WesternBlotting技術(shù)實用教案

1、實驗實驗(shyn)目的目的 檢測一個檢測一個(y (y )基因的表達產(chǎn)物是否正確基因的表達產(chǎn)物是否正確 - - 定性定性 比較表達產(chǎn)物量的相對變化比較表達產(chǎn)物量的相對變化 - - 半定量半定量第1頁/共32頁第一頁，共33頁。 與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原(kngyun)，與對應(yīng)的

2、抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。 基本原理基本原理第2頁/共32頁第二頁，共33頁?；净?jbn)流程流程l轉(zhuǎn)膜l封閉l一抗雜交(zjio)l二抗雜交(zjio)l底物顯色 蛋白樣品蛋白樣品(yngpn)的制備的制備 SDS聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳第3頁/共32頁第三頁，共33頁?；净?jbn)流程流程第4頁/共32頁第四頁，共33頁。蛋白樣品(yngpn)的制備第5頁/共32頁第五頁，共33頁。制備制備(zhbi)流程流程n天然(tinrn)蛋白

3、：細胞總蛋白、組織總蛋白、膜蛋白、核蛋白n用細菌或酵母人工表達的蛋白破碎細胞提取蛋白高速離心蛋白定量Bradford法Lowry法第6頁/共32頁第六頁，共33頁。細胞細胞(xbo)(xbo)破碎破碎 1、液氮研磨法 2、機械勻漿法 3、超聲波處理法 4、反復(fù)凍融法：由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽 濃度增高(znggo)引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。 5、化學(xué)裂解法：去氧膽酸鈉、SDS 6、酶解法：細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理；植物 細胞壁可用纖維素酶處理。第7頁/共32頁第七頁，共33頁。蛋白蛋白(dnbi)提取提取 冰上操作冰上操作第8頁/共32頁第八頁，共33頁。蛋白蛋白(dnbi)

4、定量定量 蛋白上樣量需達到一定的范圍 保證開始實驗(shyn)的總蛋白量是一致的第9頁/共32頁第九頁，共33頁。蛋白蛋白(dnbi)定量原理定量原理1. BCA（ bicinchoninic acid ）法）法在堿性條件下，蛋白將在堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為還原為Cu+，Cu+與與BCA試劑形成紫試劑形成紫色的絡(luò)合物，此物在色的絡(luò)合物，此物在562nm波長處有最大吸收，顏色深淺波長處有最大吸收，顏色深淺(shnqin)與蛋白含量成正比。與蛋白含量成正比。2. Bradford法法考馬氏亮藍考馬氏亮藍G250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀

5、度下為棕紅色，當(dāng)它通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變成藍離狀度下為棕紅色，當(dāng)它通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變成藍色，最大吸收波長從色，最大吸收波長從465nm轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到595nm處。處。3. Lowry法法蛋白質(zhì)中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產(chǎn)蛋白質(zhì)中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產(chǎn)生藍色化合物，顏色深淺生藍色化合物，顏色深淺(shnqin)與蛋白含量成正比。與蛋白含量成正比。第10頁/共32頁第十頁，共33頁。蛋白蛋白(dnbi)定量原理定量原理 4. 雙縮脲法雙縮脲法當(dāng)需要快速，但不很準確的測定中，常使用雙縮脲法。原理是當(dāng)需要快速，但不很準確的測定中，常使用雙縮

6、脲法。原理是Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵，與蛋白質(zhì)的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍色絡(luò)合物，此物在以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍色絡(luò)合物，此物在540nm波長處有最大吸收。波長處有最大吸收。 5. 紫外吸收法紫外吸收法蛋白質(zhì)溶液在蛋白質(zhì)溶液在280nm附近有強烈的吸收，這是由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸殘基而引附近有強烈的吸收，這是由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的。另外核蛋白或提取過程中雜有的核酸對測定結(jié)果引起極大起的。另外核蛋白或提取過程中雜有的核酸對測定結(jié)果引起極大(j d)誤差，其最大誤差，其最大吸收在吸收在260nm。所以同時測定。所以同時測定280及及260nm兩種波長的吸光度，通過計

7、算可得較為正兩種波長的吸光度，通過計算可得較為正確的蛋白質(zhì)含量。確的蛋白質(zhì)含量。第11頁/共32頁第十一頁，共33頁?；净?jbn)流程流程l轉(zhuǎn)膜l封閉l一抗雜交(zjio)l二抗雜交(zjio)l底物顯色 蛋白樣品蛋白樣品(yngpn)的的制備制備 SDS聚丙烯酰胺凝膠電聚丙烯酰胺凝膠電泳泳第12頁/共32頁第十二頁，共33頁。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 （1）SDS-PAGE凝膠配制 （2）樣品處理： 在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。 （3）上樣與電泳 冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到膠加樣孔內(nèi)即可

