基因工程實(shí)驗(yàn)_biochemlab說課講解

1、基因工程實(shí)驗(yàn)_biochemlab實(shí)驗(yàn)?zāi)夸泴?shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)計(jì)劃表實(shí)驗(yàn)二 染色體DNA的提取實(shí)驗(yàn)三 PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)四 凝膠電泳法回收目的DNA及其體外連接實(shí)驗(yàn)五 感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)六 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)七 質(zhì)粒的提取實(shí)驗(yàn)八 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 目的基因的獲取基因組總提取凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的基因 產(chǎn)物的電泳檢測(cè)產(chǎn)物純化獲得目的基因1.本學(xué)期實(shí)驗(yàn)計(jì)劃重組、轉(zhuǎn)化與pMD18-T連接DH5a感受態(tài)細(xì)胞制備 轉(zhuǎn)化、平板涂布、培養(yǎng)篩選與鑒定抗生素抗性篩選挑單菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒質(zhì)粒酶切、電泳檢測(cè)2.微量移液器的使用將微量移液器按鈕輕輕壓在第一擋垂直握持微量移液器，使吸頭浸入頁面下幾毫米，千萬別將吸頭直接插到液體底

2、部緩慢、平穩(wěn)地松開控制按鈕，吸上樣品液。否則液體進(jìn)入吸頭太快，導(dǎo)致液體倒吸入移液槍內(nèi)部，或吸入體積減少。等1s后將吸頭提高液面，并使吸頭在容器壁擦過平穩(wěn)把按鈕壓到第一停點(diǎn)，在把按鈕壓到第二停點(diǎn)以排出剩余液體、提起微量移液器，使吸頭在容器壁擦過然后按吸頭彈射器除去吸頭使用操作使用注意事項(xiàng) 未裝吸頭的微量移液器絕對(duì)不可用來吸取任何液體。 一定要再允許范圍內(nèi)設(shè)定容量，千萬不要將讀數(shù)的調(diào)節(jié)超出其適用的刻度范圍，否則會(huì)造成損壞。 不要橫放帶有殘留液體吸頭的移液器 不要用大量程的移液器移取小體積樣品 微量移液器每日用完后，應(yīng)旋轉(zhuǎn)到最大刻度，讓彈簧恢復(fù)原形，保持彈性。 為了確保微量移液器的準(zhǔn)確性，移液器必須

3、定期進(jìn)行校準(zhǔn)。3. 瓊脂糖凝膠制作 選擇好膠盒、膠板和梳子，洗凈，把膠板放入膠盒中，梳子插上。 量取25ml 1TBE溶液放入錐形瓶或燒杯中 稱量0.25g 瓊脂糖，倒入錐形瓶中 將錐形瓶放入微波爐中，讓溶液沸騰2-3次，瓊脂糖徹底融化 錐形瓶取出，稍稍冷卻后倒入膠盒中 等待瓊脂糖冷卻凝固形成點(diǎn)樣孔后即可掌握酚氯仿法提取的原理和操作。掌握酚氯仿法提取的原理和操作。 生物的大部分或幾乎全部都集中在細(xì)胞核或類核中。DNA在體內(nèi)通常都與蛋白質(zhì)結(jié)合，蛋白質(zhì)對(duì)DNA制品的污染常影響到以后的DNA操作過程，因此需把蛋白質(zhì)除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿對(duì)蛋白質(zhì)有極強(qiáng)的變性作用，而對(duì)DNA無影響。經(jīng)苯

4、酚、氯仿抽提后，蛋白質(zhì)變性而被離心沉降到酚相與水相的界面，DNA則留在水相，少量的或與DNA緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA無影響，必要時(shí)可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。 消化緩沖液: TE 、EDTA、 NaCl、 SDS、蛋白酶KTris平衡酚、氯仿:異戊醇(24:1)，NaAc，無水乙醇，70%乙醇 微量移液器、高速離心機(jī)、1.5ml管、吸頭、烘箱、水浴鍋、1.5ml管架、膠頭滴管、冰箱、切取組織 ，剪碎放入研缽(越細(xì)越好)，磨成粉末。以消化緩沖液處理55水浴過夜，獲得組織消化液。、取出消化組織液，5000rpm，min，取上清液于新離心管 。

5、、 加等體積ris-平衡酚，輕輕混勻min。4、1000rpm，10min，留上清，取上清液于新離心管 。、加等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提，輕輕混勻min。、同。、加等體積氯仿:異戊醇，輕輕混勻min。、同。、加1/10體積3mol/LNaAc，及.倍體積預(yù)冷（）無水乙醇，混勻。 沉淀min。、12000rpm，15min，棄上清。、加70%乙醇1ml，混勻。、 同。、管放置于烘箱中烘干。、加ul TE或ddH2O溶解。、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。提取染色體的基本原理是什么？操作中應(yīng)該注意什么？、學(xué)習(xí)擴(kuò)增的基本原理。、學(xué)習(xí)擴(kuò)增的基本原理。、掌握技術(shù)的常規(guī)操作。、掌握技術(shù)的常規(guī)操作。、

