chapter__外植體選擇和滅菌

1、1會(huì)計(jì)學(xué)chapter_外植體選擇和滅菌外植體選擇和滅菌a. 單子葉植物不易誘導(dǎo)器官發(fā)生。b. 木本植物較難誘導(dǎo)。c. 存在基因型差異（如番茄29%63%）d. 開始生長季節(jié)取材容易誘導(dǎo)。外植體種類及基因型對(duì)于大多數(shù)植物來講，莖尖是最好的部位，由于其形態(tài)已基本建成，生長速度快，遺傳性穩(wěn)定，也是獲得無病毒苗的重要途徑，但莖尖往往受到材料來源的限制，而采用莖段可解決培養(yǎng)材料不足的困難。 選取適宜的外植體；常用外植體有莖尖、莖段、節(jié)間、葉片、葉柄等。 C、流水沖洗外植體； D、外植體切割、分離及滅菌處理； E、外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基。 F、環(huán)境條件控制促進(jìn)外植體的生長。 不同植物的取材季節(jié)要求各有不

2、同。對(duì)大多數(shù)植物而言，應(yīng)在其生長開始的季節(jié)采樣 。 在生長末期或已進(jìn)入休眠期時(shí)取樣，則外植體可能對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無反應(yīng)，較難成活。 在母株生長旺盛的季節(jié)取材，不僅成活率高，而且增殖率也大。 1幼年組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力 作為外植體的器官，其生理狀態(tài)和發(fā)育年齡直接影響形態(tài)發(fā)生。一般情況下，幼年組織比老年組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力，生理年齡越老的組織或器官，越接近發(fā)育上的成熟，其再生能力逐漸減弱甚至完全失去再生能力。 外植體狀態(tài)：2 外植體的來源 -生長在自然環(huán)境下的植物 -有目的地培育在溫室控制條件下生長的植物 -無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物 自然環(huán)境中生長的植株，一般帶有微生物，甚至與某

3、些微生物具有寄生關(guān)系，使植株具有內(nèi)生菌。取自這些植物的外植體，在培養(yǎng)過程中會(huì)有微生物滋生，從而影響培養(yǎng)效果。 自然環(huán)境生長植株溫室控制條件下生長植株已離體培養(yǎng)植株 多數(shù)情況下，應(yīng)盡量使用溫室或人工氣候室控制培養(yǎng)的植物材料作為外植體來源，減少培養(yǎng)過程中的微生物感染概率。同時(shí)，生長在控制條件下的植物可以保持培養(yǎng)料間的一致性，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，也便于培養(yǎng)技術(shù)的規(guī)范。 某些多年生植物或特殊材料，必須取自自然生長的植物，就需要盡可能避免使用那些生長過于潮濕和不潔凈環(huán)境中的植物。對(duì)于培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的材料，應(yīng)盡量取生長旺盛期的生長點(diǎn)部位作為起始培養(yǎng)的材料。 3、供體植株的管理 取自室外的外植

4、體材料，供體植株的管理十分重要，這與外植體培養(yǎng)時(shí)的污染率密切相關(guān)。植株管理中應(yīng)注意：避免昆蟲危害 許多昆蟲如蚜蟲、螨類和飛虱是許多植物病蟲害的傳播媒介，會(huì)引起植物組織的潛在感染。注意防病 尤其是真菌和細(xì)菌病害的侵染，取自感病植株的外植體，在培養(yǎng)中的污染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于來自健康植株的外植體，必要時(shí)需使用化學(xué)藥劑防治病害?？刂茲穸?給供體植株澆水時(shí)應(yīng)從根部給水，避免從上部澆水，以免上部形成易于病原侵染的濕度環(huán)境；盡可能降低溫室濕度；取材前盡可能保持植株干爽。3、材料取材 材料選擇 培養(yǎng)材料應(yīng)選擇有代表性的主要植物、選擇性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因型。 快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長的最適時(shí)期取材，花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉

