;E,已發(fā)生斑點(diǎn)部位遮光d后.A,Nipponbare;B,Leafoflmmbeforeshading;C,Leafwithoutlesionaftershadingfordays;D,Leafshadedfordaysthenundernormallightfordays;E,Leaf

27、withlesionaftershadingfordays圖遮光對(duì)突變體lmm葉片的影響FigEffectsofShadingonlmmleaveslmm表現(xiàn)一定的早衰現(xiàn)象(圖A,表).突變體lmm類病斑發(fā)生受光照誘導(dǎo)對(duì)突變體lmm只在葉尖出現(xiàn)少量類病斑的葉片未產(chǎn)生類病斑部位用錫箔紙遮光一周后發(fā)現(xiàn),整張葉片其他部位都產(chǎn)生了明顯的類病斑,但是遮光處并沒有類病斑產(chǎn)生(圖AC);恢復(fù)光照一周后,原本沒有類病斑的遮光處產(chǎn)生了明顯的類病斑(圖D);同時(shí),對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生的類病斑的葉片進(jìn)行遮光,一周后發(fā)現(xiàn)已產(chǎn)生的類病斑并不會(huì)消失,但是其他部位類病斑擴(kuò)散嚴(yán)重,遮光處沒有擴(kuò)散(圖E).該結(jié)果表明突變體lmm的類病斑

28、發(fā)生受自然光照誘導(dǎo),適當(dāng)?shù)恼诠饪梢宰柚够驕p輕類病斑的發(fā)生或擴(kuò)散.光合色素含量及光合速率分析對(duì)大田自然環(huán)境下分蘗期、抽穗期和成熟期三個(gè)時(shí)期野生型和突變體lmm葉片葉綠素、類胡蘿卜素含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,在分蘗期(類病斑起始期),突變體和野生型各色素指標(biāo)差異不大,但在抽穗期(類病斑已形成),lmm的葉綠素、類胡蘿卜素含量明顯低于野生型,到成熟期,突變體的各色素含量都極顯著低于野生型(圖).表明lmm的突變導(dǎo)致了水稻葉綠素、類胡蘿卜素含量的降低.為進(jìn)一步了解lmm類病斑的發(fā)生是否影響了其光合作用,我們?cè)谔镩g測(cè)量了齊穗期的突變體和野生型的各個(gè)光合作用指標(biāo)(表),結(jié)果表明lmm的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和

29、蒸騰速率顯著低于野生型,而胞間CO濃度則顯著高于野生型,這表明lmm的突變影響到了水稻葉片的光合作用.葉綠體顯微結(jié)構(gòu)觀察分別對(duì)突變體lmm有類病斑表型的葉片和野生型的葉片進(jìn)行葉綠體結(jié)構(gòu)的電鏡觀察.結(jié)果顯示野生型葉肉細(xì)胞葉綠體數(shù)目較多,基質(zhì)較濃厚,基粒片層垛疊較厚,排列緊密,具有較多的淀粉粒(圖AB).突變體lmm葉肉細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)目較少,葉綠體中的內(nèi)囊體退化成小泡狀,并且具有較多的嗜餓小體,較少的淀粉粒(圖CD).該結(jié)果表明突變體lmm葉片由于類病斑的產(chǎn)生導(dǎo)致了葉肉細(xì)胞中的葉綠體結(jié)構(gòu)的發(fā)育異常.突變體lmm葉片發(fā)生細(xì)胞程序性死亡和HO的沉積利用臺(tái)盼藍(lán)染色方法對(duì)突變體lmm及其野生型葉片中死亡

30、細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示野生型葉片沒有深藍(lán)色染色,說明野生型葉片基本上沒有細(xì)胞死亡(圖AB);但是突變體葉片染色后整體呈淡藍(lán)色,類病斑發(fā)生處對(duì)應(yīng)著嚴(yán)重的深藍(lán)色斑點(diǎn),說明斑點(diǎn)部位有大量的細(xì)胞死亡,而在大塊深藍(lán)色染色間隙也出現(xiàn)了深藍(lán)色的小點(diǎn),說明類病斑正在擴(kuò)展中(圖CD).該結(jié)果表明lmm葉片類病斑的形成和發(fā)展可能是一個(gè)細(xì)胞程序性死亡的過程.邱結(jié)華等:一個(gè)水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位,分別表示野生型與突變體在和水平下差異顯著.,representsignificantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectively

31、圖突變體lmm和野生型不同生育期葉片光合色素含量分析FigPigmentcontentinleavesoflmmandwildtype(WT)duringdifferentgrowthstages植物細(xì)胞程序性死亡時(shí)常產(chǎn)生活性氧的沉積.利用二氨基聯(lián)苯對(duì)突變型和野生型葉片進(jìn)行染色,結(jié)果顯示野生型中基本沒有HO沉積的紅褐色斑點(diǎn)(圖EF),突變體lmm有大量的HO沉積紅褐色小斑點(diǎn)產(chǎn)生(圖GH),表明lmm突變體類病斑發(fā)生可導(dǎo)致水稻葉片細(xì)胞活性氧的積累.突變體lmm對(duì)稻瘟病的抗性利用個(gè)稻瘟病菌株分別噴霧接種突變體lmm及其野生型進(jìn)行苗期稻瘟病抗性檢測(cè),接種d后當(dāng)感病對(duì)照品種病情指數(shù)達(dá)級(jí)以上時(shí)調(diào)查,突變

32、體lmm對(duì)B、B、B、C、G稻瘟病菌生理小種的抗性相對(duì)野生型明顯下降,但對(duì)C、G、C、D、E、C、D、G稻瘟病生理小種抗性增強(qiáng),特別是突變體lmm對(duì)C和G稻瘟病生理小種表現(xiàn)為高抗(圖).防衛(wèi)反應(yīng)標(biāo)記基因的表達(dá)分析利用熒光定量PCR技術(shù)分析了防衛(wèi)反應(yīng)標(biāo)記基因PeroxidaseC(POC)、Phenylalanineammonialyase(PAL)、Probenazoleinducedprotein(PBZ)、Pathogenesisrelatedclass(PR)、Peroxidase(POX)在突變體lmm及其野生型中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,POC、PAL、PBZ、PR在lmm中的表達(dá)量顯著

33、或極顯著高于野生型(圖).說明突變體lmm的類病斑產(chǎn)生激發(fā)了水稻中與抗性相關(guān)的一些防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá).突變體的遺傳分析與分子定位突變體lmm分別與秈稻品種培矮和南京配制的F家系均類似于其野生型,沒有類病斑發(fā)生,相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)F群體中均發(fā)生正常植株和類病斑表型植株分離,分離比例符合分離比()(表),表明突變體lmm類病斑性狀符合單隱性核基因控制的遺傳規(guī)律.從突變體lmm與南京衍生的F群體中挑選出株表現(xiàn)為類病斑的分離單株將目標(biāo)基因初步定位在第染中國(guó)水稻科學(xué)(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)A,B野生型的葉肉細(xì)胞和葉綠體結(jié)構(gòu);C,D突變體的葉肉細(xì)胞和葉綠體結(jié)構(gòu).N細(xì)胞核;CP葉綠體;SG淀粉

34、粒;OG嗜鋨小體;TM內(nèi)囊體膜.A,B,Ultrastructuresofchloroplastsinthemesophyllcellofwildtype;C,D,UltrastructuresofchloroplastsinthemesophyllcelloflmmN,Nucleus;CP,Chloroplast;SG,Starchgranule;OG,Osmiophilicplastoglobuli;TM,Thylakoidmenbranes圖野生型和突變體lmm葉肉細(xì)胞核葉綠體顯微結(jié)構(gòu)FigUltrastructuresofchloroplastsinthemesophyllcellof

35、wildtypeandlmmAD為臺(tái)盼藍(lán)染色;EH為二氨基聯(lián)苯染色.A、C、E和G為染色前;B、D、F和H為染色后A,B,E,F為野生型葉片;C,D,G,H為突變體葉片.D圖箭頭指示的是細(xì)胞死亡著色斑;H圖箭頭指示的是過氧化氫沉積點(diǎn).AD,Ttrypanbluestainingoftheblade;EH,DiaminobenzidinedyeingofthebladeA,C,EandG,Thebladebeforestaining;B,D,FandH,ThebladeafterstainingA,B,E,FarebladesofWT;C,D,G,HarebladesoflmmThearrowi

36、nDindicatecelldeathstainspot;ThearrowinHindicatetheaccumulatedHOstainspot圖lmm突變體的組織化學(xué)分析FigHistochemicalanalysisofthemutantlmm色體著絲粒附近的SSR標(biāo)記Q和Q之間(圖A).為了進(jìn)一步精細(xì)定位lmm基因,在Q和Q之間進(jìn)一步開發(fā)對(duì)有多態(tài)性的SSR標(biāo)記和對(duì)有多態(tài)的Indel標(biāo)記,利用個(gè)表型為類病斑的F分離單株,最終將該基因定位在ind和ind之間大約kb的區(qū)域內(nèi)(圖BC),該區(qū)域橫跨OSJNBaC、OSJNBbK、OSJNBbB、OSJNBbA這四個(gè)BAC(圖D).討論目前,在

