藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過(guò)程控制

1、中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所馬仕洪馬仕洪2010年年5月月26日日 上海上海web site: e-mail: tel地址：北京市天壇西里地址：北京市天壇西里2 2號(hào)號(hào) 郵編：郵編：100050100050 中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所2 2l藥品因素l環(huán)境影響l培養(yǎng)觀察l抽樣檢查l破壞試驗(yàn)方法驗(yàn)證過(guò)程控制中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所3 3無(wú)菌無(wú)菌/ /微生物限度檢查理念微生物限度檢查理念環(huán)境保證環(huán)境保證培養(yǎng)基保證培養(yǎng)基保證無(wú)菌性檢查無(wú)菌性檢查靈敏度檢查靈敏度檢查有效的方法有效的方法方法驗(yàn)證方法驗(yàn)證SOP操作操作有效的

2、結(jié)果有效的結(jié)果可靠的結(jié)論可靠的結(jié)論結(jié)果判斷結(jié)果判斷中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所4 4微生物檢查的過(guò)程控制微生物檢查的過(guò)程控制l 一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施（硬件物質(zhì)保障）l 二、檢驗(yàn)程序（軟件有效的結(jié)果）l 三、結(jié)果判斷（調(diào)查可靠的結(jié)論）中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所5 5一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施l 實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)l 操作環(huán)境l 關(guān)鍵設(shè)備l 對(duì)照培養(yǎng)基物 質(zhì) 保 障中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所6 6（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)潔凈實(shí)驗(yàn)條件潔凈實(shí)驗(yàn)條件l 有效性：有效性：整體10000級(jí)、局部100級(jí)。l 安全性：安全性：保護(hù)樣品、人員和環(huán)境。l 可操作性：可操作性：方便

3、、快捷、順暢。潔凈實(shí)驗(yàn)條件的維護(hù)、驗(yàn)證潔凈實(shí)驗(yàn)條件的維護(hù)、驗(yàn)證陽(yáng)性菌實(shí)驗(yàn)室達(dá)到陽(yáng)性菌實(shí)驗(yàn)室達(dá)到P2P2生物安全標(biāo)準(zhǔn)生物安全標(biāo)準(zhǔn)中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所7 7實(shí)驗(yàn)室改造示例：原布局圖 擬定布局圖 建議布局圖1 建議布局圖2實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)中檢所微生物實(shí)驗(yàn)室中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所8 8（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的管理與維護(hù)：1、屏障系統(tǒng)的有效性 壓差、風(fēng)速、微粒、照度 （外包服務(wù)合同）2、清潔、靜態(tài)與動(dòng)態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫(kù) 酒精棉球分離微生物 新潔爾滅分離微生物中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所9 9環(huán)境菌庫(kù)潔凈環(huán)境常見(jiàn)菌（浮游菌）：l 頭狀葡萄

4、球菌（Staphylococcuscapitis）l 溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）l 緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis）l 科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）l 藤黃微球菌（Micrococcusluteus）中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所1010（二）、操作環(huán)境l 1、隔離器l 2、生物安全柜l 3、超凈工作臺(tái)中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所1111（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員安全環(huán)境要求點(diǎn)評(píng)隔離器？驗(yàn)證困難，滅菌不徹底：假陽(yáng)性 滅菌劑殘留：假陰性生物安全柜？動(dòng)態(tài)驗(yàn)證困難，不適合多任務(wù)

5、的檢驗(yàn)活動(dòng)超凈工作臺(tái)經(jīng)典、廉價(jià)、適合多任務(wù)的檢驗(yàn)活動(dòng)。提高實(shí)驗(yàn)室新風(fēng)供給、加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)控可以揚(yáng)長(zhǎng)避短中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所1212搽拭實(shí)驗(yàn)菌株菌液計(jì)數(shù)回收計(jì)數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7%金黃色葡萄球菌646093.8%菌液稀釋、分液的誤差為：5.5%表面搽拭操作的回收率大于 99%中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所1313（三）、關(guān)鍵設(shè)備 微生物檢查薄膜過(guò)濾儀微生物檢查薄膜過(guò)濾儀 一次性薄膜過(guò)濾培養(yǎng)器一次性薄膜過(guò)濾培養(yǎng)器應(yīng)急檢驗(yàn)用一次性薄膜過(guò)濾培養(yǎng)器應(yīng)急檢驗(yàn)用一次性薄膜過(guò)濾培養(yǎng)器中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所1414（四）、對(duì)照培養(yǎng)基 培養(yǎng)基