5、發(fā)育到單核期取材。外植體大?。?外植體越小成苗能力越弱，較大的外植體增殖較快。外植體極性： 當(dāng)外植體以形態(tài)學(xué)的基部接種于培養(yǎng)基上時(shí)，從遠(yuǎn)離基部的表面誘導(dǎo)出芽、苗數(shù)目較多。 選取材料的大小一般在0.5-1.0cm之間。胚胎培養(yǎng)或脫毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小難于成活。 外植體取材方法-確定大小 取大小適中的莖段、芽體進(jìn)行清洗、滅菌，大了容易污染，小了不易成活。外植體的大小外植體的來源生理學(xué)上的年齡取材的季節(jié)選材n外植體的選擇有什么要求? 1、預(yù)處理 先對(duì)植物材料進(jìn)行修剪整理，去掉不需要部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料（外植體）在流水中沖洗20-60分鐘，備用。如特別不潔的外植體，可先用

6、加有洗滌劑的水清洗10-15分鐘，再用流水沖洗干凈。 2、表面滅菌（1）操作人員穿戴滅菌過的工作服、口罩。進(jìn)入接種室前雙手用洗滌劑清洗干凈，操作前再用70%酒精或消毒劑擦洗雙手。（2）操作期間雙手和臺(tái)面常用70%酒精或消毒劑擦拭。超凈工作臺(tái)使用前必須用紫外燈照射殺菌，然后開啟風(fēng)機(jī)。 （3）接種用工具（解剖刀、剪刀、鑷子）可放入70-75%酒精中，使用時(shí)需火焰灼燒滅菌，冷卻后使用。 （4）外植體放入超凈工作臺(tái)內(nèi) 置70-75%酒精中5-60 秒 材料消毒前常用70%酒精漂洗：70%具較強(qiáng)穿透力和殺菌力，濕潤表面，驅(qū)盡茸毛間氣泡，使藥劑殺菌效果好。但時(shí)間太長會(huì)損傷材料。 表面活性劑，抽氣、攪拌或超

7、聲振動(dòng)，使消毒劑與材料充分接觸。 1、污染原因 污染是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。 病原菌：細(xì)菌及真菌兩大類。細(xì)菌污染特點(diǎn)-菌斑呈黏液狀，接種后1-2天發(fā)現(xiàn)。污染途徑： 外植體帶菌 培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底 操作人員未遵守操作規(guī)程 2、污染的預(yù)防措施防止材料帶菌的措施-莖尖作外植體時(shí)，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)（無糖）或暗培養(yǎng)。無糖營養(yǎng)液或自來水使枝條抽枝，以新抽嫩枝作外植體。-晴天取材，下午取材，經(jīng)日曬過可殺死部分細(xì)菌或真菌。-接種時(shí)除去外部韌皮組織，只接內(nèi)部的分生組織。 （2）外植體的滅菌 -多次滅菌法，次氯酸鈉-無菌水-次氯酸鈉-多種藥液交替浸泡法，肥皂水-酒精-次氯酸

8、鈉-無菌水。 第二節(jié) 外植體無菌接種 新潔爾滅擦地板、墻壁:使用前0.1%新潔爾滅擦地板、墻壁甲醛熏蒸：在接種前一天進(jìn)行，按每立方米體積2-6mL甲醛，倒入燒杯中，取甲醛一半量的高錳酸鉀倒入燒杯中，利用高錳酸鉀的強(qiáng)氧化性而使甲醛揮發(fā)達(dá)到殺菌目的）（紫外線照射：接種前1小時(shí)進(jìn)行，打開紫外燈照射2030分鐘，利用臭氧（O3）殺菌，停1520分鐘后開始接種） 酒精噴霧 二 外植體的接種無菌接種 外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞、轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。整個(gè)過程均需無菌操作。燒烤瓶口，換濾紙，消毒剪刀，在酒精燈下方操作等。升汞處理方法： 升汞Na2S絮狀沉

