菌種擴大培養(yǎng)

1、會計學(xué)1菌種擴大培養(yǎng)菌種擴大培養(yǎng) 種子擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。 發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中的種子的必須滿足以下條件：（1）菌種細(xì)胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；（2）生理性狀穩(wěn)定；（3）菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；（4）無雜菌污染； （5）保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。 在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，種子制備的過程大致可分為兩個階段：（1）實驗室種子制備階段 （2）生產(chǎn)車間種子制備階段 一、實驗室種子的制備一、實驗室種子的制備實驗

2、室種子的制備一般采用兩種方式：產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可用液體培養(yǎng)法。（一）孢子的制備1、細(xì)菌的制備細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富。培養(yǎng)溫度一般為37。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時間12d，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)510d。2、霉菌的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為25-28。培養(yǎng)時間一般為414d。3、放線菌的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和

3、無機鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28。培養(yǎng)時間5-14d。（二）液體種子制備1、好氧培養(yǎng)對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S. griseus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。其過程如下： 試管三角瓶搖床種子罐 2、厭氧培養(yǎng)酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）其種子的制備過程如下：試管三角瓶卡式罐種子罐 例如例如: 生產(chǎn)啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂或MYPG培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配制：3g麥芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨，10g葡萄糖和20g瓊脂于1L水中）的斜面上，于4冰箱內(nèi)保藏。每年移種3-4次。 將保存的酵母菌種接

4、入含10ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25培養(yǎng)2-3d。 再擴大至含有250-500ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25培養(yǎng)2d. 移種至含有5-10L麥芽汁的卡氏培養(yǎng)罐中，于15-20培養(yǎng)3-5d即可作100L麥芽汁的發(fā)酵罐種子。從三角瓶到卡氏培養(yǎng)罐培養(yǎng)期間，均需定時搖動或通氣，使酵母菌液與空氣接觸，以有利與酵母菌的增殖。二、生產(chǎn)車間種子制備二、生產(chǎn)車間種子制備 種子罐的培養(yǎng)基因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，需氧菌，還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布。 1、種子罐的作用使孢子發(fā)芽，生長繁殖

5、成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達(dá)到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。2、種子罐級數(shù)的確定 種子罐級數(shù)種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于：（1）菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；（2）所采用發(fā)酵罐的容積。 比如：細(xì)菌細(xì)菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 霉菌霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵 孢子懸浮液一級種子罐（27,40h孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）二級種子罐（27，10-24h，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）發(fā)酵罐放線菌放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵酵母酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子 3、確定種子罐級數(shù)需注意的問題（1）

6、種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會（2）種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會（3）雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。 第二節(jié)第二節(jié) 種子質(zhì)量的控制種子質(zhì)量的控制一一、影響種子質(zhì)量的因素及控制、影響種子質(zhì)量的因素及控制影響種子質(zhì)量的因素通常有：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間和冷藏時間等。1、培養(yǎng)基種子質(zhì)量不穩(wěn)定的主要原因是原材料質(zhì)量波動。 例如：在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢

7、子質(zhì)量的影響也不同。蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響不同。原材料質(zhì)量的波動，也會影響孢子質(zhì)量。如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。 水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，影響種子質(zhì)量。 菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。 解決措施解決措施：（1）培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗合格才可使用；（2）嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；（3）斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時間；（4）供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)

8、基則采用較復(fù)雜的有機氮源。2、培養(yǎng)條件（1）溫度 如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。一般要嚴(yán)格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。（2）濕度 制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子數(shù)量和質(zhì)量有較大影響。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子制備時發(fā)現(xiàn)：氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。表2-1 不同相對濕度對龜裂鏈霉菌斜面生長的影響相對濕度（%）斜面外觀活孢子計數(shù)（億/支

9、）16.51925364045上部稀薄下部稠略黃上部薄中部均勻發(fā)白一片白，孢子豐富，稍皺1.22.35.73、培養(yǎng)時間和冷藏時間（1）培養(yǎng)時間一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因為衰老的孢子已在逐步進入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。解決措施解決措施：孢子培養(yǎng)的時間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。（2）冷藏時間斜面冷藏對孢子質(zhì)量影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4d左右即于4冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7-8d菌體細(xì)胞開始自溶。而培養(yǎng)5d以后冷藏，20d未發(fā)現(xiàn)自溶。 冷藏時間對孢子生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢

10、子在6冷藏兩個月后發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。 4、接種量 接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進而影響菌體的生理狀況。也影響到菌種的適應(yīng)期。 二、影響種子質(zhì)量的因素及控制生產(chǎn)過程中影響種子質(zhì)量的因素通常有：孢子的質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡、接種量。1、培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基要滿足以下要求：（1）營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要 （2）選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基； （3）營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用； （4）營養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高 （5）營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。 2、培養(yǎng)條件（1）溫度（2）通氣量在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易

