COX2及VEGF在乳腺癌中的表達及臨床意義

1、COX-2及VEGF在乳腺癌中的表達及臨床意義 作者：曹飛麟，朱敏，謝伯劍，甘梅富，潘 印，徐 東，周申康，畢鐵男【摘要】 目的 探討環(huán)氧化酶2(COX-2)及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在乳腺癌中的表達及其臨床意義。方法 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，檢測了96例乳腺癌患者癌組織及癌旁組織中COX-2和VEGF的表達。結(jié)果 COX-2 mRNA和VEGF mRNA分別在87.50%和83.33乳腺癌組織中表達，而僅在16.67%和31.25%癌旁組織中表達，癌組織與癌旁組織COX-2 mRNA和VEGF mRNA的表達差異有顯著意義。結(jié)論 COX-2 mRNA、VEGF mRNA

2、在乳腺癌組織中明顯增高。COX-2的表達同VEGF的表達密切相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 乳腺腫瘤 The Expression of Cyclooxygenase-2 and VEGF in Breast Cancer and Its Significance Abstract: Purpose To investigate the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2), vascular endothelial growth factor (VEGF) in breast cancer and its clinical significance. Method

3、s The expression of COX-2 and VEGF in 96 cases of breast cancer tissues and cancer adjacent tissues were detected by reverse transcription-PCR. Results Expression of COX-2 mRNA and VEGF mRNA was 87.50% and 83.33% in breast cancer tissues; 16.67% and 31.25% in cancer adjacent tissues respectively. Th

4、e expression of COX-2 mRNA and VEGF mRNA was significantly different between cancer tissue and cancers adjacent tissue. Conclusion Expression of COX-2 and VEGF mRNA in breast cancer is significantly increased. Expression of COX-2 is closely correlated with expression of VEGF .2 / 12 Key words: breas

5、t neoplasms; cyclooxygenase-2; VEGF; reverse transcription polymerase chain reaction 環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一種多功能的蛋白質(zhì)，在多種惡性腫瘤組織中，COX-2的表達增高,它與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我們采用RT-PCR和免疫組化法檢測了96例乳腺癌組織中COX-2和VEGF的表達，探討COX-2、VEGF在乳腺癌中的表達情況及其相關(guān)性，以及COX-2選擇性抑制劑用于乳腺癌高危人群化學(xué)預(yù)防和治療的可能性。 1 材料與方法 1.1 研究對象 收集臺州醫(yī)院腫瘤外科2002年

6、12月至2003年5月因患乳腺癌行根治性手術(shù)并經(jīng)病理證實的腫瘤標(biāo)本及配對的癌旁組織96例。同時留取石蠟標(biāo)本，行HE及免疫組織化學(xué)染色。年齡2358歲，平均42.5歲。組織類型：浸潤性導(dǎo)管癌80例，髓樣癌8例，黏液腺癌4例，導(dǎo)管內(nèi)癌4例。腫瘤分期：期76例，期20例。 1.2 主要試劑 TRIzol (Invitrogen公司)，M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶抑制劑(MBI，F(xiàn)erments)，Taq酶（Generay公司）COX-2、VEGF、-actin引物(上海生物工程公司合成)；鼠抗人COX-2蛋白及VEGF抗體的單克隆抗體購自福建生物技術(shù)有限公司；COX-2擴增產(chǎn)物為488bp，上游引

7、物: 5-TCAAGTCCCTGAGCATCTAC-3；下游引物:5-CATTCCTACCACCAGCAACC-3；VEGF引物序列：上游引物：5-GCTCTACCTCCACCATGCCA-3；下游引物：5-AGCTCATCTCTCCTATGTGC-3，-肌動蛋白擴增產(chǎn)物為619bp，上游引物:5-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3；下游引物:5-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3。 1.3 實驗方法 RT-PCR檢測COX-2 mRNA及VEGF mRNA表達：(1)提取 RNA：取新鮮乳腺癌組織50mg100mg在液氮中速凍，玻璃勻漿器中徹底勻漿，按Trizol試劑盒說