9、淀（至絮狀沉淀不再產(chǎn)生為止）FeSO4（中和過多的Na2S ）（1）借助接種用工具將材料切割分離。 （2）將培養(yǎng)基放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，火焰灼燒培養(yǎng)基瓶口，然后打開培養(yǎng)瓶口，置培養(yǎng)瓶為斜角，避免灰塵落入平中。 （3）迅速將切割分離下的所需組織、細(xì)胞、器官，放入培養(yǎng)基上，及時(shí)蓋上瓶蓋。（4）工具用后應(yīng)及時(shí)滅菌，避免交叉污染。（5）工作人員操作時(shí)禁止不必要的談話。 第三節(jié) 外植體的培養(yǎng) 外植體的培養(yǎng)條件1、光照 光照對(duì)植物生長發(fā)育有重要作用，是離體培養(yǎng)中非常重要的環(huán)境因素。光照強(qiáng)度、光質(zhì)以及光照時(shí)間，對(duì)細(xì)胞的增殖、器官的分化都有很大影響。除特殊要求外，一般都采用日光燈作光源，光照強(qiáng)度1000-5000

10、Lx，根據(jù)不同植物或器官需要，可以每天連續(xù)光照12-16小時(shí)。2、溫度 離體培養(yǎng)中對(duì)溫度的控制比光照更為重要，大所數(shù)植物最適溫度在23-32之間。培養(yǎng)室溫度是252。低于15時(shí)，培養(yǎng)的組織生長停頓，高于35對(duì)生長也不利。因此，培養(yǎng)室應(yīng)安裝空調(diào)機(jī)或其他的控溫設(shè)備。變溫處理對(duì)有些植物器官發(fā)生有促進(jìn)作用，如豌豆。3、濕度 培養(yǎng)瓶內(nèi)相對(duì)濕度通常是100%，而環(huán)境中的相對(duì)濕度會(huì)直接影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)。因此，培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)室一般要求相對(duì)濕度保持在70-80%，相對(duì)濕度過低影響培養(yǎng)物生長和分化，應(yīng)向室內(nèi)噴灑水，以提高濕度；過高雜菌滋生，大量污染，應(yīng)及時(shí)地通風(fēng)除濕。4、氧氣 離體培養(yǎng)的試管苗是需要氧氣的，

11、在固體培養(yǎng)或液體靜置培養(yǎng)時(shí)，如果組織完全浸入培養(yǎng)基中，與氧氣隔絕，就會(huì)停止生長。因此，接種時(shí)要有部分組織合空氣接觸。振蕩培養(yǎng)是解決通氣的良好辦法。固體培養(yǎng)中，如瓶塞不透氣，培養(yǎng)物也不能生長，要選擇通氣性好的培養(yǎng)瓶蓋，增加可利用的氧氣，迅速除去釋放出來的CO2，有利于外植體外層細(xì)胞開始分裂。要注意保持培養(yǎng)容器內(nèi)良好的通氣性。維持適宜的氧氣和二氧化碳濃度，防止有害氣體的積累。第四節(jié) 外植體的褐變及其防止措施基因型 某些植物酚類物質(zhì)含量較多。外植體的生理狀態(tài) 幼年的材料培養(yǎng)含醌類物質(zhì)較少。 培養(yǎng)基的成分-過高的無機(jī)鹽濃度-生長調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當(dāng)，BA過多-分生能力強(qiáng)的材料，氧化受抑制，褐變也被抑制-培

12、養(yǎng)條件不適宜，溫度過高或光照過強(qiáng)，褐變加速。材料轉(zhuǎn)移時(shí)間 時(shí)間過長引起材料褐變。（二）褐變的防止措施1 選擇適宜的外植體一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。2 培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分中的無機(jī)鹽、蔗糖濃度、激素水平等對(duì)褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關(guān)系 （1） 適當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽濃度 低濃度的無機(jī)鹽可促進(jìn)外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。 （三）玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施1、玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因玻璃化是在細(xì)胞生長過程中的環(huán)境產(chǎn)生變化，試管苗為了適應(yīng)變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。主要原因是：激素濃度 BA濃度提高，導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生。瓊脂濃度 瓊

