大腸桿菌耐藥株的體外誘導(dǎo)及其acrA和marA基因分析

1、大腸桿菌耐藥株的體外誘導(dǎo)及其acrA和marA基因分析張海旺1 鄧旭明2* 張煜1 蘇杰1 胡仲明31.河北北方學(xué)院，河北 張家口，075131；2.中國人民解放軍軍需大學(xué)，吉林 長春；130062；3.軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春；130062摘要：目的 檢測大腸桿菌在某些抗菌素的環(huán)境壓力下耐藥性的變化及其與acrA和marA基因突變的關(guān)系。方法 分別用四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星對大腸桿菌質(zhì)控株ATCC25922進行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，測定誘導(dǎo)前后多種抗菌藥的MIC的變化；對各菌株的acrA和marA基因進行克隆和測序。結(jié)果 四環(huán)素誘導(dǎo)株產(chǎn)生多重耐藥，氯霉素和環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)引起單藥耐藥；四環(huán)素誘導(dǎo)株、

2、氯霉素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株的acrA和marA基因序列均與ATCC25922的一致。結(jié)論四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)培養(yǎng)并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突變，誘導(dǎo)引起的大腸桿菌耐藥性變化是由于其acrA和marA基因突變以外的其他原因所致。關(guān)鍵詞：大腸桿菌 多重耐藥 外輸泵 acrA marA由于抗菌藥物的廣泛、持續(xù)和不當(dāng)使用，各種病原菌對抗菌藥物的耐藥性日趨嚴(yán)重?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞膜上的外輸泵efflux pump的表達水平提高，能主動將擴散入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的藥物或其他底物泵出菌體外，從而使細(xì)菌獲得非特異性的耐藥性。大腸桿菌是畜禽的重要致病菌，是發(fā)現(xiàn)外輸泵最多的細(xì)菌，現(xiàn)已發(fā)

3、現(xiàn)了約30種外輸泵。一般認(rèn)為AcrABTolC是大腸桿菌主要的外輸泵1。它包括藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運子AcrB、周質(zhì)融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC2。MarA是一個正調(diào)控蛋白，可增強acrAB和tolC的表達。本實驗用四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星通過人工體外誘導(dǎo)大腸桿菌使之產(chǎn)生耐藥性，對AcrA和MarA的基因acrA和marA進行測序分析，檢測耐藥性產(chǎn)生與acrA和marA突變的關(guān)系。1 材料和方法1.1 材料菌株：大腸桿菌質(zhì)控株ATCC25922，購自吉林省衛(wèi)生監(jiān)督檢測中心。抗菌藥：頭孢噻肟、青霉素鉀等，均為標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?，中國藥品生物制品檢定所出品；鹽酸環(huán)丙沙星，對照品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所出品

4、。染色試劑：結(jié)晶紫酒精飽和溶液、草酸銨溶液、革蘭氏碘溶液、石碳酸復(fù)紅溶液等按?藥品微生物學(xué)檢驗手冊?3進行配制。載體與質(zhì)粒：克隆載體為pGEMT，Promega公司產(chǎn)品。酶與試劑：T4 DNA連接酶、Ex TaqTM DNA 聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、溶菌酶、蛋白酶K均為TaKaRa公司產(chǎn)品。其他試劑：乙二胺四乙酸二鈉EDTANa2、焦碳酸二乙酯DEPC，Sigma公司產(chǎn)品；dNTP、5溴4氯3吲哚半乳糖苷Xgal、異丙基D硫代半乳糖苷IPTG、氨芐青霉素Amp、瓊脂糖、羥基甲基氨基甲烷Tris等均為TaKaRa公司產(chǎn)品；飽和酚、氯仿、異丙醇、CaCl2、葡萄糖、甲基紅等，均為國產(chǎn)分析純試劑；

5、DNA片段凝膠回收試劑盒Agarose Gel DNA ，TaKaRa公司產(chǎn)品；國家自然基金資助工程，No 30270999作者介紹：張海旺，生于1956年，博士，教授。研究方向：耐藥機理。*通訊作者 E-mail：zhw5148yahoo . 分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物：DNA Marker DL2,000、Hind digest DNA Marker，均為TaKaRa公司產(chǎn)品。引物：根據(jù)GenBank中acrA、marA基因序列設(shè)計PCR擴增引物：acrA的上游引物PACRF序列為5´ATG AAC AAA AAC AGA GGG TTT ACG CCT3´；下游引物PACRR5

