淋巴瘤基因克隆性重排檢測

1、專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).Focus On Molecular Diagnosis | Leading Precision Medicine.形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué) （Morphology） 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳(CE) 熒光實時定量熒光實時定量PCR(RTQT-PCR) 一代測序一代測序(Sanger) 二代測序二代測序(NGS)分子生物學(xué)分子生物學(xué) （Molecular） 免疫組化（IHC） 流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（FCM）免疫學(xué)免疫學(xué) （Immunology） 熒光原位雜交（熒光原位雜交（FISH）細(xì)胞遺傳學(xué)（細(xì)胞遺傳學(xué)（Cytoge

2、netics）輔助診斷輔助診斷預(yù)后分析預(yù)后分析指導(dǎo)用藥指導(dǎo)用藥MRD檢測檢測血液腫瘤（常規(guī)腫瘤）檢測方案血液腫瘤（常規(guī)腫瘤）檢測方案-MICM綜合分子檢測綜合分子檢測(旌準(zhǔn)方案旌準(zhǔn)方案)專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).分子檢測檢測基因方法IG/TCR基因重排基因重排IGH，IGK，IGL，TRB，TRD，TRGGEL (PAGE)ABI (CE)NGSIGHV超突變超突變IGHGEL (PAGE)ABI (CE)NGS基因突變基因突變EZH2, DNMT3A, IDH2SangerNGSMoffitt, A. B. and S. S. Dave (2017). J Clin Oncol 35(

3、9): 955-962.分子檢測分子檢測-淋巴瘤淋巴瘤Focus On Molecular Diagnosis | Leading Precision Medicine.淋巴細(xì)胞克隆性基因重排檢測產(chǎn)品特點(diǎn)淋巴細(xì)胞克隆性基因重排檢測產(chǎn)品特點(diǎn)專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).B-Cell Receptors (BCR) /Immunoglobulins (Ig) T-Cell Receptor (TCR)蛋白基因染色體定位Ig重鏈IGH14q32Ig輕鏈 IGK2p12Ig輕鏈IGL22q11蛋白基因染色體定位TCRTCRTRA14q11TCRTCRTRB7q32TCRTCRTRG7p15 TCRT

4、CRTRD14q11.2淋巴細(xì)胞克隆性基因重排檢測的目標(biāo)分子淋巴細(xì)胞克隆性基因重排檢測的目標(biāo)分子Ig和和TCR-單一單一基因重排，即惡性淋巴細(xì)胞基因重排，即惡性淋巴細(xì)胞專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).IGH, TRB & TRD: V, D, and J IGK, IGL, and TRG: V and J regions 正常正常淋巴細(xì)胞成熟過程/良性病變多多克隆性多種多種形式的基因重排惡性惡性淋巴瘤發(fā)生的過程單單克隆性突出單一單一形式的基因重排多樣性與克隆性多樣性與克隆性專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).鑒別診斷：明確是淋巴組織反應(yīng)性還是淋巴細(xì)胞惡性增殖鑒別診斷：明確是淋巴組織反應(yīng)性

5、還是淋巴細(xì)胞惡性增殖輔助診斷：少見類型淋巴瘤，如肝脾輔助診斷：少見類型淋巴瘤，如肝脾T T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞淋巴瘤亞類分析：明確是亞類分析：明確是B B淋巴惡性增殖還是淋巴惡性增殖還是T T細(xì)胞惡性增殖細(xì)胞惡性增殖區(qū)分同一患者兩種淋巴細(xì)胞惡性腫瘤，包括復(fù)發(fā)與繼發(fā)淋巴瘤區(qū)分同一患者兩種淋巴細(xì)胞惡性腫瘤，包括復(fù)發(fā)與繼發(fā)淋巴瘤微小殘留病灶監(jiān)測，評估治療效果或復(fù)發(fā)風(fēng)險（微小殘留病灶監(jiān)測，評估治療效果或復(fù)發(fā)風(fēng)險（NGSNGS方法）方法）細(xì)胞免疫治療監(jiān)測，監(jiān)測回輸細(xì)胞免疫治療監(jiān)測，監(jiān)測回輸T T細(xì)胞增殖狀況和淋巴組織來源腫瘤細(xì)胞清除效果（細(xì)胞增殖狀況和淋巴組織來源腫瘤細(xì)胞清除效果（NGSNGS）5%15%的病

