基因工程詳解課件(2015版醫(yī)學(xué)、生物學(xué)博士課程用)

1、 基基 因因 工工 程程 （GENETIC ENGINEERING） 基基 因因 工工 程程 （GENETIC ENGINEERING） 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述 基因工程技術(shù)的定義基因工程技術(shù)的定義 用人工方法，提取或制備某種細(xì)胞的某用人工方法，提取或制備某種細(xì)胞的某種基因，在體外把它和一種載體連接構(gòu)造雜種基因，在體外把它和一種載體連接構(gòu)造雜種種DNA分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，讓其復(fù)制分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，讓其復(fù)制與表達(dá)，以改變受體細(xì)胞的某些性狀或產(chǎn)生與表達(dá)，以改變受體細(xì)胞的某些性狀或產(chǎn)生人們所需的產(chǎn)物的工程技術(shù)。人們所需的產(chǎn)物的工程技術(shù)。克?。寺。╟lone） 指來自于同一始祖的一群相同

2、分子、細(xì)菌、指來自于同一始祖的一群相同分子、細(xì)菌、細(xì)胞或動物（常被稱為副本或拷貝）。獲取大細(xì)胞或動物（常被稱為副本或拷貝）。獲取大量單一拷貝的過程稱為克隆化（量單一拷貝的過程稱為克隆化（cloningcloning）, ,也也稱無性繁殖。稱無性繁殖。 細(xì)胞克隆、個(gè)體克隆、分子克隆細(xì)胞克隆、個(gè)體克隆、分子克隆 細(xì)胞克?。?xì)胞克隆（cell clone） 細(xì)胞克?。?xì)胞克?。╟loneclone）: :由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)無由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而形成的細(xì)胞群體。性繁殖而形成的細(xì)胞群體。 個(gè)體克?。▊€(gè)體克?。∣rganism cloningOrganism cloning ） n個(gè)體克?。▊€(gè)體克?。∣rga

3、nism cloningOrganism cloning）：即是利用生物技術(shù)由）：即是利用生物技術(shù)由無性生殖產(chǎn)生與原個(gè)體有完全相同基因組之后代的過程。無性生殖產(chǎn)生與原個(gè)體有完全相同基因組之后代的過程?？寺≡趫@藝學(xué)上是指通過營養(yǎng)生殖產(chǎn)生的單一植株的后克隆在園藝學(xué)上是指通過營養(yǎng)生殖產(chǎn)生的單一植株的后代。很多植物都是通過克隆這樣的無性生殖方式從單一代。很多植物都是通過克隆這樣的無性生殖方式從單一植株獲得大量的子代個(gè)體。植株獲得大量的子代個(gè)體。 n克隆一個(gè)生物體意味著創(chuàng)造一個(gè)與原先的生物體具有完克隆一個(gè)生物體意味著創(chuàng)造一個(gè)與原先的生物體具有完全一樣的遺傳信息的新生物體。目前，現(xiàn)代生物學(xué)背景全一樣的遺傳

4、信息的新生物體。目前，現(xiàn)代生物學(xué)背景下，這通常包括了體細(xì)胞核移植。下，這通常包括了體細(xì)胞核移植。 分子克隆分子克隆( (molecular cloning)molecular cloning)n 分子克?。ǚ肿涌寺。╩olecular cloningmolecular cloning）: :指建立指建立單一的重組單一的重組DNADNA的無性系的過程。的無性系的過程。即指在體外制即指在體外制備備DNADNA，切割拼接成重組切割拼接成重組DNADNA，通過載體導(dǎo)入受通過載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，使重組體細(xì)胞，使重組DNADNA在受體細(xì)胞中擴(kuò)增復(fù)制，形在受體細(xì)胞中擴(kuò)增復(fù)制，形成單一成單一DNADNA分子大量

5、拷貝的過程。意指由一個(gè)祖分子大量拷貝的過程。意指由一個(gè)祖先分子復(fù)制生成的和祖先分子完全相同的分子先分子復(fù)制生成的和祖先分子完全相同的分子群體。群體。 Recombinant DNA TechnologyIn 1980 he shared half of the Nobel Prize for Chemistry with the team of Walter Gilbert and Frederick Sanger. All three were recognized for their important contributions to basic research in nucleic

6、acids Paul Berg An American biochemist who assisted Herbert Boyer in the creation of the first recombinant DNA organism, and won the 1986 Nobel Prize for his work with Rita Levi-Montalcini in discovering cell growth factors.Stanley Cohen 克隆技術(shù)的應(yīng)用前景克隆技術(shù)的應(yīng)用前景 1.1.改良動物品種改良動物品種 2. 2.挽救瀕臨滅絕的物種挽救瀕臨滅絕的物種 3.

7、 3.培植人體皮膚培植人體皮膚 4. 4.研制名貴藥品研制名貴藥品 5. 5.培育人體器官培育人體器官 第二節(jié)第二節(jié) 工具酶工具酶 分子克隆技術(shù)中，分子克隆技術(shù)中，DNADNA的切割、重組、的切割、重組、修飾及合成都涉及一系列酶促反應(yīng)，催修飾及合成都涉及一系列酶促反應(yīng)，催化這些反應(yīng)的酶是進(jìn)行化這些反應(yīng)的酶是進(jìn)行DNADNA操作的基本工操作的基本工具，故稱為工具酶。具，故稱為工具酶。 一、限制酶一、限制酶 （一）限制酶的定義一）限制酶的定義 限制酶限制酶( (restriction enzyme): restriction enzyme): 一類專門切割一類專門切割DNADNA的酶。是的酶。是一

8、類能識別雙鏈一類能識別雙鏈DNADNA分子中的某種特定核苷酸序列，并與其分子中的某種特定核苷酸序列，并與其特異結(jié)合，并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈特異結(jié)合，并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNADNA的一類核酸的一類核酸內(nèi)切酶。內(nèi)切酶。 阿爾伯阿爾伯Wemer Arber瑞士生物學(xué)家巴塞爾Biozentrum大學(xué)1929 內(nèi)森斯內(nèi)森斯Danien Nathans美國微生物學(xué)家霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院1931 史密斯史密斯Hamilton OSmith美國微生物學(xué)家霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院1931阿爾伯(Wemer Arber 1929)瑞士生物學(xué)家，內(nèi)森斯(Danien Nathans 19281999)美國微