8、明書裂解抽提總RNA，異丙醇沉淀，溶于DEPC水。紫外分光光度計測定A260/280比值均在1.752.0范圍之內(nèi)。(2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：各取2g總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MULV催化合成cDNA，再取cDNA0.1g作VEGF和COX-2的PCR擴增。（3）檢測COX-2 mRNA表達：以同一cDNA為模板，在25l反應(yīng)體系內(nèi)擴增COX-2和-肌動蛋白。循環(huán)條件：95 2min,94 45s，53.245min，72 1min，循環(huán)35次。最后72延伸10min。取5l PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，EB（溴化乙啶）染色，凝膠成像分析。檢測VEGF mRNA表達：循環(huán)條件:95 2min

9、，94 45s，51.5 45min，72 1min，循環(huán)35次。最后72延伸10min。取5l PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，EB（溴化乙啶）染色，凝膠成像分析。 免疫組化染色及結(jié)果判斷：采用免疫組SP法，按說明書操作。病理組織切片我院兩位病理學(xué)專家閱片作出病理診斷。 RT-PCR結(jié)果判定：PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，EB（溴化乙啶）染色，并用標(biāo)準(zhǔn)PCR Marker Ladder對照，電泳后凝膠成像分析。陽性結(jié)果為：在488bp（COX-2 mRNA）和619bp（-actin）和320bp（VEGF mRNA）處出現(xiàn)條帶。 1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用卡方檢驗和四格表確切概率法。檢驗標(biāo)

10、準(zhǔn)=0.05。 2 結(jié) 果 2.1 COX-2和VEGF mRNA及其蛋白表達情況 96例癌組織中有84例檢測到了COX-2 mRNA的表達，陽性率是87.50%；而癌旁組織中只有16例COX-2 mRNA的表達，陽性率為16.67%。兩者比較差異有顯著性。COX-2的表達位于乳腺腫瘤上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，54.17%的腫瘤組織見陽性染色（見圖1）。6.25%(6/96)的癌旁組織見不同程度的陽性染色，兩者比較差異有顯著性，見表1。VEGF mRNA在乳腺癌中陽性率是83.33%(80/96)，而在癌旁組織中陽性率是31.25%(30/96)，兩者比較差異有顯著性；VEGF的表達位于乳腺腫瘤上皮細(xì)

11、胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，75.0%（72/96）乳腺癌中存在VEGF陽性表達（圖2），與癌旁組織（25.0%，24/96）相比差異有顯著性（表1）。 2.2 COX-2 與VEGF mRNA及其蛋白在乳腺癌組織中表達的相互關(guān)系 COX-2 mRNA及其蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達與VEGF mRNA及其蛋白的陽性表達呈正相關(guān)（P<0.05），COX-2 mRNA及其蛋白的陽性表達水平越高，其相應(yīng)的VEGF mRNA及其蛋白的陽性也越高。見表2、3。 3 討 論 COX-2是前列腺素合成過程中重要的限速酶。COX-2表達與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和血管形成密切相關(guān)1。目前一系列研究發(fā)現(xiàn)CO

12、X-2在人的很多癌前病變和惡性腫瘤中高表達，如胃腸上皮化生、Bareet食管、胃癌、結(jié)腸癌、食管癌、肝癌、膀胱癌、口腔癌和非小細(xì)胞癌、前列腺癌、鼻咽癌和乳腺癌等。COX-2選擇性抑制劑能抑制大鼠乳腺腫瘤的發(fā)生。Liu等在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)過度表達COX-2的乳腺上皮細(xì)胞可發(fā)生癌變，表明COX-2的過度表達足以誘導(dǎo)乳腺腫瘤的發(fā)生，因此，進一步探討COX-2在人乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。本研究顯示，87.5乳腺癌COX-2 mRNA表達，54.2%COX-2蛋白呈陽性表達，而在癌旁組織中僅有16.67可檢出COX-2 mRNA表達，6.25COX-2蛋白呈陽性表達；兩者比較差異有顯著性

