動(dòng)植物油脂中膽固醇含量的測(cè)定凝膠滲透色譜凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法編制說(shuō)明

1、動(dòng)植物油脂中膽固醇含量的測(cè)定液相色譜 - 質(zhì)譜 / 質(zhì)譜法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制訂編制說(shuō)明一、工作簡(jiǎn)況膽固醇學(xué)名：5-膽烯 -3-醇。在類(lèi)固醇核的C-3 上連接一羥基，而在C-17 位上接有一條八碳或更多碳原子的脂族側(cè)鏈。是由乙酰輔酶A 通過(guò)異戊二烯單位的縮合反應(yīng)而合成，可作為膽酸和類(lèi)固醇激素的前體。動(dòng)物組織中含有大量膽固醇，又以腎上腺、神經(jīng)組織與膽汁中富集濃度最高。血漿中膽固醇水平過(guò)高，是引起動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因子。油脂是人們?nèi)粘Ｉ钪斜仨毜氖称罚懝檀荚谥参镉椭泻枯^低，在動(dòng)物油脂中則大量存在，控制動(dòng)植物油脂的攝入量，可有效的控制油脂中膽固醇的攝入量，避免過(guò)量攝入膽固醇對(duì)人體可能造成的損害?，F(xiàn)代研究

2、已發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與膽石癥與高膽固醇血癥有密切的相關(guān)性。同時(shí)，隨著 GB28050-2011 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽通則實(shí)施日期的日益臨近，對(duì)于聲稱(chēng)低膽固醇或不含膽固醇的的食用油產(chǎn)品必須在標(biāo)簽中標(biāo)示膽固醇的含量。這使得油脂產(chǎn)品中膽固醇的檢測(cè)方法的建立顯得尤其迫切與重要。1、任務(wù)來(lái)源、起草單位、起草人根據(jù) 2014 年國(guó)標(biāo)委綜合2014 67 號(hào)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委關(guān)于下達(dá)2014 年第一批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知的要求，由國(guó)家農(nóng)副加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（安徽國(guó)家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化與監(jiān)測(cè)中心）負(fù)責(zé)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)植物油脂中膽固醇含量的測(cè)定凝膠滲透色譜凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（計(jì)劃號(hào)20140

3、331-T-449 ）的起草工作。由于本標(biāo)準(zhǔn)在起草過(guò)程中相關(guān)部分主要參加人員工作變動(dòng)，以及標(biāo)準(zhǔn)制訂過(guò)程的合作情況，最終標(biāo)準(zhǔn)起草工作由國(guó)家農(nóng)副加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（已整合為安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院）、合肥燕莊食用油有限責(zé)任公司、合肥海關(guān)技術(shù)中心、合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院等4 家單位聯(lián)合共同完成。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：徐彥輝、程浩、丁磊、盧業(yè)舉、夏春、姚幫本、李靜、蔣俊樹(shù)、羅水忠、劉健、陳從貴、鄭平、劉燕。注：徐彥輝（研究員、博士/碩導(dǎo)）、程浩（高級(jí)工程師）、丁磊（工程師、碩士）、盧業(yè)舉（教授級(jí)高工、碩導(dǎo)）、夏春（高級(jí)工程師）、姚幫本（高級(jí)工程師、博士/碩導(dǎo)）、李靜（工程師、碩士）、蔣俊樹(shù)（

4、教授級(jí)高工、碩導(dǎo)）、羅水忠（教授、博士/碩導(dǎo)）、劉?。ń淌?、博士/博導(dǎo)）、陳從貴（教授、博士/博導(dǎo)）、鄭平（研究員、碩士/碩導(dǎo)）、劉燕（董事長(zhǎng)）。2、簡(jiǎn)要起草過(guò)程2.1、 前期工作基礎(chǔ)（ 1）標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)植物油脂中膽固醇含量的測(cè)定凝膠滲透色譜凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的研制是在安徽省地方標(biāo)準(zhǔn) DB34/T 1765-2012動(dòng)物油脂中膽固醇含量的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法基礎(chǔ)上進(jìn)行的， 本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目的主要參加人員同樣為原地方標(biāo)準(zhǔn)制定人員。1（ 2）植物油中是否含有膽固醇動(dòng)物油脂中含有膽固醇沒(méi)有爭(zhēng)議，但是植物油中有沒(méi)有膽固醇存在爭(zhēng)論，起源于一些品牌植物油在廣告中宣稱(chēng)不含有膽固醇，營(yíng)養(yǎng)專(zhuān)家認(rèn)為 “