6、´TTA AGA CTT GGA CTG TTC AGG CTG3´，marA的上游引物PMARF序列為5´ATG ACG ATG TCC AGA CGC AAT AC3´，下游引物PMARR5´CTA GCT GTT GTA ATG ATT TAA TGG3´。上海博亞生物技術(shù)合成。儀器：生物顯微鏡，OLYMPUS產(chǎn)品；PCR擴增儀，TC25/H型，杭州 DAHE THERMOMAGNETICS CO.LTD產(chǎn)品；電泳儀，DYY6B型，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；空氣浴振蕩器，HZQC，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；高速臺式冷凍離心機，TG

7、L16M，長沙湘儀離心機儀器生產(chǎn)等。1.2. 方法 菌株鑒定對購進的菌株作生化和形態(tài)鑒定，以確保菌株的可靠性：用營養(yǎng)肉湯作復(fù)蘇培養(yǎng)，再將菌液接種于瓊脂平板37oC培養(yǎng)至長出菌落；取上一步得到的單菌落進行糖發(fā)酵試驗葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、靛基質(zhì)試驗、M.R試驗、VP試驗鑒定及革蘭氏染色的光鏡觀察。鑒定確認(rèn)為ATCC25922的菌株作后續(xù)實驗之用。 MIC測定按照NCCLSNational Committee for Clinical Laboratory Standards規(guī)定的方法配制包括誘導(dǎo)劑氯霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星在內(nèi)的各種受試抗菌藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液；用2倍連續(xù)稀釋法配制各種含抗菌藥

8、的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，抗菌藥的首選濃度范圍為0.1254.0g/ml培養(yǎng)基據(jù)細(xì)菌生長情況再作升或降的調(diào)整。在1ml培養(yǎng)基中接種100l菌液約為105CFU；37oC培養(yǎng)24h，確定MIC。 誘導(dǎo)分別在三種含1/2×MIC誘導(dǎo)劑的麥康凱培養(yǎng)基接種適量培養(yǎng)物約105CFU，37oC培養(yǎng)24h，挑選生長良好的菌落，接種于1×MIC誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基37oC培養(yǎng)24h，以此類推，逐漸提高培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑的濃度直到誘導(dǎo)前MIC的128倍據(jù)細(xì)菌生長情況誘導(dǎo)劑濃度提高幅度可在12倍于原濃度的范圍適當(dāng)調(diào)整，也可當(dāng)細(xì)菌生長不良時在同一個濃度重復(fù)傳代培養(yǎng)。1.2.4 耐藥譜確實定上一步最后獲得的誘導(dǎo)劑濃

9、度到達128×MIC的耐藥株，作4次無誘導(dǎo)劑傳代培養(yǎng)后，再分別測定三個誘導(dǎo)株對所有受試抗菌藥的MIC，以確定三個誘導(dǎo)株的多重耐藥譜。 受試菌株acrA、marA基因序列的檢測據(jù)上一步耐藥譜檢測結(jié)果，氯霉素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株的耐藥譜相近，而四環(huán)素誘導(dǎo)株的耐藥譜與之差異較大，應(yīng)選擇四環(huán)素誘導(dǎo)株名為SEMR、環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株名為SEICI和質(zhì)控株ATCC25922作acrA、marA基因序列的檢測。1.2.5.1 目的基因acrA、marA的獲取1.2.5.1.1 DNA提取：按盧圣棟等4的方法提取SEMR、SEICI和ATCC25922的基因組DNA。1.2.5.1.2 acrA、ma

10、rA基因的PCR擴增：以大腸桿菌染色體DNA為模板，用引物PACRF和PACRR擴增acrA全長1194bp，用PMARF和PMARR擴增marA全長390bp。取5µlPCR產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳觀察PCR結(jié)果。1.2.5.1.3 PCR產(chǎn)物的回收：用DNA片段凝膠回收試劑盒回收acrA和marA基因的PCR產(chǎn)物，方法按試劑盒使說明書進行。1.2.5.2 acrA、marA基因的克隆1.2.5.2.1 目的基因片段與載體的連接：將回收的PCR產(chǎn)物連接到pGEMT 載體上。反響體系為：2×Rapid Ligation Buffer，5µl；PCR產(chǎn)物2n