6、適用性（靈敏度）； 培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（標(biāo)準(zhǔn)化）。對(duì)照培養(yǎng)基理化評(píng)價(jià)（可控性）生物學(xué)評(píng)價(jià)（有效性）回收率比較MPN比較生長(zhǎng)曲線比較生態(tài)評(píng)價(jià)某些CRS原則固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基瓊脂加減法中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所1515二、檢驗(yàn)程序環(huán)境保證環(huán)境保證培養(yǎng)基保證培養(yǎng)基保證無(wú)菌性檢查無(wú)菌性檢查靈敏度檢查靈敏度檢查有效的方法有效的方法方法驗(yàn)證方法驗(yàn)證SOP操作操作有效的結(jié)果有效的結(jié)果可靠的結(jié)論可靠的結(jié)論結(jié)果判斷結(jié)果判斷中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所1616二、檢驗(yàn)程序l 接受任務(wù)l 實(shí)驗(yàn)方案l 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備l 樣品核對(duì)l 實(shí)驗(yàn)操作l 過(guò)程監(jiān)控l 培養(yǎng)觀察有效的結(jié)果物 質(zhì) 保 障中

7、國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所1717實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范（軟件）實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系中檢所抗生素室微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系l編寫說(shuō)明及批準(zhǔn)頁(yè)l1 實(shí)驗(yàn)室概況l1.1 實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)介 l1.2 實(shí)驗(yàn)室通訊資料 l1.3 實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可項(xiàng)目/參數(shù)表l1.4 實(shí)驗(yàn)室平面圖及功能區(qū)域 l1.5 儀器設(shè)備總覽l1.6 常備試劑耗材一覽表l1.7 實(shí)驗(yàn)室發(fā)展目標(biāo)l2 管理規(guī)范l2.1 安全管理l2.2 業(yè)務(wù)流程l2.3 人員管理（6個(gè)SOP）l2.4 樣品管理（3個(gè)SOP）l3 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程l3.1 檢驗(yàn)工作SOP（13個(gè)）l3.2 儀器操作SOP（30個(gè)）l3.3

8、 實(shí)驗(yàn)記錄SOP（9個(gè)）l4 實(shí)驗(yàn)室保障l4.1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、設(shè)備及消耗品供應(yīng)商確定原則l4.2 實(shí)驗(yàn)室設(shè)施服務(wù)商l4.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備供應(yīng)商l4.4 實(shí)驗(yàn)室消耗品供應(yīng)商中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所1818（一）、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備l 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備應(yīng)堅(jiān)持“平戰(zhàn)結(jié)合”，物質(zhì)準(zhǔn)備有備無(wú)患，應(yīng)隨時(shí)保證“來(lái)之能戰(zhàn)” 。l 尤其注意常備有效期要求的物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實(shí)驗(yàn)器材等。中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所1919實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備無(wú)菌室專用酒精棉球制備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備場(chǎng)地清潔實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備臺(tái)面清潔中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所2020（二）、樣品核對(duì)l 盡快取得樣品，確保樣品傳遞過(guò)程中

9、的完整性、安全性、有效性；l 仔細(xì)核對(duì)樣品及樣品資料，高度關(guān)注媒體公布樣品（問(wèn)題樣品），同時(shí)盡量獲取非問(wèn)題樣品及同類樣品，進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)、比較分析；l 樣品外觀檢查、完整性檢查。中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所2121樣品外觀檢查欣弗樣品外觀檢查刺五加樣品外觀檢查雙黃連樣品完整性真空檢漏中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所2222（三）、實(shí)驗(yàn)操作l 不斷完善標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP），嚴(yán)格避免實(shí)驗(yàn)室污染。實(shí)驗(yàn)人員實(shí)驗(yàn)人員 培養(yǎng)基培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)環(huán)境實(shí)驗(yàn)環(huán)境檢驗(yàn)結(jié)果檢驗(yàn)結(jié)果待檢樣品待檢樣品原料原料 輔料輔料 設(shè)備設(shè)備環(huán)境環(huán)境藥品（食品）藥品（食品）人員人員 藥品食品生產(chǎn)

10、過(guò)程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)藥品食品微生物檢查過(guò)程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所2323實(shí)驗(yàn)操作物料進(jìn)場(chǎng)消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風(fēng)淋、紫外照射）雙層無(wú)菌包裝核心區(qū)外圍實(shí)驗(yàn)操作人員進(jìn)場(chǎng)一更二更核心操作區(qū)實(shí)驗(yàn)操作無(wú)菌操作技術(shù)中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所2424（四）、實(shí)驗(yàn)過(guò)程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控?zé)o菌檢驗(yàn)框架示意圖無(wú)菌檢驗(yàn)框架示意圖中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所2525三、結(jié)果判斷l(xiāng) 長(zhǎng)菌與否l 分離鑒定l 溯源調(diào)查l 結(jié)果報(bào)告可靠的結(jié)論有效的結(jié)果物 質(zhì) 保 障中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所2626

11、三、結(jié)果判斷 是不是微生物？ 是什么微生物？ 微生物來(lái)自哪里？ 幾點(diǎn)思考 參見(jiàn)：FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗(yàn)潔凈室環(huán)境菌的相似性考 察藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（11）：11891194 判斷無(wú)菌檢查陽(yáng)性結(jié)果有效性的實(shí)驗(yàn)探討藥物分析雜志， 2008， 28（05）：6671 中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所27271、長(zhǎng)菌與否？l 渾不渾濁?l 物理變化、化學(xué)變化還是生物變化？一靠經(jīng)驗(yàn)二靠實(shí)驗(yàn)三靠嚴(yán)格程序控制避免干擾中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所2828是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁 物理變化？化學(xué)變化？生物學(xué)變化？（2）、平板上的菌落 瓊脂表面、瓊脂