13、脂濃度低，玻璃化苗增加。溫度 低溫易形成玻璃化苗。光照時(shí)間 一般要求10-12h，大于15h玻璃苗增加。通風(fēng)條件 培養(yǎng)瓶容量小，氣體交換不良，玻璃化苗多。（6）離子水平 植物種類不同，離子形態(tài)比例量要求不同。2、預(yù)防措施控制無機(jī)營養(yǎng)成分，減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量（降低氮（銨態(tài)氮）和氯）。增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢(shì)（提高蔗糖和瓊脂濃度）降低細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度，增加生長素比例，可以考慮加入適量脫落酸。 (作物對(duì)紅光和藍(lán)紫光吸收能力最強(qiáng)，所以燈源以日光燈、高壓汞燈、弧氙氣燈為好。燈源強(qiáng)度：40瓦的日光燈三根合在一起，離苗45厘米高處照射，光強(qiáng)為3千3.5千勒克斯，100瓦的高

14、壓汞燈離苗80厘米處，光強(qiáng)為0.8千1千勒克斯2、接種外植體的生長過程： A 細(xì)胞分裂的啟動(dòng)； B 細(xì)胞增殖； C 組織和器官的形成。 （二）影響外植體起始培養(yǎng)的因素： 1、影響外植體起始的因素 A 外植體的遺傳基礎(chǔ)及生理影響 B 培養(yǎng)基組成成分：礦物鹽類、微量有機(jī)成分、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、碳源、瓊脂、活性炭、酚類化合物、多胺等。 C 培養(yǎng)條件：光照、溫度、濕度 A 外植體 (1) 外植體種類及基因型 (2) 外植體供體植株和外植體的來源與生理狀態(tài) (3) 外植體大小 (4) 外植體的極性B、培養(yǎng)基 a 培養(yǎng)基類型: b 碳 源的影響: C、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) a 細(xì)胞分裂素和生長素類 b 赤霉素類

15、c 乙烯及其生物合成抑制劑 d 其他有機(jī)化合物細(xì)胞分裂素和生長素：a.部分植物單獨(dú)使用細(xì)胞分裂素（CTK）可以形成 無根苗b.部分植物無根苗的形成需要細(xì)胞分裂素和生長素配合使用。c. 外源CTK與生長素必須維持適當(dāng)比例以改變內(nèi)源激素平衡，促進(jìn)器官發(fā)生。d. 不同細(xì)胞分裂素對(duì)分化的作用效果不同e. 苯基脲衍生物具有較高的細(xì)胞分裂素活性 （4PU、CPPU 、TDZ）赤霉素類： 赤霉素與促進(jìn)細(xì)胞伸長和開花反應(yīng)，組織培養(yǎng)條件下只在少數(shù)植物上對(duì)芽的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。 如馬鈴薯、甜菜、櫻桃等。乙烯及其生物合成抑制劑： 具有促進(jìn)和抑制兩方面的影響，但抑制作用多于促進(jìn)作用。因此在某些植物種類，乙烯抑制劑可以促進(jìn)芽的形成。 AgNO3 、CoCl、AVG其他有機(jī)化合物： 腺嘌呤衍生物具有促進(jìn)器官分化作用。 椰子汁等物質(zhì)也具有促進(jìn)分化的功能。已離體培養(yǎng)植株 某些多年生植物或特殊材料，必須取自自然生長的植物，就需要盡可能避免使用那些生長過于潮濕和不潔凈環(huán)境中的植物。對(duì)于培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的材料，應(yīng)盡量取生長旺盛期的生長點(diǎn)部位作為起始培養(yǎng)的材料。 1、預(yù)處理 先對(duì)植物材料進(jìn)行修剪整理，去掉不需要部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料（外植體）在流水中沖洗20-60分鐘，備用。如特別不潔的外植體，