11、g/µl，3µl；pGEMT vector50ng/µl，1µl；T4 DNA Ligase，1µl。16連接過夜。1.2.5.2.2 感受態(tài)菌的制備：CaCl2法制備DH5感受態(tài)細(xì)胞5。1.2.5.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：參照?分子克隆指南?5進行。1.2.5.2.4 陽性克隆的篩選：利用互補法藍/白菌落篩選法進行陽性克隆的初步篩選5。1.2.5.3 重組質(zhì)粒的鑒定.3.1提取質(zhì)粒：堿裂解法5提取質(zhì)粒，作0.7瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察并拍照。1.2.5.3.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定：用Nco和Not雙酶切鑒定acrApGEMT和marAp

12、GEMT質(zhì)粒。將經(jīng)過電泳篩選出的疑似陽性克隆質(zhì)粒進行Nco和Not雙酶切反響，同時做陰性克隆質(zhì)粒的酶切對照。酶切反響體系為：克隆質(zhì)粒，5µl；10×H Buffer，1µl ；0.1%BSA，2µl； Nco，1µl；Not1µl ；ddH2O，10µl。37恒溫水浴24h。0.7%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀下觀察電泳結(jié)果并拍照。1.2.5.3.3 重組質(zhì)粒的PCR擴增鑒定：利用PCR反響，對經(jīng)過上述鑒定的疑似陽性質(zhì)粒再作PCR擴增鑒定。用引物PACRF和PACRR擴增鑒定acrApGEMT質(zhì)粒；用PMARF和PMARR擴增

13、鑒定marApGEMT質(zhì)粒。取5µl PCR擴增產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果并進行拍照。1.2.5.4 重組質(zhì)粒的核苷酸序列測定與分析對經(jīng)上述鑒定后均符合要求的陽性克隆質(zhì)粒進行序列測定上海博亞生物技術(shù)完成，用DNAsis軟件分析測序結(jié)果。2 結(jié)果2.1 受試藥物的MIC包括三種誘導(dǎo)劑氯霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星在內(nèi)的各種受試抗菌藥對于質(zhì)控株的MIC見表1。2.2 誘導(dǎo)株的耐藥性變化四環(huán)素、環(huán)丙沙星和氯霉素三個誘導(dǎo)株的MIC變化詳見表2。從表中可見，在四環(huán)素誘導(dǎo)株，除小諾霉素、妥布霉素、阿米卡星和鏈霉素的MIC沒有明顯的提高外，青霉素鉀、頭孢噻肟、四環(huán)素、土霉素

14、、氯霉素、利福平、甲砜霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和頭孢西丁的MIC提高幅度都有到達或超過4倍經(jīng)統(tǒng)計處理，MIC變化值4×MIC為具有顯著性意義；在環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株，只有頭孢噻肟MIC提高倍數(shù)到達或超過了4，而其它受試抗菌藥的MIC變化都沒有顯著性意義；氯霉素誘導(dǎo)株與環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株相似，只有頭孢噻肟的MIC提高具有顯著性意義，而其他藥物沒有顯著意義。2.3 acrA、marA基因檢測結(jié)果 SEMR、SEICI和ATCC25922基因組DNA的提取結(jié)果從ATCC25922、SEMR、SEICI中提取的染色體DNA作0.7%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察到一條特異帶，大于23kb。見圖1。

15、SEMR、SEICI、ATCC25922 acrA、marA基因的PCR擴增結(jié)果acrA、marA 的PCR擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker DL2,000為對照，結(jié)果在約1194bp和390bp處分別出現(xiàn)特異的目的片段，與預(yù)計的片段大小吻合。見圖2、圖3。表1 受試藥物的MIC ug/ml Table 1 MIC of antibacterial agents ug/ml抗菌藥 MIC 抗菌藥 MIC 抗菌藥 MICantibacterial agents antibacterial agents antibacterial agents青霉素鉀 Benzylpeni

16、cillin K 64 氧氟沙星 Ofloxacin 0.5 甲砜霉素 Clinfenicol 16 頭孢噻肟 Antibacterial 0.25 諾氟沙星 Norfloxacin 0.25 阿米卡星 Amikacin 32四環(huán)素 Tetracycline 4 頭孢西丁 Cefoxitin 0.5 環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin 0.25 土霉素 Oxytetracycline 8 鏈霉素 Streptomycin 64 妥布霉素 Tobramycin 8氯霉素 Chloramphenicol 16 小諾霉素 Micronomicin 1 利福平 Rifampicin 32 表2 誘導(dǎo)