6、了解擴(kuò)增的參數(shù)設(shè)計(jì)。、了解擴(kuò)增的參數(shù)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三擴(kuò)增擴(kuò)增、聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase chain reaction，PCR)：利用核酸變、復(fù)性的性質(zhì)，以待擴(kuò)增的為模板，在體外由引物介導(dǎo)的酶促合成特異片段的過程。、反應(yīng)體系引物、dNTP、 Mg 、模板、 Taq DNA聚合酶， Buffer。、循環(huán)參數(shù) 9 5min 9 30s 5 30s 72 30s goto times 72 10min Taq DNA聚合酶，PCR緩沖液， MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE電泳緩沖液，EB,加樣緩沖液旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，0.2ml PCR微量離心管，

7、PCR儀，臺(tái)式離心機(jī)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，紫外凝膠成像系統(tǒng)、在0.2ml PCR 微量離心管中配制30ul反應(yīng)體系。 dd water 20.5ul 10PCR buffer（不含MgCl2） 3ul 25mM MgCl2 2ul 10mmol/L dNTP 1ul 10mol/L Primer 1 1ul 10mol/L primer 2 1ul 模板 1ulTaq酶 0.5ul 總體積 30ul、在離心機(jī)中混勻。、管放入儀中，按照原理中的條件設(shè)置程序，進(jìn)行反應(yīng)。、PCR結(jié)束后，取3ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 PCR中產(chǎn)生非特異性條帶的原因可能有哪些？實(shí)驗(yàn)四 凝膠電泳法回收目的

8、DNA及其體外連接1. 學(xué)習(xí)和掌握從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的方法。2. 掌握DNA體外連接的方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中的電泳速率與以下因素有關(guān)DNA分子大小DNA分子構(gòu)象瓊脂糖凝膠濃度電泳所用電壓電泳緩沖液2. 利用硅膠膜在高鹽濃度時(shí)能特異性吸附DNA，而在低鹽濃度時(shí)可使DNA被洗脫的原理純化DNA。3. Taq酶參與PCR反應(yīng)中，產(chǎn)物雙鏈核酸中的3端各多連接一個(gè)脫氧腺苷酸A，與商業(yè)開發(fā)的pMD18-T載體可在DNA連接酶作用下，按照堿基配對(duì)形成環(huán)狀的完整質(zhì)粒。凝膠電泳系統(tǒng)，刀片，紫外儀，酒精燈1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65 水浴鍋PCR產(chǎn)物，1TBE，加樣緩沖液，Ta

9、kaRa膠回收試劑盒，TA克隆試劑盒，DL2000 marker1. 2%瓊脂糖凝膠電泳2. 在紫外燈下用干凈的手術(shù)刀割下含有目的DNA瓊脂糖塊裝在1.5ml的EP管中稱量減1克即為凝膠塊重量3. 加入5個(gè)凝膠體積量的DR- Buffer 4. 混勻 65加熱融化凝膠塊5. 加入DR-Buffer量的1/2 體積的DR- Buffer, 當(dāng)目的片段小于400bp再加入終濃度為20% 的異丙醇6. 將上述溶液short后轉(zhuǎn)移至spin coloumn中12000rpm, 1min 棄濾液7. 加入500ul RinseA 12000rpm 30s 棄濾液8. 加入700ul RinseB 120

10、00rpm 30s棄濾液9. 同810. 將spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%膠檢測(cè)11. 鏈接反應(yīng)（冰上操作）在一支0.2 ml EP管中加入以下試劑：純化的目的DNA片段 4.5ulVector 0.5ul連接液 5ul 混勻 16連接過夜為什么連接反應(yīng)的溫度要定在16度？實(shí)驗(yàn)五 感受態(tài)細(xì)胞的制備掌握感受態(tài)細(xì)胞的制備方法2. 學(xué)習(xí)和理解影響細(xì)胞感受態(tài)的因素 感受態(tài)是指受體（或者宿主）細(xì)胞最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種

11、生理狀態(tài)，它是有受體菌的遺傳性所決定的。轉(zhuǎn)化過程中所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，既不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。用Cacl2處理受體細(xì)胞，使細(xì)胞的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。 培養(yǎng)皿，離心管，冷凍高速離心機(jī)，超低溫冰箱，搖床，錐形瓶 Cacl2， LB Amp-液體培養(yǎng)基， LB Amp-固體培養(yǎng)基，DH5甘油菌1.先從保存菌種DH52(-70),劃線培16h(37)2.從平板中挑取一個(gè)單菌落移到4ml，LB Amp- 培養(yǎng)基中，37搖蕩過夜180250rpm3.按1%的接種量將過夜培養(yǎng)的菌轉(zhuǎn)接于50ml LB Amp-的培養(yǎng)基中，

