蛋白質(zhì)和氨基酸測(cè)定學(xué)時(shí)概述

1、1會(huì)計(jì)學(xué)蛋白質(zhì)和氨基酸測(cè)定學(xué)時(shí)概述蛋白質(zhì)和氨基酸測(cè)定學(xué)時(shí)概述蛋白質(zhì)含量低大蛋白質(zhì)含量低大頭娃娃頭娃娃蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量“高高”，腎結(jié)石腎結(jié)石為何測(cè)定蛋白質(zhì)為何測(cè)定蛋白質(zhì)1 1、重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 嬰幼兒配方乳粉嬰幼兒配方乳粉:蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)18%18%； （GB10765-1997GB10765-1997） 嬰幼兒配方乳粉嬰幼兒配方乳粉、 : :蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)12-12-18%18%； （GB10766-1997GB10766-1997） 2第1頁(yè)/共50頁(yè)椰子汁中蛋白加熱沉淀椰子汁中蛋白加熱沉淀黃酒貯藏中的沉淀大黃酒貯藏中的沉淀大部分為蛋白質(zhì)部分為蛋白質(zhì)2 2、影響食品色、香、味、

2、影響食品色、香、味及結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)面筋蛋白：面包粉面筋蛋白：面包粉33%；蛋糕；蛋糕粉粉: 22%饅頭粉饅頭粉25%-30%（ SB/T-93 ）3第2頁(yè)/共50頁(yè)第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測(cè)定蛋白質(zhì)的定量測(cè)定 定量方法：凱氏定氮法及分光光定量方法：凱氏定氮法及分光光度法。度法。一、凱氏定氮法一、凱氏定氮法 奶粉中測(cè)得氮含量為奶粉中測(cè)得氮含量為2.12%,2.12%,蛋白蛋白質(zhì)含氮為質(zhì)含氮為16%16%，奶粉中蛋白質(zhì)含量，奶粉中蛋白質(zhì)含量? ? 換算系數(shù)通常換算系數(shù)通常6.256.25，牛乳及制品，牛乳及制品為為6.386.38，大豆及制品為，大豆及制品為5.715.71等。等。4第3頁(yè)/共50頁(yè)

3、脫水性：將脫水性：將H H、O O按按2 2：1 1比例脫去，剩比例脫去，剩下下C C、N N氧化性：氧化性： 2H2H2 2SOSO4 4 + C + C 2SO2SO2 2+ 2H+ 2H2 2O O + CO+ CO2 2 3SO 3SO2 2+2N +3H+2N +3H2 2O=3SOO=3SO3 3 +2NH +2NH3 3H2SO4 酸性：酸性： H H2 2SOSO4 4 +2NH +2NH3 3= (NH= (NH4 4) )2 2SOSO4 4 丹麥化學(xué)家丹麥化學(xué)家Johan Kjeldahl（1883）發(fā)明的，當(dāng)時(shí)）發(fā)明的，當(dāng)時(shí)只用只用H2SO4分解試樣，需長(zhǎng)時(shí)間，后來(lái)分解

4、試樣，需長(zhǎng)時(shí)間，后來(lái)Gunning改進(jìn)，改進(jìn)，在消化時(shí)加入在消化時(shí)加入K2SO4使沸點(diǎn)上升從而加快分解速度。后來(lái)使沸點(diǎn)上升從而加快分解速度。后來(lái)5第4頁(yè)/共50頁(yè)1 1、原理、原理 樣品與硫酸、催化劑加熱消化樣品與硫酸、催化劑加熱消化，蛋白質(zhì)分解，其中的，蛋白質(zhì)分解，其中的C C、H H氧化為氧化為COCO2 2和和H H2 2O O蒸汽逸出，而氮轉(zhuǎn)化為氨，蒸汽逸出，而氮轉(zhuǎn)化為氨，與硫酸結(jié)合成硫酸銨，加堿蒸餾，與硫酸結(jié)合成硫酸銨，加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后以鹽酸滴使氨蒸出，用硼酸吸收后以鹽酸滴定。定。硫酸鉀之目的：提高沸點(diǎn)，加快有硫酸鉀之目的：提高沸點(diǎn)，加快有機(jī)物分解；機(jī)物分解；硫酸銅之

5、目的：催化劑、消化終點(diǎn)硫酸銅之目的：催化劑、消化終點(diǎn)的指示劑的指示劑（CuSOCuSO4 4藍(lán)綠色如果沒(méi)消化完全，則為藍(lán)綠色如果沒(méi)消化完全，則為CuCu2 2SOSO4 4）、）、蒸餾前加入堿量合適否的指示劑。蒸餾前加入堿量合適否的指示劑。2CuSO2CuSO4 4+C=+C=Cu2SO4+SO2+CO2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+SO2+2H2O6第5頁(yè)/共50頁(yè)7第6頁(yè)/共50頁(yè)常量凱氏常量凱氏定氮定氮微量凱氏微量凱氏定氮定氮改良微量凱氏改良微量凱氏定氮定氮8第7頁(yè)/共50頁(yè)A A、蒸餾完全判斷、蒸餾完全判斷 經(jīng)驗(yàn)時(shí)間：經(jīng)驗(yàn)時(shí)間：常量凱氏定氮約常量凱氏定氮約30min30m

6、in，微量定氮裝置中是指示劑變，微量定氮裝置中是指示劑變色后，再蒸餾色后，再蒸餾10min10min，提離液面，再，提離液面，再蒸餾蒸餾1min1min； 萘氏試劑遇氨氣呈紅棕色。萘氏試劑遇氨氣呈紅棕色。 配制：配制：3.5gKI+1.3gHgCl3.5gKI+1.3gHgCl2 2 溶于溶于70ml70ml水，加水，加4mol/lNaOH 30ml4mol/lNaOH 30ml。B B、吸收、吸收 用用2%2%或或4%4%硼酸作為吸收液，應(yīng)硼酸作為吸收液，應(yīng)注意接收管浸沒(méi)在吸收液中。注意接收管浸沒(méi)在吸收液中。C C、常量、半微量、微量概念、常量、半微量、微量概念9第8頁(yè)/共50頁(yè)常量：常量：