9、生物學(xué)家，史密斯(Hamilton OSmith 1931)美國微生物學(xué)家，由于限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其在分子遺傳學(xué)中的應(yīng)用，為遺傳工程的產(chǎn)生拉開了序幕而獲得1978年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。 （二）限制酶的發(fā)現(xiàn)（二）限制酶的發(fā)現(xiàn) 大腸桿菌的限制大腸桿菌的限制修飾系統(tǒng)中，該系統(tǒng)由兩種酶修飾系統(tǒng)中，該系統(tǒng)由兩種酶組成：組成： 限制酶（分解和識別限制酶（分解和識別DNADNA的酶）的酶） 修飾酶（改變堿基結(jié)構(gòu)，免遭限制酶分解）修飾酶（改變堿基結(jié)構(gòu)，免遭限制酶分解） 甲基化修飾甲基化修飾A Am m/C/Cm m 兩種酶作用于同一兩種酶作用于同一DNADNA的相同部位的相同部位細(xì)菌的限制細(xì)菌的限制修

10、飾系統(tǒng)修飾系統(tǒng) 限制酶限制酶 1.1.防御外源性防御外源性DNADNA入侵。入侵。 2.2.構(gòu)成細(xì)菌種屬和菌株之間交叉繁殖屏障，但又允許外構(gòu)成細(xì)菌種屬和菌株之間交叉繁殖屏障，但又允許外源源DNADNA有某些遺漏，利于物種進(jìn)化。有某些遺漏，利于物種進(jìn)化。 3.3.基因工程重要的工具酶?；蚬こ讨匾墓ぞ呙浮＜谆讣谆?1.1.保護(hù)自身保護(hù)自身DNADNA不受限制酶切割（限制）。不受限制酶切割（限制）。 2.2.影響影響DNADNA分子構(gòu)象，利于基因表達(dá)調(diào)控。分子構(gòu)象，利于基因表達(dá)調(diào)控。甲基化酶甲基化酶: :DAM methylase (DNA adenine methylase) is a

11、n enzyme that adds a methyl group to the adenine of the sequence 5-GATC-3 in newly synthesized DNAdcm - DNA cytosine methylase （三）限制酶的分類與命名（三）限制酶的分類與命名1.1.分類（根據(jù)酶的組成、所需輔助因子及裂解分類（根據(jù)酶的組成、所需輔助因子及裂解DNADNA的方式）：的方式）： 型型R.ER.E 復(fù)合酶：核酸內(nèi)切酶、甲基化酶（修飾）、復(fù)合酶：核酸內(nèi)切酶、甲基化酶（修飾）、ATPaseATPase 識別序列識別序列: : 特異性識別特異性識別1515bpbp

12、 切割特點(diǎn)切割特點(diǎn): : 識別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不一致產(chǎn)生片段識別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不一致產(chǎn)生片段較大、識別后較大、識別后, ,要移動要移動100100-1000bp-1000bp切割。切割。 型型R.E R.E M.W M.W和亞基組成類似和亞基組成類似類類R.ER.E，作用方式同作用方式同 I I 型。型。 2、限制酶命名的原則、限制酶命名的原則（1 1）以該菌株的屬名的第一個(gè)字母及種名的頭兩個(gè)）以該菌株的屬名的第一個(gè)字母及種名的頭兩個(gè)字母組成三個(gè)斜體字母的略語表示字母組成三個(gè)斜體字母的略語表示（2 2）同一種細(xì)菌若有不同菌株，則在屬名種名后再）同一種細(xì)菌若有不同菌株，則在屬名種名后再加上株名加上

13、株名（3 3）若一個(gè)菌株中有幾種酶時(shí)，以羅馬字加以區(qū)分）若一個(gè)菌株中有幾種酶時(shí)，以羅馬字加以區(qū)分（4 4）同一屬細(xì)菌種名頭兩個(gè)字母完全相同，其中一）同一屬細(xì)菌種名頭兩個(gè)字母完全相同，其中一個(gè)菌的酶可改用詞頭后的另一個(gè)字母來代替?zhèn)€菌的酶可改用詞頭后的另一個(gè)字母來代替 第一個(gè)字母第一個(gè)字母 該酶來源的細(xì)菌該酶來源的細(xì)菌屬名屬名 大寫英文字母大寫英文字母 第二、第三個(gè)字母第二、第三個(gè)字母 該細(xì)菌的該細(xì)菌的種名種名 小寫英文字母小寫英文字母 第四個(gè)字母第四個(gè)字母 代表代表株名株名 羅馬數(shù)字羅馬數(shù)字 同株、不同酶發(fā)現(xiàn)的先后同株、不同酶發(fā)現(xiàn)的先后次序次序 屬屬 名名 + 種種 名名 + 株株 名名 + 序

14、號序號 （大（大.斜）斜） (小小.斜斜) (大大/小小.正正) (正正) E- Escherichia H- Haemophilus （EcoR I）co- coli （Hin d ）in- influenzae R- RY13 d- Rd I- 該株首次分離該株首次分離 - 該株第該株第3次分離次分離 限制酶命名舉例：限制酶命名舉例：（四）（四）型型限制酶的特性限制酶的特性1 1、各種限制酶具有專一的識別與切割序列：、各種限制酶具有專一的識別與切割序列： Sau3AI EcoRI Pst Sma5 GATC GAATTC CTGCAG CCCGGG 33 CTAG CTTAAG GACGT

15、C GGGCCC 5 Sau3AI EcoRI Pst Hga5 GATC GAATTC CTGCAG GACGC 33 CTAG CTTAAG GACGTC CTGCG 5 2 2、識別堿基對數(shù)目一般為：、識別堿基對數(shù)目一般為： 4 46 6 堿基對，少數(shù)識別序列堿基對，少數(shù)識別序列為為8 8個(gè)或個(gè)或8 8個(gè)以上堿基對。個(gè)以上堿基對。 3 3、識別序列大多為二重對稱：、識別序列大多為二重對稱： 具有回文結(jié)構(gòu)具有回文結(jié)構(gòu)（palindrom）。）。 Sau3AI EcoRI Pst Sma5 GATC GAATTC CTGCAG CCCGGG 33 CTAG CTTAAG GACGTC GGG