13、，提示COX-2在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。COX-2的作用產(chǎn)物前列腺素可以促進腫瘤的新生血管生成，刺激腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，抑制機體的免疫反應(yīng)。 血管的生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前已知的刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的因子有VEGF、BFGF、PDGF等，其中血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)是一種高度特異性的有絲分裂原，能直接刺激新生血管的形成；被公認(rèn)為是最重要和最強的促血管生成因子。同時VEGF也是一種血管通透性誘導(dǎo)因子，可增加微靜脈和小靜脈的通透性，是已知最強的血管通透劑。Anthony等通過原位雜交法檢測46例乳腺癌活檢標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的VEG

14、F表達與組織分化、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與乳腺癌的MVD呈顯著性相關(guān)，VEGF蛋白在乳腺癌中高表達提示乳腺癌形成過程中伴隨VEGF的高分泌，VEGF與乳腺癌的發(fā)生及生長有關(guān)。淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生也有賴于原發(fā)腫瘤新生血管的形成。我們在乳癌腺組織中也檢測到VEGF蛋白和VEGF mRNA都有高表達，其陽性率分別為75%和83.33，明顯高于癌旁正常組織，同以往報道相符。 郭貴龍等2研究發(fā)現(xiàn)COX-2的表達與MVD明顯正相關(guān)，表明COX-2可以促進腫瘤新生血管的形成。機制可概括如下：誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生VEGF；腫瘤組織產(chǎn)生的PGE2，PGF2及TXA2等直接或間接促進血管生成；促使基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）表達

15、激活血管生成素；刺激Bcl-2的表達來抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進血管生成；缺氧誘導(dǎo)COX-2促進腫瘤血管的形成。我們研究發(fā)現(xiàn)COX-2和VEGF表達明顯相關(guān)，過度表達COX-2的乳腺癌細(xì)胞可能誘導(dǎo)VEGF產(chǎn)生，從而促進腫瘤新生血管的形成。本研究中乳腺癌組織中的COX-2表達與VEGF的表達呈正相關(guān)，提示COX-2參與血管形成，可能與誘導(dǎo)VEGF的表達有關(guān)。因此，在乳腺癌中COX-2和VEGF共同參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。 目前發(fā)現(xiàn)人類多種惡性腫瘤及癌前病變組織中有高表達的COX-2，且陽性率較高，這為腫瘤的化學(xué)預(yù)防和治療提供了新的思路和模式，學(xué)者們對NSAIDS用于化學(xué)預(yù)防乳腺癌也產(chǎn)生了極大的

16、興趣。研究表明連續(xù)5年每日口服阿司匹林、優(yōu)布芬，乳腺癌的發(fā)生率下降約40%50%。Harris等3研究發(fā)現(xiàn)選擇性COX-2抑制劑celecoxib可以明顯延遲大鼠DMBA誘導(dǎo)的乳腺癌發(fā)生，并且較非選擇性COX-2抑制劑優(yōu)布芬更為有效。目前，抗血管生成藥物Bevacizumab已被美國FDA批準(zhǔn)用作轉(zhuǎn)移性直腸癌的一線治療藥物，F(xiàn)airooz F等在聯(lián)合使用Bevacizumab治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌后證實反應(yīng)率、生存率及平均壽命延長均較單獨使用Fluorouracil有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，進一步探討COX-2和VEGF在人乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其兩者間具體的作用機制具有重要意義，或許應(yīng)用COX-2抑制劑或用VEGF抗體將有望成為預(yù)防與治療乳腺癌的新方法?！緟⒖嘉墨I】 1 Ali-Fehmi R, Morris RT, Bandyopadhyay S, et al. Expression of cyclooxygenase-2 in advanced stage ovarian serous carcinoma: Correlation with tumor cell proliferation, apoptosis, angiogenesis, and survivalJ. Am J Obstet