37、水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的類病斑突變體.這類突變體除了在無明顯逆境或病原物侵染時(shí),葉片或葉鞘上自發(fā)地形成大小、形狀和顏色各異的類似病原物侵染時(shí)發(fā)生的病斑外,通常還伴隨著其他各種農(nóng)藝性狀的改變.如突變體spl不但表現(xiàn)出類病斑的表型,而且在開花后該突變體植株的葉片會(huì)迅速衰老,最后在成熟期死亡,表現(xiàn)出嚴(yán)重的早衰現(xiàn)象.RLS基因的突變也會(huì)加速植株的衰老,表現(xiàn)出早衰的現(xiàn)象.Takahashi等鑒定的OsPtia基因突變后植株表現(xiàn)出嚴(yán)重的矮化現(xiàn)象.邱結(jié)華等:一個(gè)水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位表lmm的遺傳分析TableGeneticanalysisofthelmm雜交組合Hybridcombinat

38、ion正常表型植株數(shù)Noofnormalplants突變表型植株數(shù)Noofmutantplants卡方值()ChisquareP值Pvalue南京Nanjing/lmm培矮Peiai/lmm圖突變體lmm稻瘟病抗性鑒定FigResistanceidentificationoflmmandwildtype(WT)toriceblastPOC過氧化氫C基因;PAL苯丙氨酸氨裂解酶;PBZ噻菌靈誘導(dǎo)蛋白基因;PR病程相關(guān)基因;POX過氧化氫基因.,分別表示野生型與突變體在和水平下差異顯著.POC,PeroxidaseC;PAL,Phenylalanineammonialyase;PBZ,Proben

39、azoleinducedprotein;PR,Pathogenesisrelatedclass;POX,Peroxidase,representsignificantdifferencebetweenwildtypeandthemutantatandlevels,respectively圖防衛(wèi)反應(yīng)基因定量表達(dá)分析FigExpressionanalysisofdiseaseresistancegenesFeng等年鑒定的HM突變體株高、分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重都顯著低于其野生型.本研究鑒定的類病斑突變體lmm從分蘗期開始產(chǎn)生類病斑,之后類病斑的數(shù)量逐漸增加,單個(gè)類病斑的面積也會(huì)不斷

40、變大,直至整個(gè)植株覆蓋嚴(yán)重的類病斑,因此lmm屬于典型的擴(kuò)散型類病斑突變體.除此之外,相對(duì)于野生型,突變體lmm的株高明顯降低,有效穗數(shù)減少,穗長(zhǎng)縮短,結(jié)實(shí)率、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重均顯著降低.因此lmm基因表現(xiàn)出對(duì)水稻正常生長(zhǎng)發(fā)育具有“一因多效”的重要作用.類病斑突變體出現(xiàn)類病變壞死突變的原因非常復(fù)雜,主要受基因突變的控制外,同時(shí)也存在許多環(huán)境誘發(fā)因素,如光、溫度、濕度等.水稻類病斑突變體spl在高溫()和紫外線的誘導(dǎo)下產(chǎn)生斑點(diǎn).擬南芥lin突變體類病變表型則受長(zhǎng)日照誘導(dǎo)產(chǎn)生.Noutoshi等發(fā)現(xiàn)slh突變體的類病斑表型受低濕度誘導(dǎo)產(chǎn)生.本研究中的突變體lmm類病斑表型的產(chǎn)生受自然光照的誘導(dǎo),

41、對(duì)未發(fā)生類病斑的葉片遮光處理可以阻止類病斑形成,對(duì)已發(fā)類病斑的葉片遮光則可以阻止病斑組織的擴(kuò)中國(guó)水稻科學(xué)(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)A突變體基因lmm與SSR標(biāo)記Q、Q連鎖;B利用個(gè)F分離單株將lmm定位在Q與Q之間;C利用個(gè)F分離單株將lmm定位與Ind和Ind約kb的區(qū)間;D目標(biāo)區(qū)域覆蓋個(gè)BAC.A,lmmwaslinkagedwithSSRmarkersQandQ;B,lmmwaslocatedbetweenQandQbasedonseparatedFplants;C,lmmwaslocateddownkbregionbetweenIndandIndbasedonsepa

42、ratedFplants;D,lmmtargetregioncontainingfourBAC圖lmm突變體基因的精細(xì)定位FigFinemappingoflmm大(圖).由于類病斑突變體類病斑的產(chǎn)生與植物受病原物侵染發(fā)病而產(chǎn)生組織壞死類似,而早前研究發(fā)現(xiàn)許多的類病斑突變體對(duì)某些植物病原物表現(xiàn)出了比野生型更好的抗性.如水稻spl、spl和spl突變體對(duì)稻瘟病病菌和白葉枯病菌的抗性有所提高,;王建軍等發(fā)現(xiàn)lrd和lrd對(duì)白葉枯病菌具有廣譜型抗性.而本研究發(fā)現(xiàn)我們鑒定的lmm突變體也表現(xiàn)出對(duì)多個(gè)稻瘟病生理小種具有一定的抗性,尤其對(duì)C和G兩個(gè)生理小種的抗性明顯增強(qiáng)(圖).類病斑突變體對(duì)病原物表現(xiàn)出一定