16、CCC 5 4 4、多數(shù)限制酶的切割位點(diǎn)就在識別位點(diǎn)內(nèi)，但少數(shù)限制酶的切割位點(diǎn)、多數(shù)限制酶的切割位點(diǎn)就在識別位點(diǎn)內(nèi)，但少數(shù)限制酶的切割位點(diǎn)不在識別位點(diǎn)內(nèi)，而在識別位點(diǎn)的旁側(cè)不在識別位點(diǎn)內(nèi)，而在識別位點(diǎn)的旁側(cè)。如。如Hga的識別位點(diǎn)是的識別位點(diǎn)是GACGC（5/10），切割位點(diǎn)在兩條），切割位點(diǎn)在兩條DNA鏈上分別在距識別位點(diǎn)鏈上分別在距識別位點(diǎn)5個(gè)個(gè)和和10個(gè)核苷酸處。個(gè)核苷酸處。 Sau3AI EcoRI Pst Hga5 GATC GAATTC CTGCAG GACGC 33 CTAG CTTAAG GACGTC CTGCG 5 5 5、有的識別序列中存在簡并序列（、有的識別序列中存在簡并

17、序列（有的核苷酸位有的核苷酸位點(diǎn)可以不同點(diǎn)可以不同 ）。）。 簡并序列：簡并序列： GTYRAC Y=C/T R=G/A YR=CG/CA/TG/TA Hind可識別可識別4個(gè)特定序列個(gè)特定序列 6、限制酶的切割方式有兩種：、限制酶的切割方式有兩種：(1)(1)識別序列內(nèi)兩條鏈上交錯切割，產(chǎn)生單鏈識別序列內(nèi)兩條鏈上交錯切割，產(chǎn)生單鏈突出的粘性末端突出的粘性末端(2)(2)對稱處同時(shí)切斷對稱處同時(shí)切斷DNADNA的兩條鏈，產(chǎn)生平端的兩條鏈，產(chǎn)生平端DNADNA片段片段7、限制酶的切割產(chǎn)生三種不同末端、限制酶的切割產(chǎn)生三種不同末端切割的結(jié)果：切割的結(jié)果：產(chǎn)生三種不同的末端產(chǎn)生三種不同的末端 平末端

18、平末端 blunt end 5突出突出 5- protruding （cohesive end ） 3 突出突出 3 - protruding （overhang tail） 切割的化學(xué)本質(zhì)：切割的化學(xué)本質(zhì)：磷酸二酯鍵的斷裂磷酸二酯鍵的斷裂, 形成含形成含5 P和和3OH 末端的兩個(gè)末端的兩個(gè)DNA片段。片段。 對一特定的對一特定的DNA而言，識別序列堿基對少的，而言，識別序列堿基對少的，則切點(diǎn)數(shù)多，產(chǎn)生的片段小。則切點(diǎn)數(shù)多，產(chǎn)生的片段小。 8、同功異源酶（、同功異源酶（isoschizomers） 同裂酶同裂酶( (isoschizomer)isoschizomer)：又稱異源同工酶，又稱異

19、源同工酶，是指來源不同，但能識別和切割同一是指來源不同，但能識別和切割同一， 9 9、同尾（裂）酶、同尾（裂）酶 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割同，但切割DNADNA后，產(chǎn)生相同類型的粘性末端后，產(chǎn)生相同類型的粘性末端。GGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCC GATCTAG GATCT A10、限制酶易失活，需注意酶活力的保存。、限制酶易失活，需注意酶活力的保存。二、限制性作圖二、限制性作圖 標(biāo)明限制性內(nèi)切核酸酶在標(biāo)明限制性內(nèi)切核酸酶在DNADNA分子上的限制位分子上的限制位點(diǎn)數(shù)目、限制片段大小及其排列順序的圖

20、譜稱為點(diǎn)數(shù)目、限制片段大小及其排列順序的圖譜稱為DNADNA的物理圖譜的物理圖譜, ,又稱限制性圖譜。又稱限制性圖譜。制作圖譜時(shí)注意以下制作圖譜時(shí)注意以下3點(diǎn)：點(diǎn)：1、選擇在、選擇在DNA鏈上切點(diǎn)在鏈上切點(diǎn)在20個(gè)左右的酶，避免選個(gè)左右的酶，避免選擇產(chǎn)生雙重帶的限制酶。擇產(chǎn)生雙重帶的限制酶。2、DNA分子大小與物理圖譜的精確性有直接的關(guān)分子大小與物理圖譜的精確性有直接的關(guān)系。系。3、電泳時(shí)盡可能測定各片段的相對分子質(zhì)量。、電泳時(shí)盡可能測定各片段的相對分子質(zhì)量。組建物理圖譜需遵循的原則組建物理圖譜需遵循的原則1 1、瓊脂糖凝膠上的、瓊脂糖凝膠上的DNADNA片段用英文大寫字母表示片段用英文大寫字

21、母表示, ,從從A A起始起始, ,表示片段號由大到小。表示片段號由大到小。2 2、片段數(shù)超過、片段數(shù)超過2626個(gè)字母個(gè)字母, ,用小寫字母連續(xù)排列。用小寫字母連續(xù)排列。3 3、共移動的片段、共移動的片段, ,分別用不同的字母表示分別用不同的字母表示, ,如如FGHFGH等等, ,而不用而不用F1F1、F2F2和和F3F3。4 4、環(huán)狀、環(huán)狀DNADNA的物理圖譜需找一個(gè)零點(diǎn)的物理圖譜需找一個(gè)零點(diǎn), ,將整個(gè)將整個(gè)DNADNA分為分為100100等份等份, ,每等份為一個(gè)圖距單位。每等份為一個(gè)圖距單位。5 5、片段順序的閱讀規(guī)定為、片段順序的閱讀規(guī)定為: :環(huán)狀圖譜按順時(shí)針方向環(huán)狀圖譜按順時(shí)

22、針方向, ,線狀物理圖譜從左到右閱讀。線狀物理圖譜從左到右閱讀。多種限制酶消化法作圖多種限制酶消化法作圖 用幾種限制酶分別或同時(shí)消化目的用幾種限制酶分別或同時(shí)消化目的DNADNA、電泳分、電泳分離、求出各片段的大小離、求出各片段的大小, ,然后推導(dǎo)出限制性圖譜的然后推導(dǎo)出限制性圖譜的一種方法一種方法注意注意: :1 1、消化必須徹底。、消化必須徹底。2 2、完全消化時(shí)、完全消化時(shí),DNA,DNA片段以等摩爾數(shù)存在片段以等摩爾數(shù)存在, ,帶的強(qiáng)度與帶的強(qiáng)度與片段的長度和含量成正比。片段的長度和含量成正比。3 3、限制性片段長度的總和應(yīng)等于、限制性片段長度的總和應(yīng)等于DNADNA分子的總長度。分子