11、被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級種子罐的通氣量小對發(fā)酵有利。3、種齡種齡種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達(dá)到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。 不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實驗來確定。如嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時最好（見下

12、圖）。4、接種量接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。通常接種量，細(xì)菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有時2025% 三、種子質(zhì)量的控制措施三、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的

13、適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。因此在生產(chǎn)過程中通常進行以下兩項檢查。（1）菌種穩(wěn)定性的檢查 （2）無（雜菌）檢查 四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1、細(xì)胞或菌體菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等） 單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)； 霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。 2、生化指標(biāo)種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。3、產(chǎn)物生成量在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因為種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。4、酶活力種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一

14、定的關(guān)聯(lián)。 五、種子異常分析五、種子異常分析 菌種生長速度，過快或過慢 菌絲結(jié)團菌絲粘壁 感染噬菌體第四節(jié)第四節(jié) 實例實例一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴大培養(yǎng)一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴大培養(yǎng)斜面菌種一級種子培養(yǎng)二級種子培養(yǎng)發(fā)酵罐1、斜面菌種的培養(yǎng)菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機氮而不含或少含糖為原則。(1)斜面培養(yǎng)基組成葡萄糖 0.1%，蛋白胨 1.0%，牛肉膏 1.0%，氯化鈉 0.5%，瓊脂 2.02.5%，pH 7.07.2（傳代和保藏斜面不加葡萄糖）。(2)培養(yǎng)條件3334，培養(yǎng)1824h。2、一級

15、種子培養(yǎng)一級種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分，多含有機氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長菌考慮。(1)培養(yǎng)基組成葡萄糖 2.5%，尿素 0.5%，硫酸鎂 0.04%，磷酸氫二鉀 0.1%，玉米漿 2.53.5%(按質(zhì)增減)，硫酸亞鐵、硫酸錳各2ppm，pH7.0。(2)培養(yǎng)條件用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基200mI，滅菌后置于沖程7.6cm、頻率96次/min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度3334。(3)一級種子質(zhì)量要求種齡：12h，pH值：6.40.1光密度：凈增OD值0.5以上殘?zhí)牵?.5以下 無菌檢查：(-)噬菌體檢查：(-)鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列

16、整齊革蘭氏陽性反應(yīng)。3、二級種子培養(yǎng)為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進而擴大到種子罐的二級種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。(1)培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成（%）T6-13B9T738AS1.299水解糖玉米漿磷酸氫二鉀硫酸鎂尿素Fe+（ppm）Mn+（ppm）pH2.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.20.050.5227.02.52.50.10.040.5226.5-6.8(2)培養(yǎng)條件接種量：0.81.0培養(yǎng)溫度：3234培養(yǎng)時間：78h通風(fēng)量：

17、50L種子罐1:0.5攪拌轉(zhuǎn)速340rmin；250L種子罐1:0.3攪拌轉(zhuǎn)速300r min500L種子罐1:0.25攪拌轉(zhuǎn)速230r min(3)二級種子的質(zhì)量要求種齡：78hpH：7.2左右OD值凈增0.5左右無菌檢查(-)噬菌體檢查(-)二、啤酒酵母的擴大培養(yǎng)二、啤酒酵母的擴大培養(yǎng)一般可采用三級擴大培養(yǎng)，擴大倍數(shù)：第1級到第2級為8-10倍，第2級到第3級為4-6倍。 1、實驗室擴大培養(yǎng) 三、三、 生產(chǎn)發(fā)酵罐的無菌接種生產(chǎn)發(fā)酵罐的無菌接種生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐的接種，包括兩個方面：從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器中移種入一個種子罐；從一個種子罐移入另一個生產(chǎn)發(fā)酵罐中。 （1）從實驗室搖瓶或孢子懸浮

18、液容器接種通常有兩種方式凍結(jié) 例如例如: 生產(chǎn)啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂或MYPG培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配制：3g麥芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨，10g葡萄糖和20g瓊脂于1L水中）的斜面上，于4冰箱內(nèi)保藏。每年移種3-4次。 將保存的酵母菌種接入含10ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25培養(yǎng)2-3d。 再擴大至含有250-500ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25培養(yǎng)2d. 移種至含有5-10L麥芽汁的卡氏培養(yǎng)罐中，于15-20培養(yǎng)3-5d即可作100L麥芽汁的發(fā)酵罐種子。從三角瓶到卡氏培養(yǎng)罐培養(yǎng)期間，均需定時搖動或通氣，使酵母菌液與空氣接觸，以有利與酵母菌的增殖。二、生產(chǎn)車間種子制備二、生產(chǎn)車間種子制備 種子罐的培養(yǎng)基因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利