UPLC-MS-MS法測(cè)定蔬菜中多菌靈含量的不確定度評(píng)估

1、    uplc-ms/ms法測(cè)定蔬菜中多菌靈含量的不確定度評(píng)估    石驍昵李婷馬宇熙摘要：目的  研究超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（uplc-ms/ms）法測(cè)定蔬菜中多菌靈含量的不確定度。方法  色譜柱為waters acquity beh c18，1.7m，柱溫：35;進(jìn)樣量5 l;流動(dòng)相：a為乙腈，b為0.05%甲酸水;流速：0.3 ml。梯度洗脫條件：05 min 30% a，70% b;56 min 95% a，5% b;67 min 30% a，70% b，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)不確定來源進(jìn)行分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線模型，

2、計(jì)算各變量的不確定度、合成不確定度、擴(kuò)展不確定度。結(jié)果  超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定蔬菜中多菌靈含量的不確定度，影響最大的是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制稀釋過程中產(chǎn)生的不確定度。相對(duì)不確定度為0.233，在置信度為95%時(shí)，覆蓋因子k=2，擴(kuò)展不確定度為4.66%。結(jié)論  uplc-ms/ms法測(cè)定多菌靈含量對(duì)測(cè)量不確定貢獻(xiàn)最大的是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和稀釋過程中產(chǎn)生的不確定度，其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時(shí)產(chǎn)生的不確定度。因此在實(shí)驗(yàn)過程中要嚴(yán)格操作規(guī)程，減少人為誤差。關(guān)鍵詞：多菌靈;蔬菜;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;不確定度：tq450.7       

3、60;                     ：a                                  doi：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.03.054：1006-1959（2020）03-0162-03evaluation of uncertainty in determinat

4、ion of carbendazim in vegetables by uplc-ms/msshi xiao-ni，li ting，ma yu-xi（urumqi center for disease control and prevention，urumqi 830026，xinjiang，china）abstract：objective  to study the uncertainty of determination of carbendazim in vegetables by ultra performance liquid chromatography-mass spe

5、ctrometry （uplc-ms/ms）. methods  the chromatographic column was waters acquity beh c18， 1.7 m， column temperature： 35 °c; injection volume was 5 l; mobile phase： a was acetonitrile， b was 0.05% formic acid water; flow rate： 0.3 ml.gradient elution conditions： 05 min 30% a， 70% b; 56 min 95

6、% a， 5% b; 67 min 30% a， 70% b. multi-reaction monitoring mode was used for detection. analyze the sources of uncertainty， establish a standard curve model， and calculate the uncertainty， synthetic uncertainty， and expanded uncertainty of each variable.results  the uncertainty of the determinat

7、ion of carbendazim in vegetables by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry combined with the most significant factor was the uncertainty generated during the preparation and dilution of standard solutions. the relative uncertainty is 0.233.when the confidence is 95%， the coverage

8、factor k=2 and the expanded uncertainty is 4.66%.conclusion  the most significant contribution to the measurement uncertainty of the determination of carbendazim by the uplc-ms/ms method is the uncertainty generated during the preparation and dilution of the standard solution， followed by the u

9、ncertainty generated during the fitting of the standard curve. therefore， it is necessary to strictly operate procedures during the experiment to reduce human error.key words：carbendazim;vegetables;ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry; uncertainty在我國(guó)植物殺菌劑已廣泛使用于水果蔬菜種植，其中多菌靈是一種廣譜性

10、殺菌劑，屬于內(nèi)吸性殺菌劑，通過吸收蔬菜體內(nèi)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，從而起到殺菌作用。但多菌靈在人體內(nèi)蓄積，可能引起嘔吐等癥狀，且對(duì)生殖系統(tǒng)有很大影響1。多菌靈產(chǎn)生的積累性及生物毒性已經(jīng)引起國(guó)家的重視，為了保證蔬菜質(zhì)量安全，我國(guó)對(duì)農(nóng)藥殘留實(shí)施了嚴(yán)格的檢測(cè)，并對(duì)不同農(nóng)作物有一定的限值要求2，3，這就對(duì)多菌靈檢測(cè)結(jié)果的可信度和準(zhǔn)確度提出了很高的要求。多菌靈的檢測(cè)方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法4-6，但以上方法的適用范圍較小，對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)的農(nóng)藥殘留測(cè)定干擾較大。近年來隨著檢測(cè)技術(shù)的日益更新，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（uplc-ms/ms）法在測(cè)定農(nóng)藥方面得到廣泛應(yīng)用7-9