5、廣告簡(jiǎn)直就是個(gè)笑話，事實(shí)上，所有純正的食用植物油都是不含膽固醇的，也不可能含有。橄欖油、花生油、菜籽油、芝麻油等等都不會(huì)含有膽固醇，只有動(dòng)物油才含膽固醇?！?，但是做為分析化學(xué)工作者，我們從國(guó)內(nèi)還是國(guó)外文獻(xiàn)中都有發(fā)現(xiàn)植物油中存在膽固醇分析檢測(cè)報(bào)道。關(guān)于植物油中含不含有膽固醇，查閱相關(guān)文獻(xiàn)得出結(jié)論：植物油甾醇餾分中含有少量的膽固醇。包括AOAC official method 970.51 及 CODEX STANDARD FOR NAMED VEGETABLE OILS CODEX-STAN 210 ( Amended 2003, 2005) 均有涉及；國(guó)內(nèi)很多文獻(xiàn)中也有關(guān)于植物油中膽固醇含量測(cè)

6、定報(bào)道。其中： AOAC official method 970.51明確提出 “Sterol fraction of some vegetable oils contains small amountsof cholesterol. Sterol fraction of palm oil may contain considerable amount of cholesterol.”法典標(biāo)準(zhǔn)： CODEX STANDARD FOR NAMED VEGETABLE OILS CODEX-STAN 210 ( Amended 2003, 2005)中 Other quality and comp

7、osition factors 中 Identity characteristics Levels of desmethylsterols in vegetable oils as a percentage of total sterols are given in Table 3. 中也顯示有膽固醇（ cholesterol）。因此：植物油中甾醇餾分中含有膽固醇。（ 3）膽固醇的存在形式油脂中的膽固醇有酯化狀態(tài)和游離狀態(tài)，在皂化過(guò)程中酯化狀態(tài)被釋放成游離狀態(tài)，因此前處理過(guò)程中必須要有皂化過(guò)程，才能準(zhǔn)確測(cè)定油脂中膽固醇總量。2.2、主要工作過(guò)程（ 1）資料檢索為了更好的完成標(biāo)準(zhǔn)任務(wù)，起草組查閱

8、相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)，在標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目研制前期直至2016 年 12 月份，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)體系中無(wú)任何標(biāo)準(zhǔn)用于食用油脂中膽固醇含量的測(cè)定，僅有三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)用于食品中膽固醇含量的測(cè)定，分別為： GB/T 5009.128-2003食品中膽固醇的測(cè)定、GB/T 9695.24-2008肉與肉制品膽固醇含量測(cè)定、 GB/T22220-2008 食品中膽固醇的測(cè)定 高效液相色譜法， 由于食用油中油脂含量過(guò)高， 這三種方法均不適用于油脂中膽固醇的含量測(cè)定，且三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的檢出限均很高，根本無(wú)法滿(mǎn)足食用油脂中低含量膽固醇測(cè)定的要求。22016 年 12 月 23 日，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委和國(guó)家食品藥品監(jiān)管總局發(fā)布了GB 5009.128-

9、2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膽固醇的測(cè)定，只有第一法適用于植物油脂中膽固醇的測(cè)定，采用氣相色譜法檢測(cè)，外標(biāo)法定量。本標(biāo)準(zhǔn)采用液相色譜 -質(zhì)譜質(zhì)譜法檢測(cè)，串聯(lián)四極桿質(zhì)譜是目前定性與定量最為準(zhǔn)確、靈敏度最高的檢測(cè)儀器；且本標(biāo)準(zhǔn)采用內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)，更能準(zhǔn)確測(cè)定動(dòng)植物油脂中膽固醇含量。（ 2）方案與計(jì)劃起草組在相關(guān)文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，確定了標(biāo)準(zhǔn)制訂方案和工作計(jì)劃。油脂中的膽固醇有酯化狀態(tài)和游離狀態(tài)，在皂化過(guò)程中酯化狀態(tài)被釋放成游離狀態(tài)，因此前處理過(guò)程中必須要有皂化過(guò)程，才能將測(cè)定中膽固醇總量。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化出不同類(lèi)型的樣品前處理?xiàng)l件、高效液相色譜質(zhì)譜條件、測(cè)定方法的線性范圍、方法檢出限、回收率等，并進(jìn)行