43、的抗性,有可能是因?yàn)橛绊懥艘恍┓佬l(wèi)反應(yīng)標(biāo)記基因表達(dá).如水稻類病斑突變體Oslsd具有明顯的稻瘟病抗性,其植株內(nèi)的防衛(wèi)反應(yīng)標(biāo)記基因PR和PBZ表達(dá)顯著提高;突變體ttm同時(shí)對(duì)稻瘟病和白葉枯病表現(xiàn)出抗性,其體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)標(biāo)記基因PRb、PR、PRa和PAL的表達(dá)量都增加.在本研究中,突變體lmm中防衛(wèi)反應(yīng)標(biāo)記基因POC、PAL、PBZ、PR的表達(dá)也出現(xiàn)了明顯上調(diào)(圖).因此,類病斑突變體的類病斑產(chǎn)生機(jī)理的研究也對(duì)植物抗病機(jī)理及細(xì)胞程序性死亡等相關(guān)研究具有重要借鑒意義.雖然國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)植物類病斑產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究,但是由于類病斑的形成機(jī)制十分復(fù)雜,同時(shí)也受溫度、光照等自然條件的影響,類病斑的

44、形成機(jī)制目前仍然不是十分清楚,因此還需要更多相關(guān)基因的克隆與功能研究.目前在第染色體上共鑒定出個(gè)水稻類病斑基因spl、spl和OsPtia.其中spl暫無定位信息,另外兩個(gè)已經(jīng)被克隆,其中spl位于第染色體長(zhǎng)臂末端;而OsPtia位于第染色體短臂末端.本研究定位到的lmm位于第染色體著絲粒附近,因此lmm是一個(gè)新的類病斑基因.本研究關(guān)于突變體lmm的生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)及分子遺傳學(xué)研究為lmm基因的克隆與功能研究打下了基礎(chǔ),對(duì)于探索水稻類病斑發(fā)生機(jī)制及抗病反應(yīng)機(jī)制具有重要意義.參考文獻(xiàn):HuG,RichterTE,HulbertSH,etalDiseaselesionmimicrycausedbym

45、utationsintherustresistancegenerpPlantCell,():DanglJL,DietrichRA,RichbergMHDeathdonthavenomercy:CelldeathprogramsinplantmicrobeinteractionsPlantCell,():陳析豐,金楊,馬伯軍水稻類病變突變體及抗病性的研究進(jìn)展植物病理學(xué)報(bào),():王建軍,朱旭東,王林友,等水稻類病變突變體lrd的抗病性與細(xì)胞學(xué)分析中國(guó)水稻科學(xué),():邱結(jié)華等:一個(gè)水稻類病斑突變體lmm的鑒定及其基因定位QiaoYL,JiangWZ,LeeJH,etalSPLencodesaclat

46、hrinassociatedadaptorproteincomplex,mediumsubunit(APM)andisresponsibleforspottedleafandearlysenescenceinrice(Oryzasativa)NewPhytol,():黃奇娜,楊楊,施勇烽,等水稻斑點(diǎn)葉變異研究進(jìn)展中國(guó)水稻科學(xué),():YamanouchiU,YanoM,LinH,etalAricespottedleafgene,Spl,encodesaheatstresstranscriptionfactorproteinProcNatlAcadSci,():ZengLR,QuSH,Bordeo

47、sA,etalSpottedleaf,anegativeregulatorofplantcelldeathanddefense,encodesaUbox/armadillorepeatproteinendowedwithEubiquitinligaseactivityPlantCell,():WangLJ,PeiZY,TianYC,etalOsLSD,aricezincfingerprotein,regulatesprogrammedcelldeathandcallusdifferentiationMolPlantMicrobeInteract,():YuanYX,ZhongSH,LiQ,et

48、alFunctionalanalysisofriceNPRlikegenesrevealsthatOsNPR/NHisthericeorthologueconferringdiseaseresistancewithenhancedherbivoresusceptibilityPlantBiotechnolJ,():KimJA,ChoK,SinghR,etalRiceOsACDR(Oryzasativaacceleratedcelldeathandresistance)isapotentialpositiveregulatoroffungaldiseaseresistanceMolCell,():MoriM,TomitaC,SugimotoK,etalIsolationandmolecularcharacterizationofaSpottedleafmutantbymodifiedactivationtagginginricePlantMolBiol,():TakahashiA,AgrawalGK,YamazakiM,etalRicePtiane