細(xì)胞內(nèi)因子的流式檢測

1、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式檢測基本概念基本概念 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色是用抗細(xì)胞因子抗體與細(xì)胞表面或胞內(nèi)特定亞群標(biāo)志組合，即可檢測不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的分泌。 Th1Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞分泌IFN-gIFN-g、IL-2IL-2、TNF-aTNF-a Th2 Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞分泌IL-4;IL-5;IL-10IL-4;IL-5;IL-10技術(shù)優(yōu)勢技術(shù)優(yōu)勢 快速快速：流式定量檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子可在一天內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)流程需6-8小時，實(shí)際操作時間為1-2小時，快速簡便 簡便簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMC 靈敏度高靈敏度高：高度靈敏的熒光標(biāo)記與檢測系統(tǒng) 高效高效：可以

2、在同一個細(xì)胞內(nèi)同時檢測兩種或更多種細(xì)胞因子，也可根據(jù)細(xì)胞免疫表型區(qū)分分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞的亞型，進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析 安全安全：減少樣本處理與生物源性污染 接近生物體的分析條件接近生物體的分析條件：全血檢測保留細(xì)胞及生化微環(huán)境更準(zhǔn)確反映了體內(nèi)狀況所需試劑所需試劑1 1、細(xì)胞表面染色用的熒光標(biāo)記的單抗試劑、細(xì)胞表面染色用的熒光標(biāo)記的單抗試劑 如CD3、CD4、CD8、CD25等 2 2、熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體：、熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體： 如IFN-g、TNF-a、IL-2、IL-4等3 3、溶血素：、溶血素：裂解紅細(xì)胞4 4、激活劑：、激活劑： 如PMA、Ionomycin，可以刺激T細(xì)胞活化并分泌

3、細(xì)胞因子所需試劑所需試劑5 5、阻斷劑、阻斷劑 阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使得刺激細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子聚集在胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，以利于準(zhǔn)確檢測細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力。 Monensin Brefeldin-A(BFA) 6 6、固定劑、固定劑 固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細(xì)胞因子固定在細(xì)胞內(nèi)，另一方面避免細(xì)胞表面抗原丟失。 一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液7 7、破膜劑、破膜劑 將細(xì)胞膜穿孔，以利于熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合。 一般使用含1皂甙、0.05NaN2的Hanks溶液/HBBS操作步驟操作步驟細(xì)胞表面抗原染色刺激細(xì)胞（PMA、Ionomycin、

4、BFA）固定、破膜細(xì)胞因子染色注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 標(biāo)本處理標(biāo)本處理：避免使用絡(luò)合鈣的抗凝劑，如ACD與EDTA，因?yàn)樗鼈儠拗柒}依賴性激活過程，推薦用肝素鈉。血樣在8小時內(nèi)分析，超過8小時會導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽性細(xì)胞會減少5%。如不能在8小時之內(nèi)檢測，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。 刺激激活刺激激活：檢測不同的細(xì)胞因子根據(jù)情況選擇不同的刺激劑組合和刺激時間，以保證最佳的檢測效果。比如，要檢測IFN-則可選擇PMA和Ionomycin同時刺激；如果用CD4做表面標(biāo)記，由于多數(shù)病人的CD4抗原會因PMA的激活而有不同程度的下調(diào)，所以培養(yǎng)時間不能太長，4-6小時為宜，否則CD4下調(diào)影響分析。注

5、意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 選擇合適的對照選擇合適的對照：為保證結(jié)合的真是和可靠性，至少應(yīng)該設(shè)置以下對照： 未刺激對照未刺激對照：激活時由于BFA的存在抑制了胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此在激活過程中產(chǎn)生的抗原與細(xì)胞因子會滯留胞內(nèi)，未刺激對照也應(yīng)包含BFA。激活對照激活對照：激活對照使用細(xì)胞表面表達(dá)CD69來評價激活與否，如果未達(dá)到CD69期望的水平，則激活步驟出了問題，某一試劑可能失活，過期，制備不當(dāng)或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實(shí)驗(yàn)。同型對照同型對照：使用與熒光標(biāo)記抗體相同來源、相同標(biāo)記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 使用適當(dāng)細(xì)胞表面阻斷試劑使用適當(dāng)細(xì)胞表面阻斷試劑，減少非特異性的背景染色，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性FcFc受體阻斷受體阻斷：使用試劑阻斷Fc受體可以有效減少非特異熒光染色，在小鼠可以用純化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用過量的同種無關(guān)純化Ig或血清。表面結(jié)合的細(xì)胞因子的阻斷表面結(jié)合的細(xì)胞因子的阻斷：使用相同克隆的純化的細(xì)胞因子抗體，阻斷細(xì)胞表面結(jié)合的細(xì)胞因子，阻斷由于熒光抗體與表面細(xì)胞因子結(jié)合引起的背景。 熒光素的選擇：熒光素的選擇：檢測相對低表達(dá)細(xì)胞因子如IL-4時，應(yīng)選用PE或APC標(biāo)記；單檢測某一細(xì)胞因子時最好也選用PE或APC標(biāo)記未使用阻斷劑使用阻斷