10、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法精密度的驗(yàn)證。（ 3）實(shí)際工作在大量文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，起草組根據(jù)我國(guó)糧油檢驗(yàn)技術(shù)的現(xiàn)狀，草擬了標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證方案和標(biāo)準(zhǔn)的征求意見(jiàn)稿，并制備了四個(gè)樣品，組織了多家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。2.3、研制期間成果標(biāo)準(zhǔn)研制期間已發(fā)表文章：1 徐彥輝，劉燕，丁磊 . 凝膠滲透色譜 -液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物油中膽固醇含量J.糧食與油脂，2017， 30(11)： 51-53.2 丁磊，胡艷云，韓芳等. 固相萃取 -液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)植物油脂中膽固醇J. 理化檢驗(yàn) -化學(xué)分冊(cè)， 2018， 54(5) ： 596-600.二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要研究技術(shù)內(nèi)容1、編制原則本標(biāo)準(zhǔn)是根

11、據(jù) GB/T 1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)與編寫(xiě)規(guī)則 和 GB/T 20001.4-2009 標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則第 4 部分：化學(xué)分析方法的規(guī)定進(jìn)行編制的。2、標(biāo)準(zhǔn)研究的主要內(nèi)容及原理本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)植物油脂中膽固醇含量測(cè)定方法的原理、試劑、儀器和設(shè)備、試樣制備、操作步驟、結(jié)果表示及精密度等內(nèi)容，適用于動(dòng)植物油脂中膽固醇含量的測(cè)定。方法原理：樣品經(jīng)無(wú)水乙醇 -氫氧化鉀溶液皂化，石油醚和無(wú)水乙醚混合溶液提取，固相萃取凈化后，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ LC-MS/MS ）進(jìn)行分析，內(nèi)標(biāo)法定量。操作步驟包括動(dòng)物油及植物油脂樣品前處理方法，液相色譜及串聯(lián)質(zhì)譜條件及樣品測(cè)定的內(nèi)容等。結(jié)果表

12、示確定了計(jì)算公式和結(jié)果保留位數(shù)的要求等。3、主要研制技術(shù)內(nèi)容3.1、動(dòng)植物油脂品種的選擇根據(jù) GB 10146-2015 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食用動(dòng)物油脂中規(guī)定食用動(dòng)物油脂，僅包括食用豬油、牛油、羊油、雞油和鴨油；植物油的種類(lèi)較多，有菜籽油、花生油、大豆油、玉米油、葵花籽油等。本標(biāo)準(zhǔn)在研制過(guò)程中動(dòng)物油脂選擇了豬油、牛油、鴨油；植物油脂選擇了菜籽油、花生油、大豆油、3玉米油、葵花籽油等作為研究對(duì)象。3.2、檢測(cè)方法的建立質(zhì)譜條件的建立質(zhì)譜條件的選擇主要包括 :離子源的選擇、母離子的選擇、子離子的選擇、檢測(cè)模式的選擇等。通過(guò)調(diào)節(jié)質(zhì)譜儀各參數(shù)使檢測(cè)離子達(dá)到較高的響應(yīng)強(qiáng)度，以提高檢測(cè)靈敏度。通過(guò)檢測(cè)模式

13、的選擇和質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，提高檢測(cè)的特異性。離子源的選擇膽固醇的測(cè)定中試驗(yàn)了不同的離子源。在電噴霧化學(xué)電離(ESI) 源下，膽固醇很難電離，因?yàn)槟懝檀嫉幕窘Y(jié)構(gòu)為環(huán)戊烷多氫菲，它由三個(gè)環(huán)己烷和一個(gè)環(huán)戊烷稠合而成，C17 位上還有長(zhǎng)鏈烷烴，這種結(jié)構(gòu)決定了膽固醇分子極性很弱，在ESI 源下膽固醇不能產(chǎn)生足夠強(qiáng)的離子，而大氣壓化學(xué)電離適合分析弱極性化合物，膽固醇及其氧化產(chǎn)物的離子產(chǎn)率較高，可以獲得較高的響應(yīng)值。由于 ESI 離子源主要適用于那些在溶液中易于離子化的極性物質(zhì)，這些物質(zhì)在ESI 源下通過(guò)離子蒸發(fā)，液相離子化方式電離，即利用電噴霧自身解離或通過(guò)在流動(dòng)相中、溶劑中添加揮發(fā)性的酸堿鹽等物質(zhì)，以產(chǎn)