17、菌株的MIC變化Table2 Change for MIC of induced strains 受試藥物antibacterial agents誘導(dǎo)后MIC提高倍數(shù)Increasing power of MIC after induction 四環(huán)素誘導(dǎo)株 環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株 氯霉素誘導(dǎo)株strains of Tetracycline strains of Ciprofloxacin trains of Chloramphenicol青霉素鉀Benzylpenicillin K 8 0 2頭孢噻肟Antibacterial 256 8 8四環(huán)素Tetracycline 128 2 0土霉素Oxy

18、tetracycline 16 2 0氯霉素Chloramphenicol 4 2 0利副平Rifampicin 4 0 0甲砜霉素Clinfenicol 16 0 0環(huán)丙沙星Ciprofloxacin 4 0 0氧氟沙星Ofloxacin 8 2 2諾氟沙星Norfloxacin 8 2 2頭孢西丁Cefoxitin 4 1 0鏈霉素Streptomycin 1 0 0小諾霉素Micronomicin 1 2 2妥布霉素Tobramycin 0 0 0阿米卡星Amikacin 0 0 1 陽性克隆的篩選結(jié)果轉(zhuǎn)化平板經(jīng)過1620h 37的倒置培養(yǎng)，出現(xiàn)了稀疏的藍色和白色的克隆菌落。其中藍色菌落

19、為陰性克隆，為T載體自身環(huán)化所產(chǎn)生。白色的菌落為疑似陽性克隆，需做進一步的鑒定。2.3.2 克隆質(zhì)粒的PCR鑒定分別利用擴增引物，PCR鑒定各克隆質(zhì)粒，結(jié)果可見到特異目的帶，見圖4。2.3.3 克隆質(zhì)粒的酶切鑒定將經(jīng)過PCR鑒定篩選出的疑似陽性克隆質(zhì)粒acrApGEMT和marApGEMT進行Nco和Not雙酶切，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果在約2974bp、1220bp和416bp處分別出現(xiàn)特異的載體、acrA和marA的目的片段。見圖5、圖6。2.3.4 acrA、marA基因序列的測序結(jié)果由DNAsis軟件分析測序結(jié)果說明，acrA和marA克隆質(zhì)粒序列，在ATCC25922、SEMR和

20、SEICI都一致，與GenBank中發(fā)表序列同源性為100%，acrA和marA基因在四環(huán)素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株均沒有發(fā)生突變。3 討論普遍的觀點認(rèn)為，抗菌藥物的使用是病原菌產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵所在。由于抗菌藥物的廣泛、持續(xù)和不當(dāng)使用，給細(xì)菌的生存環(huán)境造成了選擇性壓力，這種環(huán)境壓力因素可以通過多種機制導(dǎo)致病原菌對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。藥物外輸泵是一類位于細(xì)胞膜上的具有特殊結(jié)構(gòu)的膜轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，其作用機理為當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度聚集到達一定數(shù)值時，藥物外輸泵系統(tǒng)相關(guān)mRNA的表達增加，結(jié)果使細(xì)胞膜上外輸泵的數(shù)量增加，使細(xì)胞內(nèi)的藥物被泵出，從而使細(xì)菌耐藥。由于外輸泵種類較多，作用底物廣泛包括抗菌藥、染料、消

21、毒劑、洗滌劑、有機溶劑、親脂陽離子、脂類、抗微生物多肽類、化學(xué)藥物等，所以主動外輸系統(tǒng)介導(dǎo)的耐藥性呈現(xiàn)多重耐藥的特點69。本實驗依據(jù)細(xì)菌耐藥性的原因和機理，人為造成一種抗菌藥的選擇性壓力環(huán)境，對大腸桿菌質(zhì)控株進行體外選擇性誘導(dǎo)培養(yǎng)，以期產(chǎn)生耐藥性。從誘導(dǎo)前后多種抗菌藥MIC的變化結(jié)果看，四環(huán)素誘導(dǎo)株，除小諾霉素、妥布霉素、阿米卡星和鏈霉素的MIC沒有明顯的提高外，青霉素鉀等11種抗菌藥的MIC都有明顯提高，即表現(xiàn)了不同程度的耐藥。從耐藥譜看，產(chǎn)生耐藥的抗菌藥分屬于幾類在結(jié)構(gòu)和作用機理上各不相同的類別，說明四環(huán)素誘導(dǎo)株產(chǎn)生了多重耐藥。大腸桿菌是發(fā)現(xiàn)外輸泵最多的一種細(xì)菌，在埃希氏大腸桿菌上發(fā)現(xiàn)了約