12、37，250rpm（2h2.5h）4.當(dāng)培養(yǎng)菌生長(zhǎng)至OD600達(dá)0.50.6時(shí)（約22.5h），將培養(yǎng)菌取出，在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至50ml無菌聚乙烯離心管中，冰浴10min，以使培養(yǎng)液冷至05.4，5000rpm/min,7min6.細(xì)胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重懸于4，5000rpm/min，5min7.細(xì)胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重懸冰上放置30min， 于4，5000rpm/min，5min8.用2ml冰冷Cacl2溶液重懸各管細(xì)胞，然后按每管100ul的量分裝于預(yù)冷的0.5ml EP管中存于-70 如果實(shí)驗(yàn)對(duì)照組本不該長(zhǎng)菌落的平板上長(zhǎng)出了一些菌落，你將如何解釋這

13、種想象？實(shí)驗(yàn)六 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 掌握重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法1.轉(zhuǎn)化是將外源DNA 分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。2.化學(xué)轉(zhuǎn)化法 利用Cacl2處理感受態(tài)受體細(xì)胞，然后通過熱休克處理，即置于42高溫?zé)峒?0s，熱休克后，是受體菌在不含抗生素的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)至少半小時(shí)以上，使其表達(dá)足夠蛋白質(zhì)，以便能在含抗生素的平板上生長(zhǎng)菌落。 水浴鍋，培養(yǎng)箱，槍頭，冰盒，超凈臺(tái)，微量加樣器，制冰機(jī)，牙簽 DH5感受態(tài)細(xì)胞，連接產(chǎn)物，LB Amp-液體培養(yǎng)基， LB Amp+液體培養(yǎng)基，LB Amp+ 培養(yǎng)基平板1.5ul連接液加100ul感受態(tài)細(xì)胞（-70取出），置冰上，加后輕輕旋動(dòng)2.冰上靜置30

14、min3.42水浴90s熱休克，冰上3min4.加10ul LB （Amp-）至菌液，混勻（顛倒）5.37烘箱30min6.37，搖床 30min 180rpm7.涂平板 100ul/板， 37培養(yǎng)1216h8.挑克隆 挑取菌落接入5ml LB Amp+液體培養(yǎng)基中，37 振蕩過夜 當(dāng)質(zhì)粒加入宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，再涂布在含有Amp的LB培養(yǎng)基平板前，為什么要在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h?實(shí)驗(yàn)七 質(zhì)粒的提取1.學(xué)習(xí)質(zhì)粒DNA提取的基本原理2.掌握質(zhì)粒最常用提取方法 細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取是根據(jù)環(huán)狀質(zhì)粒DNA分子具有相對(duì)分子質(zhì)量較小、易于復(fù)性的特點(diǎn)進(jìn)行的，堿法是常用的提取方法。在熱或堿性條件下DNA分子雙鏈

15、解開，若此時(shí)將溶液置于復(fù)性條件，由于變性的質(zhì)粒分子能在較短的時(shí)間內(nèi)復(fù)性而染色體DNA不能復(fù)性，從而分離質(zhì)粒DNA。高速離心機(jī)、微量移液器、槍頭、凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠紫外成像系統(tǒng)，EP管EB，加樣緩沖液，陽性克隆的培養(yǎng)液，質(zhì)粒提取試劑盒1. 取14ml過夜培養(yǎng)的陽性克隆菌液，12000rpm離心2min,棄上清2.用250ul的solution(含RNaseA1)充分懸浮細(xì)菌沉淀3.加入250ul的solution輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合56次使菌體充分裂解，形成透明溶液4.加入400ul的4 預(yù)冷的solution，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合56次，直至形成緊實(shí)凝集塊，室溫靜置2min5.室溫12000rpm，

16、10min，取上清6.將試劑盒中的Spin column安置于collection Tube上7.將操作6中的上清液轉(zhuǎn)移至Spin column中12000rpm， 1min，棄濾液8.將500ul的RinseA加入Spin column中， 12000rpm，30s，棄濾液9.加700ul的RinseB加入Spin column中， 12000rpm，30s，棄濾液10.同911.將Spin column安置于新的1.5ml離心管上,在Spin column膜中央處加入60ul滅菌或Elution Buffer,室溫靜置1min12. 12000rpm， 1min洗脫DNA13.凝膠電泳檢測(cè)

17、提取效果，并以空載體做對(duì)照，從質(zhì)粒大小上初步判斷是否有外源基因進(jìn)入載體在堿法提取質(zhì)粒DNA操作過程中應(yīng)該注意哪些問題？實(shí)驗(yàn)八 重組質(zhì)粒的酶切鑒定1.學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性2.了解重組質(zhì)粒的鑒定方法，重點(diǎn)掌握重組質(zhì)粒的酶切鑒定方法1.限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶不僅是DNA重組中重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定2. 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素DNA的純度；DNA的甲基化程度；酶切消化反應(yīng)的溫度；DNA的分子結(jié)構(gòu)；溶液中離子濃度及種類；緩沖液的 pH值。三、實(shí)驗(yàn)用品及試劑三、實(shí)驗(yàn)用品及試劑恒溫水浴鍋、微量加樣器、槍頭、凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)酶Hind Hind III III 和和 BamH BamH I I 核酸內(nèi)切酶（核酸內(nèi)切酶（TakaraTakara）， Hind Hind IIIIII和 BamH BamH I I酶解