14、生帶電離子，而進(jìn)行檢測(cè)。在ESI 源下，膽固醇及其氧化產(chǎn)物在液相條件很難電離，向流動(dòng)相中添加甲酸或乙酸， 調(diào)節(jié)質(zhì)譜儀的各項(xiàng)參數(shù)，可以檢測(cè)到膽固醇氧化產(chǎn)物信號(hào)，但此信號(hào)遠(yuǎn)不及APCI 源下檢測(cè)信號(hào)。APCI 源利用電暈放電離子化，氣相離子化。適合于檢測(cè)中等極性和小分子化合物，是甾體環(huán)結(jié)構(gòu)物質(zhì)常用的離子源。 膽固醇及其氧化產(chǎn)物在APCI 源下響應(yīng)很好，一般的條件即可產(chǎn)生較高的信號(hào)，不用為提高靈敏度而對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行細(xì)致的選擇優(yōu)化。因此選擇APCI 源作為檢測(cè)離子源。檢測(cè)模式的選擇APCI 離子源較容易使待測(cè)物帶上正電荷，且以M+H+ 居多。但在APCI 源、正離子模式下，膽固醇3位上的羥基易脫去成m

15、/z 369.3 的準(zhǔn)分子離子峰，此準(zhǔn)分子離子峰響應(yīng)信號(hào)很好，見(jiàn)圖1 的膽固醇的一級(jí)譜圖和圖 2 的一級(jí)譜圖的放大圖，從放大的圖中可以看出，膽固醇的直接M+H+ 的分子離子峰響應(yīng)很小，在譜圖中基本看不到，三度較大的主要是m/z 369.3 的準(zhǔn)分子離子峰。對(duì)m/z 369.3 進(jìn)行二級(jí)掃描質(zhì)譜分析，產(chǎn)生的主要碎片離子有m/z161.1， m/z147.1，其裂解方式見(jiàn)圖3。圖 1：膽固醇的一級(jí)譜圖4圖 2：一級(jí)質(zhì)譜圖的局部放大圖選擇 APCI 源的正離子模式進(jìn)行固醇檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證明，在SIM 和 MRM 檢測(cè)模式下，檢測(cè)膽固醇都能避免或減少油脂樣品中其它非膽固醇甾醇的干擾，響應(yīng)信號(hào)都很好，且檢測(cè)

16、特異性高。因此選擇在SIM 和MRM 兩種檢測(cè)模式下分析油樣中的膽固醇都是可以的，但是根據(jù)CAC 和 EU 第 657 /2002 /EEC 號(hào)決議中有關(guān)規(guī)定，選擇兩對(duì)離子進(jìn)行MRM監(jiān)測(cè)可更好的避免假陽(yáng)性的概率，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇了MRM 監(jiān)測(cè)模式。5圖 3：膽固醇的MS/MS 裂解方式母離子和子離子的選擇將膽固醇在 APCI 源正離子模式下進(jìn)行 Ql 分析，掃描范圍 m/z 50-400 。調(diào)節(jié)質(zhì)譜儀參數(shù)，其中影響最大的是 Fragmentor 電壓，該參數(shù)的合理設(shè)置能使母離子的響應(yīng)信號(hào)升高，且降低碎片離子峰。經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)，在 Fragmentor 電壓值為20V 時(shí)， Ql 產(chǎn)生的 m/z

17、369.3 的準(zhǔn)分子離子峰豐度最大，砒分別為399.4 和 401.4。膽固醇的 Ql 質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1 和 2。研究選擇m/z 369.3 準(zhǔn)分子離子分別作為膽固醇的母離子。將膽固醇的母離子分別進(jìn)行子離子掃描，并改變不同的質(zhì)譜參數(shù)，其中最主要的是碰撞能量(CE) 。隨著 CE 的改變，子離子的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行改變。實(shí)驗(yàn)最終選擇m/z161.1，m/z147.1 作為檢測(cè)的子離子，則膽固醇的 MRM 檢測(cè)離子對(duì)分別為m/z 369.3 161.1和 m/z 369.3 147.1。膽固醇的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4。圖 4：膽固醇的二級(jí)質(zhì)譜圖為獲得最佳的靈敏度，利用質(zhì)量濃度為1.0mg/L 的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在大