23、的總長度。4 4、DNADNA片段的數(shù)量與酶切次數(shù)有關(guān)。片段的數(shù)量與酶切次數(shù)有關(guān)。限制酶部分消化法作圖限制酶部分消化法作圖 首先以某個(gè)酶對首先以某個(gè)酶對DNADNA進(jìn)行進(jìn)行完全消化完全消化, ,水解產(chǎn)物通過水解產(chǎn)物通過凝膠電泳分離凝膠電泳分離, ,測定各片段的相對分子質(zhì)量測定各片段的相對分子質(zhì)量。另外將。另外將此此DNADNA用同一種酶部分消化用同一種酶部分消化, ,由于水解程度參差不齊由于水解程度參差不齊, ,部分水解的電泳條帶多于完全水解的電泳條帶部分水解的電泳條帶多于完全水解的電泳條帶, ,部分部分水解片段相互存在重疊現(xiàn)象水解片段相互存在重疊現(xiàn)象, ,部分水解片段的相對分部分水解片段的相

24、對分子質(zhì)量等于兩個(gè)或兩個(gè)以上完全水解片段之和。子質(zhì)量等于兩個(gè)或兩個(gè)以上完全水解片段之和。根根據(jù)兩類消化中片段大小的關(guān)系和交錯重疊現(xiàn)象據(jù)兩類消化中片段大小的關(guān)系和交錯重疊現(xiàn)象, ,找出找出各片段的鄰近位置各片段的鄰近位置, ,排出它們的順序排出它們的順序, ,得到某得到某DNADNA的物的物理圖譜。理圖譜。例如例如: :用用AvaAva消化一個(gè)消化一個(gè)18.1kb18.1kb線狀線狀DNADNA完全消化得完全消化得8 8個(gè)片段個(gè)片段: :A(4.6kb) A(4.6kb) 、B(4.0kb) B(4.0kb) 、C(3.3kb) C(3.3kb) 、D(2.5kb) D(2.5kb) E(2.0

25、kb) E(2.0kb) 、F(1.0kb) F(1.0kb) 、G(0.5kb) G(0.5kb) 、H(0.2kb)H(0.2kb)部分消化得部分消化得1414個(gè)片段個(gè)片段: :6.6kb6.6kb、6.5kb6.5kb、5.3kb5.3kb、4.6kb4.6kb、4.2kb4.2kb、4.0kb4.0kb、3.8kb 3.8kb 3.5kb3.5kb、3.3kb3.3kb、2.5kb2.5kb、1.0kb1.0kb、0.7kb0.7kb、0.5kb0.5kb、0.2kb0.2kb排除共有片段剩排除共有片段剩7 7個(gè)片段個(gè)片段: :6.6kb6.6kb、6.5kb6.5kb、5.3kb5.

26、3kb、4.2kb4.2kb、3.8kb3.8kb、3.5kb3.5kb、0.7kb0.7kb部分消化的大片段等于完全消化的幾個(gè)小片段之和部分消化的大片段等于完全消化的幾個(gè)小片段之和: :6.6kb6.6kb4.64.62 (A2 (AE) 6.5kbE) 6.5kb4.04.02.5(B+D) 2.5(B+D) 5.3kb5.3kb3.33.32 (C+E) 3.8kb2 (C+E) 3.8kb3.33.30.5(C+G) 0.5(C+G) 0.7kb0.7kb0.5+0.2(G+H)0.5+0.2(G+H)4.2kb=4.0+0.2(B+H)4.2kb=4.0+0.2(B+H)或或=2.5

27、+1.0+0.5+0.2(D+F+G+H)=2.5+1.0+0.5+0.2(D+F+G+H)3.5kb=2.5+1.0(D+F)3.5kb=2.5+1.0(D+F)或或=2.0+1.0+0.5(E+F+G)=2.0+1.0+0.5(E+F+G)或或=3.3+0.2(C+H)=3.3+0.2(C+H)以上述結(jié)果為基礎(chǔ)以上述結(jié)果為基礎(chǔ), , 組建線性組建線性DNADNA的物理圖譜如下的物理圖譜如下: :4.62.03.30.50.21.02.54.0末端標(biāo)記法作圖末端標(biāo)記法作圖 末端標(biāo)記法實(shí)質(zhì)是部分消化法末端標(biāo)記法實(shí)質(zhì)是部分消化法, ,即用一個(gè)酶部分即用一個(gè)酶部分消化消化DNA DNA 之前之前,

28、 ,首先進(jìn)行首先進(jìn)行DNA DNA 的的55端和端和( (或或)3)3末端末端標(biāo)記標(biāo)記, ,然后對末端標(biāo)記的然后對末端標(biāo)記的DNADNA進(jìn)行部分消化進(jìn)行部分消化, ,凝膠電泳凝膠電泳分離分離DNADNA、轉(zhuǎn)膜、放射自顯影。根據(jù)部分消化、轉(zhuǎn)膜、放射自顯影。根據(jù)部分消化, ,完全完全消化和放射自顯影結(jié)果構(gòu)建消化和放射自顯影結(jié)果構(gòu)建DNADNA的物理圖譜。的物理圖譜。 基因組物理圖譜基因組物理圖譜: :作圖的基本方法作圖的基本方法:自上而下作圖自上而下作圖(top-down mapping)(top-down mapping)自下而上作圖自下而上作圖(bottom-up mapping)(botto

29、m-up mapping) 作圖的基本方法作圖的基本方法:自上而下作圖自上而下作圖(top-down mapping)(top-down mapping)Not Hind 自下而上作圖自下而上作圖(bottom-up mapping)(bottom-up mapping)三、三、DNADNA連接酶連接酶 DNADNA連接酶（連接酶（DNA LigaseDNA Ligase） T4 DNAT4 DNA連接酶連接酶 催化一雙鏈催化一雙鏈DNADNA3 3- -OHOH端與另一雙鏈端與另一雙鏈DNADNA的的5 5端磷端磷酸酸根形成根形成3 3，5 5- - 磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末磷酸二酯鍵，