8、。電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳(50-60V)，而在溴酚藍進入下層(xicng)膠時使用高電壓恒壓電泳（100-120V）。第13頁/共32頁第十三頁，共33頁。第14頁/共32頁第十四頁，共33頁。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：原理：濃縮效應(yīng)：樣品中蛋濃縮效應(yīng)：樣品中蛋白質(zhì)被濃縮在濃縮白質(zhì)被濃縮在濃縮膠和分離膠和分離(fnl)膠膠的界面。的界面。電荷效應(yīng)：等電點不電荷效應(yīng)：等電點不同，所帶電荷量不同，所帶電荷量不同，在電場中所受同，在電場中所受引力亦不同。引力亦不同。 分子篩效應(yīng)：分子量分子篩效應(yīng)：分子量大小或分子形狀不大小或分子形狀不同的蛋白質(zhì)通過分同的蛋白

9、質(zhì)通過分離離(fnl)膠時，所膠時，所受阻滯的程度不同。受阻滯的程度不同。第15頁/共32頁第十五頁，共33頁。第16頁/共32頁第十六頁，共33頁。轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜膜的選擇(xunz)硝酸(xio sun)纖維素膜PVDF膜尼龍(nlng)膜價格便宜易封閉，背景低極強的蛋白結(jié)合能力易破脆，不易操作信噪比高多用于核酸的轉(zhuǎn)移，封閉較困難，背景高第17頁/共32頁第十七頁，共33頁。轉(zhuǎn)膜方法轉(zhuǎn)膜方法(fngf) 毛細管印跡法毛細管印跡法 濾紙、凝膠、膜、濾紙濾紙、凝膠、膜、濾紙 重物重物(zhn w)壓住壓住 毛細作用使緩沖液流過凝膠，將蛋白質(zhì)帶到膜上毛細作用使緩沖液流過凝膠，將蛋白質(zhì)帶到膜上 效率低（效

10、率低（1020） 電泳印跡法電泳印跡法 用有孔的塑料或有機玻璃板將凝膠和膜夾成用有孔的塑料或有機玻璃板將凝膠和膜夾成“三明治三明治”形狀形狀 濕轉(zhuǎn)法、半干法濕轉(zhuǎn)法、半干法第18頁/共32頁第十八頁，共33頁。轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 濕轉(zhuǎn)法：濕轉(zhuǎn)法： 將膜、膠疊層浸入緩沖液槽中然后加電將膜、膠疊層浸入緩沖液槽中然后加電壓；壓； 膠在負極，膜在正極；膠在負極，膜在正極； 慢，需要大體積冰預(yù)冷緩沖液；慢，需要大體積冰預(yù)冷緩沖液； 適用于分子量較大的蛋白；適用于分子量較大的蛋白； 半干法：半干法： 用浸透用浸透(jntu)緩沖液的多層濾紙代替緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽；緩沖液槽； 膠在負極，膜在正極；膠在負極，膜

11、在正極； 快（快（1545min）；）； 適用與小分子量蛋白；適用與小分子量蛋白；第19頁/共32頁第十九頁，共33頁。轉(zhuǎn)膜步驟轉(zhuǎn)膜步驟(bzhu)（濕轉(zhuǎn)法）（濕轉(zhuǎn)法）1、電泳完畢后，將膜和濾紙裁至與膠相同大小，并在膠上裁去一角做標記；2、將膠、膜、濾紙浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min-30min（PVDF需先在100%甲醇中浸泡數(shù)秒鐘）；3、打開夾板使黑的一面保持水平，按海綿墊、濾紙、凝膠、膜、濾紙、海綿墊的順序疊放；4、趕走氣泡后合起夾子。（膜兩邊(lingbin)的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，夾子的黑面對槽的黑面，夾子的白面對槽的紅面。5、冰上 100V 35

12、0mA轉(zhuǎn)膜1h，或30V 90mA轉(zhuǎn)膜過夜。第20頁/共32頁第二十頁，共33頁。小型小型(xioxng)Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)印槽第21頁/共32頁第二十一頁，共33頁。半干轉(zhuǎn)印儀半干轉(zhuǎn)印儀第22頁/共32頁第二十二頁，共33頁。影響影響(yngxing)轉(zhuǎn)膜效率的因素轉(zhuǎn)膜效率的因素n轉(zhuǎn)移緩沖液的平衡(pnghng)時間第23頁/共32頁第二十三頁，共33頁。影響影響(yngxing)轉(zhuǎn)膜效率的因素轉(zhuǎn)膜效率的因素SDSSDS有助于蛋白遷移到膜上，但過量的有助于蛋白遷移到膜上，但過量的SDS會抑制蛋白與膜的結(jié)合，會抑制蛋白與膜的結(jié)合，轉(zhuǎn)印緩沖液中加入轉(zhuǎn)印緩沖液中加入0.1會促進轉(zhuǎn)印會促