18、氣壓化學(xué)電離模式下進(jìn)行霧化器溫度、壓力；氣簾氣溫度、流速；電離電壓；電暈電流等參數(shù)優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1 質(zhì)譜條件。優(yōu)化后的離子源參數(shù)為：大氣壓化學(xué)電離源（APCI ）；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（ MRM ）；霧化氣溫度 350；霧化氣壓力30psi；氣簾氣溫度 325；氣簾氣流速6L/min ；電離電壓為 4500 v；電暈電流為8 A。碰撞氣（ CAD ）均為高純氮?dú)?。?1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（ MRM ）參數(shù)名稱(chēng)母離子（ m/z） 子離子（ m/z） 駐留時(shí)間 (ms)碰撞電壓（ V ）碰撞能量（ V ）備注161.110010020膽固醇369.3147.11

19、0010025為定量152.010010025離子對(duì)氘 6-膽固375.4醇166.510010020液相條件的建立液相色譜條件的優(yōu)化和選擇，與目標(biāo)化合物的靈敏度至關(guān)重要，特別是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀受基質(zhì)影響比較大，要選擇出合適的液相條件，包括流動(dòng)相的種類(lèi)、梯度條件、柱溫等。在優(yōu)化選擇過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，6甲醇作為流動(dòng)相響應(yīng)值比乙腈要高，因?yàn)榧状急纫揖哂懈〉馁|(zhì)子親和力，更易于幫助膽固醇3 位上的羥基易脫去成m/z 369.3 的準(zhǔn)分子離子峰。試驗(yàn)中考察了以甲醇或乙腈作為有機(jī)相，0.1% 的甲酸水溶液和5mM 乙酸銨水溶液作為水相，不同的溶劑組合作為流動(dòng)相的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)流動(dòng)相中含有0.1%的甲酸

20、水溶液時(shí)儀器的噪音明顯比含有5mM乙酸銨水溶液的流動(dòng)相要高；甲醇洗脫能力比乙腈強(qiáng)，甲醇（0.1%甲酸）為流動(dòng)相時(shí)1.3 分鐘就會(huì)出峰，出峰時(shí)間偏早，目標(biāo)物很容易受到基質(zhì)干擾。本文通過(guò)比較保留時(shí)間、響應(yīng)值、背景干擾和洗脫能力選擇了最合適的流動(dòng)相為5mM 乙酸銨水溶液和乙腈+甲醇（體積比，1： 1）作為流動(dòng)相，幾種流動(dòng)相下膽固醇峰形見(jiàn)下圖5。2.5x10）sp2.0x10c（度強(qiáng)1.5x10子離C1.0x10IT1 、 0.1%FA+ACN2、 0.1%FA+MEOH34、 0.1%FA+MEOH/ACN34、 5mMNH4AC+MEOH5、 5mMNH4AC+MEOH/ACN332313525.

21、0x100.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5T(min)圖 5 不同流動(dòng)相條件下膽固醇出峰情況最終液相色譜條件為：a) 色譜柱： Zorbox SB C18 （ 2.1mm×50mm， 1.8 m）或柱效相當(dāng)?shù)纳V柱；b) 柱溫： 35 ；c) 進(jìn)樣量： 10 L；d) 流速： 0.3 mL/min ；e) 流動(dòng)相：流動(dòng)相 A 為 5mM 乙酸銨水溶液，流動(dòng)相 B 為乙腈 +甲醇（體積比，1： 1），梯度洗脫程序見(jiàn)表 2。時(shí)間 /min表 2梯度洗脫程序A 相/%B 相/%0.0050501.0050501.0101008.000100

22、8.01505010.0050507、樣品皂化條件的選擇油脂中的膽固醇有酯化狀態(tài)和游離狀態(tài)，在皂化過(guò)程中酯化狀態(tài)被釋放成游離狀態(tài)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，動(dòng)植物油脂中均含有兩種狀態(tài)的膽固醇，所以前處理過(guò)程中必須要有皂化過(guò)程,才能準(zhǔn)確測(cè)定膽固醇含量。在選擇皂化條件時(shí)首先比較了GB/T22220-2008 、 GB/T9695.24-2008 、 GB/T5009.128-2003及 AOACofficial method933.08 皂化條件，這幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)皂化條件都大致相似，選擇在無(wú)水乙醇條件下，用氫氧化鉀溶液皂化，不同的是氫氧化鉀濃度、皂化時(shí)間不同及皂化裝置不同。皂化裝置方面本實(shí)驗(yàn)選擇了250mL 圓底燒