30、使具有相同粘性末端或平端的端或平端的DNADNA末端連接起來。末端連接起來。 T4 DNA連接酶（連接酶（T4 DNA Ligase） 四、四、DNADNA聚合酶聚合酶 1.1.依賴依賴DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶( (DNA Polymerase)DNA Polymerase) 以單鏈以單鏈DNADNA（SS DNASS DNA）為模板合成為模板合成DNADNA的酶的酶 E EColiColi DNA DNA聚合酶聚合酶 Klenow Klenow 片段片段 T7T7噬菌體噬菌體DNADNA聚合酶聚合酶 T4T4噬菌體噬菌體DNADNA聚合酶聚合酶 耐熱耐熱DNADNA聚合酶聚合

31、酶 （1） EColi DNA聚合酶聚合酶 一條多肽鏈組成一條多肽鏈組成, MW:109 kDa, 含含Zn2+ 三種活性三種活性: 5 3 DNA聚合酶聚合酶 5 3 核酸外切酶核酸外切酶 3 5 核酸外切酶核酸外切酶 用途：用途： 1、切口平移標(biāo)記、切口平移標(biāo)記DNA探針探針 2、對對DNA的的3尾進(jìn)行末端標(biāo)記尾進(jìn)行末端標(biāo)記 3、合成、合成cDNA第二鏈第二鏈 （2） Klenow 片段片段 枯草桿菌蛋白酶裂解枯草桿菌蛋白酶裂解E .Coli 聚合酶聚合酶 I產(chǎn)生兩個(gè)片段，產(chǎn)生兩個(gè)片段，大片段的分子量大片段的分子量76kD，又稱又稱Klenow 片段。片段。 兩種活性：兩種活性： 5 3D

32、NA聚合酶聚合酶 3 5外切酶活性外切酶活性 用途：用途：1. 填平填平5突出的粘端（補(bǔ)平突出的粘端（補(bǔ)平3端），端）， 35 35 53 5- 3 23末端標(biāo)記（填平）末端標(biāo)記（填平） 3合成合成cDNA第二鏈第二鏈 4. DNA序列分析序列分析 (3)(3)耐熱耐熱DNADNA聚合酶：在聚合酶：在PCRPCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，DNADNA聚合酶是聚合酶是最關(guān)鍵的因素之一。最關(guān)鍵的因素之一。PCRPCR發(fā)明的初期使用的發(fā)明的初期使用的DNADNA聚合酶是聚合酶是KlenowKlenow片段、片段、T4DNAT4DNA聚合酶和聚合酶和T7DNAT7DNA聚聚合酶，它們因?qū)岬姆€(wěn)定性差而未得到廣泛

33、應(yīng)合酶，它們因?qū)岬姆€(wěn)定性差而未得到廣泛應(yīng)用。直到耐熱的用。直到耐熱的DNADNA聚合酶聚合酶(Taq DNA (Taq DNA polymerase) polymerase) 應(yīng)用于應(yīng)用于PCRPCR反應(yīng)，才使這一技術(shù)得反應(yīng)，才使這一技術(shù)得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。n 1 1）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 Taq DNATaq DNA聚合酶在聚合酶在75-8075-80具有最高的聚合酶活性。具有最高的聚合酶活性。75-8075-80每個(gè)酶分子每秒可延伸約每個(gè)酶分子每秒可延伸約150150個(gè)核苷酸，個(gè)核苷酸，7070時(shí)延伸速度在時(shí)延伸速度在6060個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸/

34、/秒以上。秒以上。5555時(shí)為時(shí)為2222個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸/ /秒；秒；3737和和2222時(shí)分別為時(shí)分別為1.51.5個(gè)和個(gè)和0.250.25個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸/ /秒。溫度超過秒。溫度超過8080時(shí)，合成速度明時(shí)，合成速度明顯下降，可能與引物和模板結(jié)合穩(wěn)定性遭到破壞顯下降，可能與引物和模板結(jié)合穩(wěn)定性遭到破壞有關(guān)。有關(guān)。nTaq DNATaq DNA聚合酶沒有聚合酶沒有3535外切酶活性。外切酶活性。沒有校正功能的。沒有校正功能的。nTaq DNATaq DNA聚合酶具有類似未端轉(zhuǎn)移酶的功能，聚合酶具有類似未端轉(zhuǎn)移酶的功能，能催化能催化dNTPdNTP加到加到DNADNA的的3-OH3-OH端

35、。端。2 2）Tth DNATth DNA聚合酶聚合酶n在在95 95 0 0C C半衰期為半衰期為2020分鐘，具有逆轉(zhuǎn)錄酶分鐘，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，可簡化活性，可簡化RT-PCRRT-PCR。但不具。但不具3 35 5 外切外切酶活性，沒有校對功能，催化聚合反應(yīng)酶活性，沒有校對功能，催化聚合反應(yīng)的錯誤摻入率為的錯誤摻入率為1/5001/5003 3）Vent DNAVent DNA聚合酶聚合酶n該酶在該酶在1001000 0C C時(shí)半衰期達(dá)時(shí)半衰期達(dá)9595分鐘，分鐘，97.597.50 0C C時(shí)半衰期長達(dá)時(shí)半衰期長達(dá)130130分鐘，其擴(kuò)增產(chǎn)物的長分鐘，其擴(kuò)增產(chǎn)物的長度可達(dá)度可達(dá)10-1

36、3kb10-13kb。Vent DNAVent DNA聚合酶具有聚合酶具有3 35 5 外切酶活性，具有校對功能，錯誤外切酶活性，具有校對功能，錯誤摻入率為摻入率為1/310001/31000，忠實(shí)性比，忠實(shí)性比TaqDNATaqDNA聚合聚合酶提高酶提高5 5 1010倍。倍。4 4）Pfu DNAPfu DNA聚合酶聚合酶n此酶耐熱性極好，在此酶耐熱性極好，在97.597.50 0C C半衰期大于半衰期大于3 3小時(shí)，具有小時(shí)，具有3 35 5 外切酶活性，催化外切酶活性，催化DNADNA合成的忠實(shí)性比合成的忠實(shí)性比Taq DNATaq DNA聚合酶高聚合酶高1212倍。倍。 2 2、依賴