13、進轉(zhuǎn)印建議的步驟在轉(zhuǎn)印緩沖液中不含有建議的步驟在轉(zhuǎn)印緩沖液中不含有SDS，但凝膠在電泳后不需要浸泡，但凝膠在電泳后不需要浸泡在轉(zhuǎn)印緩沖液中；凝膠中殘留的在轉(zhuǎn)印緩沖液中；凝膠中殘留的SDS對于有效對于有效(yuxio)的轉(zhuǎn)印已經(jīng)足的轉(zhuǎn)印已經(jīng)足夠。夠。甲醇甲醇甲醇通過在蛋白上剝離甲醇通過在蛋白上剝離SDS促進蛋白和膜的疏水接合?；罨龠M蛋白和膜的疏水接合?；罨疨VDF膜上膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合；可降低蛋白質(zhì)洗面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合；可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，增加蛋白質(zhì)和脫效率，增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力。膜的結(jié)合能力。第24頁/共32頁第二十四頁，共3

14、3頁。影響轉(zhuǎn)膜效率影響轉(zhuǎn)膜效率(xio l)的因素的因素凝膠濃度：丙烯酰胺濃度越低，蛋白凝膠濃度：丙烯酰胺濃度越低，蛋白(dnbi)越容越容易轉(zhuǎn)移。易轉(zhuǎn)移。電壓或電流電壓或電流膜的選擇膜的選擇第25頁/共32頁第二十五頁，共33頁。第26頁/共32頁第二十六頁，共33頁。封閉封閉(fngb) 封閉未吸附蛋白的疏水結(jié)合(jih)位點，以減少非特異性結(jié)合(jih)背景的影響。 室溫封閉1h-2h。 l 5%-7%脫脂奶粉（不適用于生物素親和素檢測和堿性磷酸酶底物檢測系統(tǒng)）l 1%-3%BSAl 血清(xuqng)l 公司提供的WB封閉液第27頁/共32頁第二十七頁，共33頁。一抗二抗孵育一抗二抗孵

15、育(f y) 一抗：一般是用待測蛋白免疫動物A（如兔、鼠），獲得的多克隆或單克隆抗體，如小鼠抗人NGF 二抗：另一種(y zhn)動物（如羊）的抗動物A的免疫球蛋白抗體（放射性標記或酶標記），如羊抗小鼠IgG/HRP抗原(kngyun)一抗二抗人NGF小鼠兔第28頁/共32頁第二十八頁，共33頁。一抗二抗孵育一抗二抗孵育(f y) 把膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入一抗溶液(rngy)與膜溫育。室溫孵育1-2h，或4過夜。 倒掉一抗（用封閉液稀釋），用1TBST洗膜3次，每次10min。 加入二抗（用封閉液稀釋），室溫孵育60-80min。 倒掉二抗溶液(rngy)，用1TBST洗膜3次，每

16、次10min。第29頁/共32頁第二十九頁，共33頁。顯色顯色(xin s) 酶聯(lián)法：酶聯(lián)法： HRP（辣根過氧化物酶）：底物為（辣根過氧化物酶）：底物為DAB，產(chǎn)生，產(chǎn)生(chnshng)紅褐色。紅褐色。 AP（堿性磷酸酶）：底物為（堿性磷酸酶）：底物為NBT/BCIP，產(chǎn)生，產(chǎn)生(chnshng)藍紫色。藍紫色。 底物化學(xué)發(fā)光底物化學(xué)發(fā)光ECL： 二抗中的二抗中的HRP或或AP與發(fā)光底物作用使其發(fā)光，然后經(jīng)底片曝光顯影記錄下來。與發(fā)光底物作用使其發(fā)光，然后經(jīng)底片曝光顯影記錄下來。 生物素標記生物素標記 地高辛標記地高辛標記 熒光標記熒光標記第30頁/共32頁第三十頁，共33頁。顯色顯色(x

17、in s)步驟步驟化學(xué)發(fā)光（化學(xué)發(fā)光（ECL），顯影和定影），顯影和定影將將A和和B兩種試劑等體積混合，把膜移至一保鮮膜上，將混合液滴于膜兩種試劑等體積混合，把膜移至一保鮮膜上，將混合液滴于膜上，室溫孵育上，室溫孵育2min后把膜放到另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入后把膜放到另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X光片夾中。光片夾中。暗室中，紅燈下取出暗室中，紅燈下取出X-光片，切紙刀剪裁適當(dāng)大小。打開光片，切紙刀剪裁適當(dāng)大小。打開X-光片夾，光片夾，把把X-光片放在膜上，關(guān)上。根據(jù)信號的強弱適當(dāng)調(diào)整曝光光片放在膜上，關(guān)上。根據(jù)信號的強弱適當(dāng)調(diào)整曝光(bo gung)時間。曝光時間。曝光(bo gung)完成后，取出完成后，取出X-光片迅速浸入顯影液中顯影，光片迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后終止顯影。把待出現(xiàn)明顯條帶后終止顯影。把X-光片放入定影液中定影至膠片透明光片放入定影液中定影至膠片透明為止。為止。第31頁/共32頁第三十一頁，共3