22、30種外輸泵，但一般認(rèn)為AcrABTolC是最主要的外輸泵10。有人報導(dǎo)大腸桿菌外輸泵AcrAB的作用底物包括吖啶橙、結(jié)晶紫、溴乙啶、鐮孢菌酸、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、紅霉素、夫西地酸、SDS、萘啶酸、氨比西林、氟喹諾酮類、內(nèi)酰胺類、利福平、吐溫X100等多種制劑9、11。本實驗的耐藥譜在受試的抗菌藥范圍內(nèi)耐藥譜與AcrAB的作用底物大體一致。這個結(jié)果提示，四環(huán)素誘導(dǎo)大腸桿菌株多重耐藥性的產(chǎn)生可能是由于激活了它的包括AcrAB在內(nèi)的主動外排系統(tǒng)。本實驗中另外的氯霉素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株只對頭孢噻肟一種抗菌藥產(chǎn)生了耐藥。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因我們還不能確切定論，參考有關(guān)資料推測，假定AcrAB激活

23、是多重耐藥產(chǎn)生的直接機制，那么acrAB又受到mar等的調(diào)控，有實驗說明環(huán)丙沙星不是操縱子mar的誘導(dǎo)因子，但是操縱子Mar的誘導(dǎo)能力對藥物產(chǎn)生低水平的耐藥性；Hachler認(rèn)為，大腸桿菌操縱子突變體能被選擇，選擇時用環(huán)丙沙星選擇的頻率大大低于能被接受的誘導(dǎo)物如四環(huán)素等的頻率12。由此可以認(rèn)為抗菌藥的選擇性壓力與主動外輸系統(tǒng)的交互作用在一定程度活范圍內(nèi)是有特異性的。四環(huán)素能較容易地誘導(dǎo)大腸桿菌產(chǎn)生多重耐藥這一結(jié)果還提示，四環(huán)素類抗菌藥的使用要慎重或不提倡使用，特別是對于腸桿菌疾病的治療。由此還可以聯(lián)想到，在目前人們對付病原菌耐藥性尚沒有確實有效的方法的情況下，倒可以如世界衛(wèi)生大會World H

24、ealth Assembly, WHA13敦促的那樣，在消除對病原菌人為的選擇性環(huán)境壓力，減少對耐藥性的誘導(dǎo)方面多下些功夫。這不僅在現(xiàn)在，即使在將來人們逐漸找到了一些對付病原菌耐藥性的方法，仍然不失為具有戰(zhàn)略意義的對策。從實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生了耐藥的抗菌藥其MIC的提高幅度不盡一致。對此種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，推測是由于不止一種外輸泵的激活，或是可能還有其他的耐藥機制的作用。因為細(xì)菌的耐藥有著多種而復(fù)雜的機制14，一種或幾種機制可能同時作用于某一種/一類抗菌藥，多種耐藥機制錯綜的作用于不同的各類藥物，可能是導(dǎo)致本實驗中這種耐藥的不整齊性的主要原因。特別是四環(huán)素的MIC提高幅度達128倍，極有可能存在

25、另外的四環(huán)素耐藥機制，比方四環(huán)素排出系統(tǒng)Tet的參與。本實驗對多重耐藥株、單藥耐藥株和質(zhì)控株對編碼AcrABTolC外輸泵組分之一AcrA2的acrA基因和其調(diào)控基因marA15作了完整的克隆和側(cè)序，二者的測序結(jié)果在上述的3個菌株都是一致的，與文獻報道結(jié)果的同源性均為100%，說明SEMR和SEICI的acrA和marA基因都沒有堿基的改變，四環(huán)素、環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)培養(yǎng)引起菌株的藥敏變化是在acrA和marA基因沒有突變的情況下發(fā)生的，即SEMR菌株多重耐藥性的產(chǎn)生是由于除acrA和marA突變以外的其他原因。參考文獻：1Sulavik M C,Houseweart C,Cramer C. An

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