37、、依賴RNARNA的的DNADNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）逆轉(zhuǎn)錄酶（逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase ） 依賴于依賴于RNARNA的的DNADNA聚合酶，以聚合酶，以RNARNA為模板合成為模板合成DNADNA，合成方向?yàn)楹铣煞较驗(yàn)? 5 3 3，無，無 3 3 5 5核酸外切酶的活性。還兼有核酸外切酶的活性。還兼有RNaseHRNaseH活性，可使活性，可使DNADNA：RNARNA雜合體中的雜合體中的mRNAmRNA水解。水解。商品化產(chǎn)品：商品化產(chǎn)品： AML AML 鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒顆粒中的鳥類成髓細(xì)胞白血

38、病病毒顆粒中的RTaseRTase純化而得。純化而得。 MML MML Moloney Moloney小鼠白血病病毒顆粒制備而得小鼠白血病病毒顆粒制備而得 rMMLrMML基因工程制品?；蚬こ讨破?。3 3、不依賴模板的、不依賴模板的DNADNA聚合酶聚合酶末端轉(zhuǎn)移酶（末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶）末端轉(zhuǎn)移酶（末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶）（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdTterminal deoxynucleotidyl transferase, TdT） 功能：功能：在在M M2+2+ 離子存在下，將脫氧核苷酸離子存在下，將脫氧核苷酸 （dNTPdNTP

39、）加到加到DNADNA的的3 3- -OHOH上上 用途：用途：主要用于探針標(biāo)記主要用于探針標(biāo)記, ,用于在載體和待克隆的用于在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接。片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接。末端轉(zhuǎn)移酶的催化活性末端轉(zhuǎn)移酶的催化活性五、五、RNARNA聚合酶聚合酶大腸桿菌大腸桿菌RNARNA聚合酶聚合酶噬菌體噬菌體RNARNA聚合酶聚合酶合成能力強(qiáng)合成能力強(qiáng), ,轉(zhuǎn)錄高效快速轉(zhuǎn)錄高效快速, ,對啟對啟動子具有高度特異性動子具有高度特異性( (一一) )依賴依賴DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶作用作用: :1 1、用于標(biāo)記、用于標(biāo)記RNARNA探針探針, ,用于用于

40、DNADNA或或RNARNA序列的同源性分析序列的同源性分析2 2、用于分析、用于分析RNARNA或或DNADNA末端末端, ,用于基因組用于基因組DNADNA的序列測的序列測定和研究前體定和研究前體RNARNA的剪接的剪接3 3、轉(zhuǎn)錄物可用于體外翻譯、轉(zhuǎn)錄物可用于體外翻譯, ,加入放射線標(biāo)記的氨基加入放射線標(biāo)記的氨基酸合成放射線純的蛋白質(zhì)酸合成放射線純的蛋白質(zhì)( (二二) )不依賴不依賴DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶 poly(A)poly(A)聚合酶聚合酶: :以以ATPATP為前體分子為前體分子, ,催化催化AMPAMP摻入至摻入至RNARNA游離的游離的3 3羥基端羥基端作用

41、作用: :1 1、用、用- -3232PATPPATP標(biāo)記標(biāo)記RNARNA的的3 3末端末端2 2、克隆缺少克隆缺少poly(A)poly(A)尾的尾的RNARNA。用用poly(A)poly(A)聚合酶加聚合酶加尾尾,oligo(dT),oligo(dT)作為引物合成互補(bǔ)作為引物合成互補(bǔ)DNADNA。六、核糖核酸酶六、核糖核酸酶用于用于RNARNA測序測序,RNA,RNA作圖及作圖及RNARNA定量。包括定量。包括: :核糖核酸酶核糖核酸酶A A核糖核酸酶核糖核酸酶H H核糖核酸酶核糖核酸酶T1T1核糖核酸酶核糖核酸酶A A來源于牛胰來源于牛胰, ,特異性水解特異性水解RNARNA的內(nèi)切核糖

42、核酸酶的內(nèi)切核糖核酸酶作用作用: :1 1、對、對RNARNA定量和作圖定量和作圖, ,與與RNARNA酶酶T1T1聯(lián)合使用聯(lián)合使用2 2、降解、降解DNADNA制備物中的制備物中的RNARNA分子分子3 3、RNARNA測序測序, ,去除去除DNARNADNARNA雜交體中的未雜交的雜交體中的未雜交的RNARNA區(qū)區(qū)核糖核酸酶核糖核酸酶H H 來自大腸桿菌的內(nèi)切酶來自大腸桿菌的內(nèi)切酶, ,特異水解特異水解RNADNARNADNA雜雜交體中交體中RNARNA的磷酸二酯鍵的磷酸二酯鍵, ,產(chǎn)生末端為產(chǎn)生末端為33羥基和羥基和55磷酸的產(chǎn)物磷酸的產(chǎn)物, ,不降解單鏈或雙鏈的不降解單鏈或雙鏈的DNA

43、DNA或或RNARNA。作用作用: : 降解降解cDNAcDNA第一鏈合成時(shí)產(chǎn)生的第一鏈合成時(shí)產(chǎn)生的RNADNARNADNA雙鏈體雙鏈體中的中的mRNAmRNA分子分子, ,以利于雙鏈互補(bǔ)以利于雙鏈互補(bǔ)DNADNA的合成的合成。核糖核酸酶核糖核酸酶T1T1 來源于米曲霉的內(nèi)切酶來源于米曲霉的內(nèi)切酶, ,特異地作用于鳥嘌呤核苷特異地作用于鳥嘌呤核苷酸酸33端磷酸并切割與相鄰核苷酸相連的磷酸二酯鍵端磷酸并切割與相鄰核苷酸相連的磷酸二酯鍵作用作用: :1 1、在核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)中、在核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)中, ,對對RNARNA進(jìn)行定量和作圖進(jìn)行定量和作圖2 2、RNARNA測序測序3 3、去除、去除