11、，uplc-ms與ms聯(lián)用，可以充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì)，與傳統(tǒng)的高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用（hplc-ms）相比，顯著提高了定量分析的重復(fù)性和可靠性以及定性分析的準(zhǔn)確性，較好地適應(yīng)了現(xiàn)代藥物研究對(duì)自動(dòng)化、高通量分析的需求，已成為藥物分析的重要方法之一10。本研究主要探討超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（uplc-ms/ms）法測(cè)定蔬菜中多菌靈含量的不確定度，現(xiàn)報(bào)道如下。1儀器與試劑1.1儀器  xevo-tq-s micro超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)waters公司），ae240天平（瑞士mettler），kq-500e超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），3-30ks冷凍離心機(jī)（德國(guó)sig

12、ma公司），ah-20全自動(dòng)均質(zhì)器（?？苾x器有限公司），milli-q integral 10超純水儀（美國(guó)millipore公司）。1.2實(shí)驗(yàn)試劑  乙腈：色譜純，德國(guó)sigma公司;無水甲酸：色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;無水硫酸鎂、氯化鈉：優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;psa cnw;gcb，agela technoiogies;0.22 m微孔過濾膜，安譜。多菌靈：dr.ehrenstorfer gmbh，純度99.6%。2方法2.1樣品前處理2.1.1樣品來源  市售綠葉蔬菜韭菜、茼蒿、葉用萵苣、油麥菜、小白菜共35份。2.1.2樣品前處理  稱

13、取5 g小白菜樣品加入10 ml乙腈，充分震蕩后超聲10 min;加入1 g nacl，再次充分震蕩1 min，再加入4 g無水mgso4迅速渦旋1 min。以10000 r/min冷凍離心10 min，取上清液1.0 ml，加入400 mg psa，10 mg gcb，渦旋1 min，10000 r/min離心5 min，取上清液，過膜，上機(jī)測(cè)定。2.2儀器條件2.2.1質(zhì)譜條件  離子源：esi正離子模式;離子源溫度：150;去溶劑氣流量：1000 l/h;去溶劑氣溫度：450;錐孔氣流量：50 l/h;監(jiān)測(cè)方式：mrm模式，掃描采集參數(shù)：母離子：192.1 m/z;定量離子/碰

14、撞能量：132.1/28 v;定性離子/碰撞能量：160/18 v;錐孔電壓：33 v;保留時(shí)間：0.46 min。2.2.2色譜條件  色譜柱為waters acquity beh c18，1.7 m，柱溫：35;進(jìn)樣量5 l;流動(dòng)相：a為乙腈，b為0.05%甲酸水;流速：0.3 ml。梯度洗脫條件：05 min 30% a，70% b;56 min 95% a，5% b;67 min 30% a，70% b。2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制  稱取10.04 mg dr.ehrenstorfer gmbh標(biāo)準(zhǔn)品，置于10.00 ml容量瓶，使用乙腈定容，配制成1 mg/ml多菌靈儲(chǔ)備

15、液。取1.00 ml儲(chǔ)備液于100 ml容量瓶，用乙腈稀釋配制為濃度為10 g/ml的中間液。取中間液適量，用空白基質(zhì)配制成測(cè)定濃度為0.5、1.0、5.0、10、20、40、80、100 g/l的基質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。3結(jié)果3.1測(cè)定結(jié)果計(jì)算  本文中測(cè)定物質(zhì)為多菌靈，其含量按以下公式計(jì)算：xmg/kg=注：x：待測(cè)物濃度（mg/kg）;c：樣品中待測(cè)物濃度（g/l）（儀器直讀）;v：樣品提取液體積10.00（ml）;m：樣品質(zhì)量5.00（g）。3.2不確定度來源分析  影響不確定的因素有以下3個(gè)方面：多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度，其中包括多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品稱量、稀釋、定容引入的不