23、瓶裝上30cm 蛇形磨口冷凝管于沸水浴中回流。本實(shí)驗(yàn)選擇了葵花籽油和豬油作為研究對(duì)象優(yōu)化氫氧化鉀濃度、皂化時(shí)間。兩種不同油脂氫氧化鉀濃度、皂化時(shí)間優(yōu)化數(shù)據(jù)相似，最終選擇皂化時(shí)間為60min ，氫氧化鉀濃度為60%氫氧化鉀（質(zhì)量比）?；厥章驶厥章?0010080)60%(50率率40收收回回2000-5 0 5 10152025303540455055606570758085020406080100氫氧化鉀濃(%)度皂化時(shí)間min)（圖 6 皂化時(shí)間、氫氧化鉀濃度優(yōu)化按照此條件進(jìn)行皂化，葵花籽油和豬油樣品的皂化液均能至澄清透明狀態(tài)。（ a） 0.5g 油樣（ b）添加無(wú)水乙醇和氫氧化鉀（ c）皂

24、化 60min 后圖 7動(dòng)物油脂皂化前后對(duì)比8、提取條件的優(yōu)化同樣參考了 GB/T22220-2008 、GB/T9695.24-2008 、 GB/T5009.128-2003 及 AOAC official method933.08 提取條件， 按照 GB/T22220-2008 中提取條件： 將皂化液轉(zhuǎn)移至 250mL 分液漏斗中， 用 30mL 去離子水分兩次沖洗錐形瓶，洗液并入分液漏斗，再用40mL 石油醚 +乙醚（體積比，1：1）分兩次沖洗錐形瓶并入分液漏斗，輕輕振搖2min，靜置分層。轉(zhuǎn)移下層水相至另一250mL 分液漏斗，再用30mL 石油醚 +乙醚（體積比， 1： 1）提取一

25、次，合并有機(jī)相。用去離子水每次100mL 洗滌提取液至中性，初次水洗滌時(shí)輕搖，防止乳化，提取液通過(guò)裝有10g 無(wú)水硫酸鈉的玻璃漏斗脫水后轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中濃縮至干，加入5mL 正己烷復(fù)溶待凈化，葵花籽油和豬油回收率為76 106%。、樣品凈化條件的選擇在標(biāo)準(zhǔn)研制過(guò)程中比較了凝膠滲透色譜和固相萃取兩種凈化方式的效果，通過(guò)比較回收率選擇合適的凈化方式。研究對(duì)象選擇了含量較低的植物油做為研究對(duì)象，凈化條件優(yōu)化時(shí)選擇了膽固醇本底值為0.56mg/kg 葵花籽油做為加標(biāo)回收對(duì)象。凝膠滲透色譜儀凈化效果首先在葵花籽皂化待凈化基質(zhì)中添加膽固醇，分段收集凝膠滲透色譜儀的餾出液，前7min 不收集，分別收集 7-1

26、0min 、 10-13min 、 13-16min 、 16-19min 、 19-21min 、 21-24min 、 24-27min 、 27-30min 、 30-33min餾出液氮吹后供液質(zhì)分析，結(jié)果表明在16-21min 膽固醇出峰， 最終凝膠滲透色譜儀的收集時(shí)間為16-21min 。但是，在葵花籽油中添加0.5mg/kg 、 1.0mg/kg 和 2.0mg/kg 三個(gè)不同濃度膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行皂化并過(guò)凝膠滲透色譜凈化，最終平均回收率數(shù)據(jù)為 134%、63%和 55%，經(jīng)多次測(cè)試回收率和樣品數(shù)據(jù)的平行性較固相萃取穩(wěn)定性較差，最終并未選擇凝膠滲透色譜做為凈化方式。固相萃取凈化效果