44、DNARNADNARNA雜交體中未雜交的雜交體中未雜交的RNARNA區(qū)區(qū)七、其他七、其他DNADNA修飾酶修飾酶（一）堿性磷酸酶（一）堿性磷酸酶堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（alkaline phosphatase） 功能：功能：能除去能除去DNA或或RNA 5-端的磷酸基團(tuán)端的磷酸基團(tuán) 用途：用途：制備載體時(shí)，用該制備載體時(shí)，用該酶處理后，可防止載體酶處理后，可防止載體自身自身 環(huán)化，提高重組效環(huán)化，提高重組效率。率。 外源基因克隆入外源基因克隆入 質(zhì)粒載體的過程質(zhì)粒載體的過程（二）（二）T4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化兩種反應(yīng)：催化兩種反應(yīng)： 正向反應(yīng)：正向反應(yīng)：將將ATPATP的的- -磷

45、酸直接轉(zhuǎn)移到去磷酸磷酸直接轉(zhuǎn)移到去磷酸化的化的DNA 5DNA 5 -OH-OH末端，這種反應(yīng)被稱為正向反應(yīng)。末端，這種反應(yīng)被稱為正向反應(yīng)。 交換反應(yīng)：交換反應(yīng)：在過量在過量ATPATP存在下，存在下，T4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶將磷酸化將磷酸化DNADNA的的5 5 端磷酸轉(zhuǎn)移給端磷酸轉(zhuǎn)移給ADP,ADP,然后然后DNADNA從從- -P P32_32_ATPATP中獲得放射性同位素標(biāo)記的中獲得放射性同位素標(biāo)記的- -磷酸而重新磷磷酸而重新磷酸化?？蓸?biāo)記酸化?？蓸?biāo)記DNADNA的的5 5 - -末端，可使缺失末端，可使缺失5 5 -P-P末端的末端的DNADNA發(fā)生磷酸化作用。發(fā)生磷酸化

46、作用。T4T4多核苷酸激酶的活性多核苷酸激酶的活性T4T4多核苷酸激酶的交換活性多核苷酸激酶的交換活性（三）（三）SISI核酸酶核酸酶 水解單鏈核酸，在基因工程，用于去除水解單鏈核酸，在基因工程，用于去除DNADNA突出單鏈尾，打開雙鏈突出單鏈尾，打開雙鏈cDNAcDNA合成期間形成合成期間形成的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。 SISI核酸酶的活性核酸酶的活性SI核酸酶的活性核酸酶的活性 第三節(jié)第三節(jié) 載體載體（VectorVector） 一個(gè)理想的載體應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：一個(gè)理想的載體應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：（1 1）具有自主復(fù)制能力，以保證重組）具有自主復(fù)制能力，以保證重組DNADNA分子在受體細(xì)

47、胞內(nèi)得分子在受體細(xì)胞內(nèi)得到擴(kuò)增。到擴(kuò)增。（2 2）分子量小，小分子的）分子量小，小分子的DNADNA制備時(shí)不易損傷，小分子制備時(shí)不易損傷，小分子DNADNA限制限制酶的切點(diǎn)少。酶的切點(diǎn)少。（3 3）有較多的）有較多的拷貝數(shù)，便于分離提純?？截悢?shù)，便于分離提純。（4 4）有一個(gè)或多個(gè)篩選標(biāo)記，能給寄主（受體）細(xì)胞提供可選）有一個(gè)或多個(gè)篩選標(biāo)記，能給寄主（受體）細(xì)胞提供可選擇的標(biāo)記：如抗藥性，營養(yǎng)缺陷型或顯色表型等，以利于篩擇的標(biāo)記：如抗藥性，營養(yǎng)缺陷型或顯色表型等，以利于篩選。選。 （5）具有多克隆位點(diǎn)，便于目的基因片段與載體連接。）具有多克隆位點(diǎn)，便于目的基因片段與載體連接。 (6)具有較高的

48、遺傳穩(wěn)定性具有較高的遺傳穩(wěn)定性。 二、載體的分類二、載體的分類 克隆載體克隆載體 表達(dá)載體表達(dá)載體 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmidplasmid）載體載體 噬菌體載體：如噬菌體載體：如噬菌體載體、噬菌體載體、M13M13噬菌體載體噬菌體載體 雜合載體雜合載體 ( (如粘粒如粘粒cosmid)cosmid) 病毒性載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等病毒性載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等 人工染色體載體人工染色體載體質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例 E.coli環(huán)狀 8*pUC18/19 , T-載體pGEM- 3z等 噬菌體E.coli線狀9 - 24kbEMBL系列， gt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E

49、.coli環(huán)狀 10 kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)E.coli環(huán)狀300 kbPel oBAC系列PAC (P1-derived Artificial chromosome)E.coli環(huán)狀100 - 2000 kbPCYPAC1YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母細(xì)胞線性染色體100 - 2000 kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳類細(xì)

50、胞線性染色體 1000 kb病毒載體動物細(xì)胞環(huán)狀SV40 載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征載體的種類和特征三、克隆載體（三、克隆載體（cloning vectorcloning vector）（a a）必須是一個(gè)復(fù)制子，能在受體細(xì)胞中復(fù)制。必須是一個(gè)復(fù)制子，能在受體細(xì)胞中復(fù)制。 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn) OriOri 復(fù)制區(qū)復(fù)制區(qū) 復(fù)制終點(diǎn)復(fù)制終點(diǎn) termterm （b b）帶有抗藥性基因帶有抗藥性基因 Tet Tet r r：編碼膜蛋白，阻止編碼膜蛋白，阻止TetTet進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞 Amp Amp r r：-內(nèi)酰胺環(huán)水解酶。內(nèi)酰胺

51、環(huán)水解酶。 Kan Kan r r： KanKan P , neo P , neo p p Cam Cam r r：氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶 載體上含有的一個(gè)人工合成的載體上含有的一個(gè)人工合成的DNADNA片段，其上片段，其上含有數(shù)個(gè)單一酶切位點(diǎn)，是外源含有數(shù)個(gè)單一酶切位點(diǎn)，是外源DNADNA的插入部位的插入部位 是載體中的一段堿基序列，由數(shù)個(gè)酶切位點(diǎn)是載體中的一段堿基序列，由數(shù)個(gè)酶切位點(diǎn)組成。這些位點(diǎn)在載體上都是單一位點(diǎn)組成。這些位點(diǎn)在載體上都是單一位點(diǎn)（二）常用克隆載體（二）常用克隆載體 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmidplasmid）載體）載體 是獨(dú)立于許多細(xì)菌及某些真核細(xì)胞染色體