12、中、瓊脂和平皿夾層 菌落or藥渣？中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所2929菌落or藥渣？l經(jīng)經(jīng)6060CoCo射線大劑量照射再檢驗(yàn)射線大劑量照射再檢驗(yàn)l延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到7 7天天l重新劃線培養(yǎng)重新劃線培養(yǎng)l鏡檢鏡檢中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所30302、分離鑒定l （1）立即轉(zhuǎn)接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；l （2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80保存；l （3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；l （4）如果發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應(yīng)增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌

13、落應(yīng)進(jìn)一步鑒定，并逐一保藏。中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所3131是什么微生物？宏觀：生長(zhǎng)形態(tài)微觀：鏡檢鑒定：生化鑒定（API、BD） 核酸鑒定（16sRNA、DNA） 中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所32323、溯源調(diào)查l 樣品陽(yáng)性培養(yǎng)物分離菌株l 檢驗(yàn)過(guò)程監(jiān)控菌株l 環(huán)境菌（近期、遠(yuǎn)期）l 現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查收集菌株鑒定與相似性分析相結(jié)合傳統(tǒng)方法與新技術(shù)相結(jié)合不同方法的交叉驗(yàn)證中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所3333微生物來(lái)自哪里？ 相似性分析 同源性分析 脈沖場(chǎng)電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR） 中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所3434Sam

14、ple Preparation Automated measurement after drying of the samples!2. Suspending1. Harvesting3. LoadingFT-IR Spektrum of microorganisms圖圖 不同來(lái)源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關(guān)系不同來(lái)源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關(guān)系中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所3535The Infrared Spectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercell wallcapsulesDNA, RNAflagellates, pilir

15、ibosomevacuoles .FT-IR spectrum is a fingerprint of the cellsBiochemical Structure of Cells中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所3636中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所3737溯源性分析例溯源性分析例1 1欣弗事件欣弗事件 圖圖29 欣弗培養(yǎng)物欣弗培養(yǎng)物圖30 欣弗培養(yǎng)物分離菌株鏡檢中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所3838編號(hào)濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定0206L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp

16、pneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）0206G渾濁，劇烈產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）0112G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長(zhǎng)鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）0104L顆粒狀懸浮物，振搖能散G+長(zhǎng)鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）298L；298G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Se

17、rratia marcescens）303L；303G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）305L；305G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）306L；306G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）307

18、G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）308L渾濁（Alcaligenes faecalis）308G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長(zhǎng)鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）309L渾濁（Alcaligenes faecalis）309G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長(zhǎng)鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）304G渾濁G-桿菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所3939溯源性分析例溯源性分析例1 1欣弗事件欣弗事件 頭狀葡萄球菌頭狀亞種頭狀葡萄球菌頭狀亞種

19、（Staphylococcuscapitissspcapitis）溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）緩癥鏈球菌緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌科氏亞種科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcuscohniisspcohnii）藤黃微球菌藤黃微球菌（Micrococcusluteus）溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）。監(jiān)測(cè)到的環(huán)境菌株監(jiān)測(cè)到的環(huán)境菌株中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所4040溯源性分析例溯源性分析例2 2編號(hào)BD鑒定鑒定走廊1B.pumilu

20、s 走廊2M.luteus 走廊3/無(wú)菌室4C.urealyticum 無(wú)菌室5K.kristinae 無(wú)菌室6C.urealyticumC1524-FS.caprae C1524-BS.caprae C1525-B1-1S.warneri C1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidis C1526-F2S.haemolytic

21、us菌株16sRNA鑒定鑒定可信度C1524-FS. haemolyticus99%C1524-BS. haemolyticus98%C1526-F2S. haemolyticus100% 雙黃連注射液雙黃連注射液 利巴韋林注射液利巴韋林注射液 FTIR FTIR相似性分析相似性分析 DuPont RiboPrinter DuPont RiboPrinter基因指紋分析基因指紋分析中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所4141幾點(diǎn)思考（1）、怎樣才算是同一株菌？ 需要深入認(rèn)識(shí)微生物本身 微生物變異與保守的相對(duì)性； 分析方法的可變性與微生物本身的可變性；生物學(xué)先鋒琳恩馬古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果將一個(gè)特殊的質(zhì)粒植入大腸桿菌，大腸桿菌便會(huì)突然間變成克雷伯氏桿菌”。 中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所4242幾點(diǎn)思考（2）、什么是最適宜的技術(shù)？ 需要深入認(rèn)識(shí)分析微生物的技術(shù)和手段 形態(tài)學(xué)分析與相似性分析（生化反應(yīng)譜、片段相似性、FTIR光譜相似性