27、凝膠滲透色譜儀凈化時(shí)回收率和平行性較差，在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上選擇了固相萃取凈化方式。根據(jù)膽固醇弱極性特點(diǎn)，本標(biāo)準(zhǔn)選擇了硅膠固相萃取柱凈化，硅膠固相萃取柱非常適合用來(lái)分離結(jié)構(gòu)相似的弱極性化合物，主要用于從非極性溶劑如烴類(lèi)、鹵代烴或較弱極性的酯或醚中吸附分析物；然后用極性更強(qiáng)的溶劑如極性醚、酯、醇、乙腈或水進(jìn)行洗脫。在非極性溶劑中的分析物萃取過(guò)程中，逐步添加極性改性劑的濃度來(lái)漸進(jìn)提高溶劑的極性，可以得到更加完美的萃取結(jié)果和回收率。根據(jù)這種思路設(shè)計(jì)，再參考相關(guān)文獻(xiàn)考察了兩種不同極性濃度的溶液0.5%乙醚的正己烷溶液和15%乙醚的正己烷溶液，分別做為淋洗液和洗脫液，優(yōu)化過(guò)程具體為從上樣開(kāi)始收集溶液，上樣

28、液為5 mL ，淋洗液和洗脫液分別為20 mL ，每 5 mL 收集一次，研究發(fā)現(xiàn)膽固醇在上樣和淋洗過(guò)程中沒(méi)有析出，洗脫液前10 mL 被洗脫出來(lái)，回收率96% ，具體見(jiàn)圖。采用硅膠固相萃取柱凈化，能滿(mǎn)足動(dòng)植物油脂中膽固醇含量測(cè)定。980706050403020100液1液1液2液3液4液1液2液3液4樣洗洗洗洗脫脫脫脫上淋淋淋淋洗洗洗洗圖 8固相萃取條件優(yōu)化圖圖 9試劑空白圖3.3、方法驗(yàn)證線性范圍在優(yōu)化的測(cè)定條件下，配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物定量離子的峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表 3。結(jié)果表明，在 0.2 5.0 g/mL 范圍內(nèi)，膽固醇的質(zhì)量濃度

29、和定量離子的峰面積呈良好的線性關(guān)系。表 3 線性方程、線性范圍線性方程相關(guān)系數(shù)線性范圍 /( mL)g/備注膽固醇Y = 4316.5926+0.25.0402.4090* X0.9998加標(biāo)回收率及精密度同一油樣中不同添加濃度的回收率及精密度選擇了本底值為 0.56mg/kg 的市售葵花籽油脂樣品 （品牌代號(hào) DL ），分別準(zhǔn)確平行稱(chēng)取 6 份油樣樣品，添加兩種濃度 0.5、1 和 5mg/kg 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，結(jié)果如下：10表 4 膽固醇添加回收率及精密度（n=6 ）試樣序號(hào)加標(biāo)濃度測(cè)試結(jié)果（含本底）回收率 X平均回收(mg/kg)X(mg/100g)（）率 (

30、%)DL-11.0088.0DL-21.0190.0DL-30.50.9680.091.3DL-41.0394.0DL-51.0190.0DL-61.09106DL-71.5397.0DL-81.4993.0DL-91.01.4488.089.8DL-101.4286.0DL-111.4286.0DL-121.4589.0DL-134.9398.6DL-144.5891.6DL-1555.0510196.3DL-164.8597.0DL-174.6793.4DL-184.8296.4不同油樣中添加濃度的回收率及精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)9.354.853.54準(zhǔn)確稱(chēng)取6 組不同油樣樣品，分別添加

31、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，結(jié)果如下：表 5 不同膽固醇添加回收率及精密度（n=6）項(xiàng)目調(diào)和油葵花仁油花生油大豆油豬油鴨油加標(biāo)濃度 (mg/kg)10.03.03.010500500本底值 (mg/kg)9.911.452.736.66760550平均測(cè)試結(jié)果17.513.915.3114.961155.0995.0X(mg/kg)平均回收率768286837989X （）精密度（ %）5.126.245.483.212.152.683.3.3 方法檢出限和定量限本標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限和定量限，根據(jù)GB/T27417-2017 選擇通過(guò)檢測(cè)出分析物最低濃度值的方法確定。因?yàn)橹参镉椭?/p>