52、外是獨(dú)立于許多細(xì)菌及某些真核細(xì)胞染色體外共價(jià)閉合環(huán)狀的共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA分子（分子（covalant closed circular,cccDNA），能獨(dú)立復(fù)制的最小遺傳），能獨(dú)立復(fù)制的最小遺傳單位。單位。一般大小約一般大小約10106 610108 8D D，可自身復(fù)制和表達(dá)，有，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當(dāng)改選后便可成為良好的載體。所以質(zhì)粒經(jīng)過適當(dāng)改選后便可成為良好的載體。 作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的當(dāng)改造而

53、成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體。1、質(zhì)粒的概念、質(zhì)粒的概念質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmidplasmid） 是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈?zhǔn)谴嬖谟诩?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNADNA 分子。大小約為分子。大小約為 數(shù)千堿基對。常數(shù)千堿基對。常 有有1 1 3 3個(gè)抗藥個(gè)抗藥 性基因，以利于性基因，以利于 篩選。篩選。2. 2.質(zhì)粒載體必須具備的基本條件質(zhì)粒載體必須具備的基本條件 (1) 、具有復(fù)制起點(diǎn)；、具有復(fù)制起點(diǎn)； 自我增值的基本條件，一般具自我增值的基本條件，一般具一個(gè)一個(gè)復(fù)制子。復(fù)制子。 (2) 、具有抗菌素抗性；、具有抗菌素抗性； 理想的質(zhì)粒載體具有理想的質(zhì)粒載體

54、具有兩種兩種抗菌素抗性基因?？咕乜剐曰?。 (3) 、具有若干限制酶切、具有若干限制酶切單一單一位點(diǎn)位點(diǎn)（CMS）；）； (4) 、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。 低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷 后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時(shí)低分子量后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對限制酶具有多重識別位點(diǎn)的幾率也較低；的質(zhì)粒對限制酶具有多重識別位點(diǎn)的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因3.pBR322質(zhì)粒載體 “P”表示是一種質(zhì)粒； “BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母“F

55、.Bolivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實(shí)驗(yàn)編號。pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒 有兩個(gè)抗藥性基因，每個(gè)抗性基因中均含有單有兩個(gè)抗藥性基因，每個(gè)抗性基因中均含有單克隆位點(diǎn)，外源克隆位點(diǎn)，外源DNA插入后使相應(yīng)的抗性基因失活，插入后使相應(yīng)的抗性基因失活，宿主細(xì)胞失去相應(yīng)的抗藥性，不能在含相應(yīng)抗生素的宿主細(xì)胞失去相應(yīng)的抗藥性，不能在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中生長，這一現(xiàn)象稱為插入失活。培養(yǎng)基中生長，這一現(xiàn)象稱為插入失活。質(zhì)粒質(zhì)粒pBR322的抗性基因篩選示意圖的抗性基因篩選示意圖pBR322pBR322的結(jié)構(gòu)來源的結(jié)構(gòu)來源pBR322pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)： 1 1、具

56、有較小的分子量；、具有較小的分子量； 它的分子量為它的分子量為4363bp4363bp?？寺≥d體的分子量大小。克隆載體的分子量大小不要超過不要超過10kb10kb。 2 2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。選擇記號。 pBR322 DNApBR322 DNA分子中總共有分子中總共有2424種核酸內(nèi)切酶只具有種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識別位點(diǎn)。其中單一的酶切識別位點(diǎn)。其中7 7種內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)種內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2 2種識別位點(diǎn)在于這個(gè)基種識別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動區(qū)內(nèi)，所以因的啟動區(qū)內(nèi)，所以9 9個(gè)

57、限制酶切位點(diǎn)插入外源片個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致斷可以導(dǎo)致tettetr r 基因的失活；另外有基因的失活；另外有3 3種限制酶在種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點(diǎn)，氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點(diǎn)， 3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累10003000個(gè)拷貝。4. 4. pUCpUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，在在pBR322pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其個(gè)在其5 5- -端帶有一段多克隆位點(diǎn)端帶有一段多克隆位點(diǎn)的的lacZlacZ基因，而發(fā)展的具有雙功基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測特性的

58、新型質(zhì)粒載體系列。能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。 一種典型的一種典型的pUCpUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分：四個(gè)部分： 1 1、來自、來自pBR322pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（oriori）；）； 2 2、氨芐青霉素抗性基因（、氨芐青霉素抗性基因（ampampr r ）, ,但它的但它的DNADNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的識別位點(diǎn)。來的核酸內(nèi)切限制酶的識別位點(diǎn)。 3 3、大腸桿菌、大腸桿菌- -半乳糖基因（半乳糖基因（lacZlacZ）的啟動子）的啟動子及編碼及編碼- -肽鏈的

59、肽鏈的DNADNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZlacZ基因；基因； 4 4、位于、位于lacZlacZ基因中的靠近基因中的靠近5 5- -端的一段多克隆端的一段多克隆位點(diǎn)（位點(diǎn)（MCSMCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。能。pUC18/19質(zhì)粒質(zhì)粒 有一個(gè)抗性基因，可用來篩選轉(zhuǎn)化子。有一個(gè)抗性基因，可用來篩選轉(zhuǎn)化子。 有一個(gè)有一個(gè)lacZlacZ基因片段，編碼基因片段，編碼- -半乳糖苷半乳糖苷酶氨基端的一個(gè)片段（酶氨基端的一個(gè)片段（）片段，某些改造的）片段，某些改造的宿主細(xì)胞可表達(dá)宿主細(xì)胞可表達(dá)- -半乳糖苷酶的羧基端片段，半乳糖苷酶的羧基端

60、片段，質(zhì)粒和宿主細(xì)胞共表達(dá)時(shí)才具有質(zhì)粒和宿主細(xì)胞共表達(dá)時(shí)才具有- -半乳糖苷半乳糖苷酶的活性，可使生色底物酶的活性，可使生色底物X-galX-gal降解產(chǎn)生蘭色降解產(chǎn)生蘭色的化合物，的化合物，這種現(xiàn)象稱這種現(xiàn)象稱- -互補(bǔ)。互補(bǔ)。pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)第一， 具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù); 僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變造成了基因rop的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞500700個(gè)拷貝。第二，適用于組織化學(xué)檢測重組體； 具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與- 互補(bǔ)作用，用Xga