6、例表現(xiàn)復(fù)雜，即使做了大量的免疫標(biāo)志也可能難以鑒別其良惡性，需要進(jìn)一步的手段區(qū)分。的病例表現(xiàn)復(fù)雜，即使做了大量的免疫標(biāo)志也可能難以鑒別其良惡性，需要進(jìn)一步的手段區(qū)分。利用分子生物學(xué)手段分析利用分子生物學(xué)手段分析Ig和和TCR基因的克隆性重排被基因的克隆性重排被WHO公認(rèn)為該疾病診斷手段的重要補(bǔ)充。公認(rèn)為該疾病診斷手段的重要補(bǔ)充。淋巴細(xì)胞克隆性基因重排檢測的臨床意義淋巴細(xì)胞克隆性基因重排檢測的臨床意義專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).基于PCR檢測技術(shù)，簡便、快速、成本較低，所需DNA量少，對DNA質(zhì)量要求不高。靈敏度高于10%，需配制膠，安全清潔性較差。基于PCR-毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)，敏感性高，檢

7、測周期較長，結(jié)果更加直觀可靠目前市場最被接受的檢測方法。靈敏度無法滿足MRD要求要求，難以定量和得到序列。新興技術(shù)，更高靈敏度（10-6），更高分辨率，更高的通量，更廣泛的應(yīng)用。但成本高，儀器貴，操作復(fù)雜，時間長。（IGH, IGK,）（）（IGL）（）（TRB ,TRD,）（）（ TRG）BIOMED-2方方案，唯一授權(quán)案，唯一授權(quán)）IGHV（依據(jù)（依據(jù)ERIC指南）指南）IGH, IGK, TRB , TRGIGHV基于不同方法的產(chǎn)品系列基于不同方法的產(chǎn)品系列-Invivoscribe公司公司專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).Invivoscribe公司的IdentiCloneTM系列產(chǎn)品是

8、基于PCR的克隆性檢測產(chǎn)品，是BIOMED-2唯一授權(quán)唯一授權(quán)的商品化試劑，獲得CE認(rèn)證，以其高度的靈敏性和特異性，成為可疑淋巴組織增生性疾病克隆性分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”。IdentiCloneTM系列產(chǎn)品具有精心優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)化試劑組成，具有最豐富的陽性對照，涵蓋各種TB細(xì)胞重排類型，經(jīng)過了超過400例的臨床樣本驗證，按照臨床產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)檢和質(zhì)控，反應(yīng)體系穩(wěn)定，結(jié)果可靠。從從Biomed-2到到Invivoscribe-唯一授權(quán)唯一授權(quán)專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).Biomed-2研究項目研究項目專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).Biomed-2研究項目（研究項目（IGH為例）為例）van Don

9、gen, J. J. M., et al. (2003). Leukemia 1717: 2257.專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).Biomed-2研究項目（研究項目（IGH為例）為例）van Dongen, J. J. M., et al. (2003). Leukemia 1717: 2257.專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).結(jié)果分析結(jié)果分析（單）克隆性（單）克隆性：擴(kuò)增產(chǎn)物電泳在：擴(kuò)增產(chǎn)物電泳在預(yù)期大小范圍內(nèi)一或雙條帶（峰）預(yù)期大小范圍內(nèi)一或雙條帶（峰）送檢組織中，淋巴細(xì)胞抗原受體基因的送檢組織中，淋巴細(xì)胞抗原受體基因的重排方式為單一性重排方式為單一性。表明組織中存在。表明組織中存在單克

10、隆性增生單克隆性增生的細(xì)胞群。的細(xì)胞群。多克隆性多克隆性：擴(kuò)增產(chǎn)物電泳呈：擴(kuò)增產(chǎn)物電泳呈彌散涂抹狀彌散涂抹狀(smear)或階梯狀或階梯狀(高斯分布）高斯分布） 送檢組織中，淋巴細(xì)胞抗原受體基因的送檢組織中，淋巴細(xì)胞抗原受體基因的重排方式為多樣性重排方式為多樣性。表明組織中。表明組織中不存在單克隆性增生不存在單克隆性增生的細(xì)胞群。的細(xì)胞群。 無擴(kuò)增產(chǎn)物無擴(kuò)增產(chǎn)物：PCRPCR擴(kuò)增后電泳擴(kuò)增后電泳未見未見產(chǎn)物產(chǎn)物送檢組織中的細(xì)胞，抗原受體基因送檢組織中的細(xì)胞，抗原受體基因無重排（無重排（NK，非淋巴細(xì)胞）或，非淋巴細(xì)胞）或DNA質(zhì)量過差質(zhì)量過差。Products are heterodulex-