16、確定度;標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的不確定度;樣品制備和測(cè)定以及回收率引入的不確定度11，12。3.2.1多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度ur （m ）  根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所用天平的檢定證書，檢定分度值e=0.1 mg，最大允許誤差為0.5e，即為0.05 mg。按均勻分布，包含因子k=，標(biāo)準(zhǔn)品稱量引起的不確定度為ur=，式中m為標(biāo)準(zhǔn)品稱取量（mg），因此標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度為ur （m ）=0.00287。3.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度ur （c ）  容量瓶引起的不確定度：配制標(biāo)準(zhǔn)溶液所需的容量瓶為10 ml和100 ml。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿的檢定證書，其中10 ml（v

17、1）a級(jí)容量瓶和100 ml（v2）a級(jí)容量瓶最大允許誤差均為±0.02ml，因質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室溫度控制恒定，故試劑及標(biāo)準(zhǔn)都在相同的環(huán)境條件下，可以忽略由溫度引入的不確定度。按均勻分布，包含因子k時(shí)容量瓶引入的不確定度為ur （v ）=，x為容量瓶體積（ml），即10 ml容量瓶ur （v1 ）=0.001154，100 ml容量瓶引起的不確定度ur （v2 ）=0.000116。移液器引起的不確定度：配制標(biāo)準(zhǔn)溶液所需的移液器量210 l（p1），50200 l（p2），2001000 l（p3），根據(jù)檢定證書移液器的允許誤差分別為±0.10 l，±1.6l，±

18、;8l，按照均勻分布，k=，不確定度為分別為ur （p ）=，x為移液器最大量程（l）。即3種移液器引入的不確定度分別為ur （p1 ）=0.005773，ur（p2 ）=0.004618，ur（p3 ）=0.004618。由可得：在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，使用1次10 ml容量瓶，2次100 ml容量瓶，210 l移液器使用2次（1次5 l，1次10 l），50200 l移液器使用3次（1次50 l，1次100 l，1次200 l），2001000 l移液器使用4次（1次400 l，1次800 l，2次1000 l），其相對(duì)不確定度是：3.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度ur （b ） 

19、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線共8個(gè)點(diǎn)（m=8），每個(gè)點(diǎn)測(cè)定3次，共測(cè)定24次，結(jié)果見表1。共擬合3條標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距平均值。三條曲線分別為y1=7282.72x+76548;y2=7466.96x+68572;y3=7346.91x+80467。b=75196， a=7358.86。x為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的理論平均值， x=32.0625，j為每組基質(zhì)曲線的序號(hào)（j=1、2、3），i為測(cè)定基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的序數(shù)（i=1，2，3n）：自相關(guān)的方差為sxx=3.3樣品測(cè)量重復(fù)性和回收率引入的不確定度做一份空白樣品的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量為0.10 mg/kg，每份樣品測(cè)定6次，計(jì)算出多菌靈含量（m

20、g/kg）及回收率（%）、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%），結(jié)果見表2。3.3.1回收率引入的不確定度ur （r ）u （r ）=0.390856，其中s（r）為回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差，回收率相對(duì)不確定度ur （r ）=0.004367，其中 r為回收率的平均值。3.3.2樣品重復(fù)性引入的不確定度ur （y ）ur （y ）=0.004789，其中s（x）為樣品測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差， x為樣品測(cè)定平均值。3.4合成不確定度  多菌靈測(cè)定的相對(duì)不確定度為：u=0.233095。3.5相對(duì)擴(kuò)展不確定度  置信區(qū)間95%，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)包含因子選擇k=2，則擴(kuò)展不確定度u= ur（x）×k =0.4

21、6619。4總結(jié)使用uplc-ms/ms測(cè)定蔬菜中的多菌靈含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)不確定度為0.233，在置信度為95%時(shí)，覆蓋因子k=2，擴(kuò)展不確定度為4.66%，小于16.8%的要求值。通過對(duì)以上各分量不確定度的研究，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中對(duì)測(cè)量不確定影響的最大分量是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和稀釋過程中產(chǎn)生的不確定度，其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時(shí)產(chǎn)生的不確定度。因此在實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)所用量器的檢定，嚴(yán)格操作規(guī)程，減少人為誤差，從而達(dá)到減小測(cè)定結(jié)果的不確定度，保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。參考文獻(xiàn)：1于功昌，王筱芬.苯并咪唑殺菌劑的雄性生殖毒性作用機(jī)制研究進(jìn)展j.職業(yè)與健康，2014，30（18）：2661-2663，2669.2gb2763-