32、都含有膽固醇，沒(méi)有完全空白的樣品，因此選擇有本底值的葵花籽油做為檢出限研究對(duì)象，通過(guò)不斷降低稱(chēng)樣量檢測(cè)并結(jié)合試劑空白的測(cè)量信號(hào)進(jìn)行比較，選擇 S/N=3時(shí)最低的出峰濃度為方法檢出限，本方法檢出限為0.10mg/kg ，定量限為 0.30 mg/kg 。113.3.4 與傳統(tǒng)方法比較的優(yōu)勢(shì)及實(shí)際樣品檢測(cè)比較了液相色譜儀和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀兩種結(jié)果，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中液質(zhì)儀器同時(shí)有光電二極管列陣檢測(cè)器 (DAD) 和質(zhì)譜檢測(cè)器， 所有數(shù)據(jù)可以同時(shí)測(cè)定光譜數(shù)據(jù)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在同樣的色譜分離條件下，液相的結(jié)果為：膽固醇在1mg/L 濃度時(shí)才能出峰，膽固醇在0.2 5mg/L 范圍內(nèi)不成線性，而很多植物油脂中膽

33、固醇含量均在 0.5mg/100g 以下，所以無(wú)法用液相色譜儀無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量測(cè)定含量較低的植物油脂樣品中膽固醇；而本文采用的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀在0.2 5mg/L 范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)為大于0.995，在0.05 和 0.1 mg/100g 添加水平時(shí)，加標(biāo)回收率在96.0 106% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，檢出限為 0.1mg/kg ，完全滿(mǎn)足低含量膽固醇油脂的測(cè)定，方法的靈敏度和穩(wěn)定性明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道的方法。表 6 實(shí)際動(dòng)植物油脂中膽固醇含量測(cè)定試樣序號(hào)樣品名稱(chēng)平均值（ mg/kg ）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 %1食用調(diào)和油9.913.222壓榨葵花仁油1.453.623壓榨一級(jí)花生油

34、2.731.264壓榨特香菜籽油23.52.415綠色菜籽油25.03.216一級(jí)大豆油6.663.567葵花籽油0.562.418玉米油14.83.569豬油7602.3610鴨油5502.89參考文獻(xiàn)1 丁卓平，王明華，劉振華，等 .食品中膽固醇含量測(cè)定方法的研究與比較J.食品科學(xué)， 2004，25(1) ：130-135.2周永生， 羅士平，孔泳 .固相萃取 -氣相色譜 -液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)地溝油中膽固醇J. 色譜， 2012，30(2) ：207-210.3郭濤，杜蕾蕾，萬(wàn)輝，何東平.高效液相色譜法測(cè)定膽固醇含量鑒別地溝油J. 食品科學(xué)， 2009 ， 30(22)：286-289.4 何文

35、絢，杜方潤(rùn)，李艷霞，等 .快速測(cè)定植物油膽固醇含量在地溝油篩查中的應(yīng)用J. 分析化學(xué)研究報(bào)告，2015， 43(3)： 394-398.5 DB34/T 1765-2012 ， 動(dòng)物油脂中膽固醇含量的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法.6 陳紅，楊梅，朱蓉，等 .超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜法測(cè)定火鍋油、潲水油及地溝油中膽固醇含量J.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2011， 23(5) ： 429-432.7 許秀麗， 任荷玲， 李娜，等.氘代同位素內(nèi)標(biāo)-氣相色譜 -質(zhì)譜法測(cè)定膽固醇含量鑒別地溝油的研究J.檢驗(yàn)檢疫科學(xué)， 2012， 22(2)： 16-23.8 朱蓉，陳紅，楊梅，等 .UPLC-MS/MS 法測(cè)定常用植物油料中膽固醇含量J. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2012 ，22(1) ： 14-18.9張麗，湯佳佳，徐國(guó)兵，等.高效液相色譜法測(cè)定牛奶中的膽固醇J.食品科學(xué)， 2012，33(2)：216-218.10郭瑋，陳方俊，潘柏中 .膽固醇檢測(cè)方法的發(fā)展歷史及標(biāo)準(zhǔn)化J. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)， 2013， 28(11)：970-973.11盛靈慧，王晶，武利慶等 .液相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定蛋粉中膽固醇含量J.食品科學(xué)， 2008，29(12) ：632-634.12余雯靜，鄭利，沈崇玉 .地溝油中膽固醇的 LC/MS/MS 定性定量檢測(cè)J.