11、treated followed by PAGE on 6% gel250bp-300bp-400bp-IGH B(250-295bp)200bp-500bp-175bp-150bp-markermarkerP PMMH H2 2OOS1S1S1S1S2S2S2S2專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).淋巴瘤應(yīng)用基因重排檢測進(jìn)行輔助淋巴瘤應(yīng)用基因重排檢測進(jìn)行輔助/鑒別診斷的方案鑒別診斷的方案專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué). 檢測到克隆性重排未必一定發(fā)生惡性病變檢測到克隆性重排未必一定發(fā)生惡性病變某些良性增生也可呈克隆性重排，如CD8+T細(xì)胞淋巴增生性病變、良性單克隆性丙種球蛋白病、皮膚淋巴瘤樣丘疹病

12、、免疫缺陷患者嚴(yán)重的EB病毒感染等； 檢測不到克隆性重排也不能排除惡性病變檢測不到克隆性重排也不能排除惡性病變某些明確惡性病變的免疫缺陷患者中偶爾檢測不到克隆性重排，NK/T細(xì)胞淋巴瘤中IG和TCR基因呈胚系結(jié)構(gòu)，即也無克隆性重排。 IG或或TCR基因的重排不一定是譜系的標(biāo)志基因的重排不一定是譜系的標(biāo)志特別是大多數(shù)前驅(qū)淋巴細(xì)胞性腫瘤中存在譜系交叉，如血管免疫母細(xì)胞學(xué)淋巴瘤（AITL）。單一發(fā)生可反映譜系，同時陽性只表示克隆性增生，不能判斷譜系來源。 假陽性和假陰性假陽性和假陰性技術(shù)，引物，反應(yīng)條件 分子克隆性結(jié)果分析，應(yīng)結(jié)合臨床、形態(tài)學(xué)和免疫表型特征，方可做出淋巴瘤的最終診斷和分類。分子克隆性

13、結(jié)果分析，應(yīng)結(jié)合臨床、形態(tài)學(xué)和免疫表型特征，方可做出淋巴瘤的最終診斷和分類。注意事項注意事項專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).對以下疾病提供重要預(yù)后信息對以下疾病提供重要預(yù)后信息:慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)前提：前提：IGH克隆性重排為單克隆例外：例外： V3-21重排區(qū)表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，與IGHV突變狀態(tài)無關(guān)。SHM 判斷標(biāo)準(zhǔn)：判斷標(biāo)準(zhǔn)：IGHV突變比例2% 2%SHM狀態(tài)為突變突變PFS1-5年9.2-18.9年OS3.2-10年17.9-25.8年預(yù)后不良良好IGH V區(qū)的區(qū)的SHM狀態(tài)檢測被推薦為新診斷狀態(tài)檢測被推薦為新診斷CLL患者預(yù)后分析的生物標(biāo)志物?；颊哳A(yù)后分析的生物標(biāo)志物。P

14、FS：無進(jìn)展生存期（Progression free survival）OS：總生存期（Overall survival）中國CLL/SLL的診斷與治療指南（2018版）IGH V區(qū)體細(xì)胞超突變檢測的臨床意義區(qū)體細(xì)胞超突變檢測的臨床意義專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).基于PCR檢測技術(shù)，簡便、快速、成本較低，所需DNA量少，對DNA質(zhì)量要求不高。靈敏度高于10%，需配制膠，安全清潔性較差。基于PCR-毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)，敏感性高，檢測周期較長，結(jié)果更加直觀可靠目前市場最被接受的檢測方法。靈敏度無法滿足MRD要求，難以定量和得到序列。新興技術(shù)，更高靈敏度（10-6），更高分辨率，更高的通量，更廣

15、泛的應(yīng)用。但成本高，儀器貴，操作復(fù)雜，時間長。IGH, IGK, IGL, TRB ,TRD, TRG（BIOMED-2方案，唯一授權(quán)方案，唯一授權(quán)）IGHV（依據(jù)（依據(jù)ERIC指南）指南）IGH, IGK, TRB , TRGIGHV基于不同方法的產(chǎn)品系列基于不同方法的產(chǎn)品系列-Invivoscribe專注分子診斷 | 引領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué).結(jié)合 Leader 和 FR1 區(qū)域的引物在 5端連接有通用的測序片段，這種設(shè)計，配合 JH 反向測序引物，能夠?qū)崿F(xiàn) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的雙向測序。目前，歐洲慢性淋巴細(xì)胞性白血病研究機(jī)構(gòu)（歐洲慢性淋巴細(xì)胞性白血病研究機(jī)構(gòu)（European Research Initiative on CLL，ERIC）的指南）的指南即使用雙向測序判斷 IGH V區(qū)體細(xì)胞