7、0.1g0.1g，10mL10mL；半微量：半微量：0.01g-0.1g 0.01g-0.1g ， 1mL-10mL 1mL-10mL ；微量：微量：0.1mg-10mg0.1mg-10mg，0.01mL-1mL0.01mL-1mL。 eg:eg:稱樣稱樣0.85g,0.85g,消化后，直接蒸消化后，直接蒸餾，取出消化液，定容至餾，取出消化液，定容至100mL100mL，取，取其中的其中的10mL10mL蒸餾蒸餾常量凱氏常量凱氏定氮定氮改良微量凱氏改良微量凱氏定氮定氮10第9頁(yè)/共50頁(yè)（3 3）滴定）滴定 (NH(NH4 4) )2 2B B4 4O O7 7+HCl+H+HCl+H2 20

8、0NH4Cl+H3BO3 用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定吸收有氨氣的硼酸用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定吸收有氨氣的硼酸液。液。 指示劑：指示劑：0.1%0.1%甲基紅甲基紅+0.1%+0.1%溴甲酚綠溴甲酚綠終點(diǎn)判定終點(diǎn)判定 2%2%硼酸溶液，藍(lán)綠色硼酸溶液，藍(lán)綠色灰色灰色 4%4%硼酸溶液，藍(lán)綠色硼酸溶液，藍(lán)綠色酒紅色酒紅色 主要與混合指示劑的變色范圍有關(guān)：主要與混合指示劑的變色范圍有關(guān)： pHpH4.04.0紅色紅色 =5.1=5.1灰色灰色 6.26.2綠色綠色 11第10頁(yè)/共50頁(yè)n樣品中被惡意添加硫樣品中被惡意添加硫酸銨、氯化銨，？酸銨、氯化銨，？n樣品中被惡意添加硝樣品中被惡意添加硝酸銨，？酸銨，？n樣

9、品中被惡意添加碳樣品中被惡意添加碳酸銨，？酸銨，？n樣品中被惡意添加尿樣品中被惡意添加尿素、三聚氰胺，？素、三聚氰胺，？N含量含量66.67%12第11頁(yè)/共50頁(yè)策略一：策略一：甲醛法測(cè)定樣品消化前銨甲醛法測(cè)定樣品消化前銨鹽含量鹽含量 4 4NHNH4 4+ + 6HCHO =(CH+ 6HCHO =(CH2 2）6 6N N4 4 H+ + 3H + 3H+ + + + 6H6H2 2O O 六次甲基四胺（弱堿，六次甲基四胺（弱堿，pH8.7pH8.7） (NH4+是極弱的酸，不能直接用是極弱的酸，不能直接用NaOH滴定）滴定）過(guò)程過(guò)程 ：樣品樣品+適量蒸餾水適量蒸餾水NaOH中和游離酸（

10、甲基紅指示劑，紅色中和游離酸（甲基紅指示劑，紅色變橙色，變橙色，pH為為4.46.2 ）加入甲加入甲醛醛充分搖勻充分搖勻, 靜置靜置5min用用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定（酚酞指示劑，標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定（酚酞指示劑，pH為為8.09.6 ）13第12頁(yè)/共50頁(yè)注意：注意：A、中和游離酸時(shí)只能用甲基紅指、中和游離酸時(shí)只能用甲基紅指示劑，如果甲醛中有甲酸，宜用示劑，如果甲醛中有甲酸，宜用NaOH先中和，此時(shí)指示劑用酚酞先中和，此時(shí)指示劑用酚酞。B、但要注意，甲醛也能和氨基酸、但要注意，甲醛也能和氨基酸發(fā)生反應(yīng)，且能使酸性相對(duì)凸顯。發(fā)生反應(yīng)，且能使酸性相對(duì)凸顯。C、碳酸銨不能碳酸銨不能用這種方法測(cè)定，

11、用這種方法測(cè)定，因?yàn)樯a(chǎn)的碳酸為弱酸，不能用因?yàn)樯a(chǎn)的碳酸為弱酸，不能用NaOH滴定，況且滴定，況且CO2會(huì)揮發(fā)。會(huì)揮發(fā)。D、硝酸銨中、硝酸銨中NO3-中的中的N不能被直不能被直接測(cè)出，但可以通過(guò)分子式中的定接測(cè)出，但可以通過(guò)分子式中的定量關(guān)系求出。量關(guān)系求出。14第13頁(yè)/共50頁(yè)快速檢測(cè)新方法研究快速檢測(cè)新方法研究.中國(guó)乳品工業(yè)中國(guó)乳品工業(yè). 2004，32，8.）15第14頁(yè)/共50頁(yè)策略三：策略三：非蛋白質(zhì)有機(jī)物物中的非蛋白質(zhì)有機(jī)物物中的N，改用，改用別的方法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)或別的方法測(cè)定惡別的方法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)或別的方法測(cè)定惡意添加物。意添加物。 三聚氰胺檢測(cè)（三聚氰胺檢測(cè)（GB/T223

12、88-2008GB/T22388-2008）HPLCHPLC（高效液相色譜法）、（高效液相色譜法）、HPLC-MCHPLC-MC、GC-MSGC-MSHPLCHPLCA A、提取、提取 超聲波及振蕩下，三氯乙酸、乙腈混合提取超聲波及振蕩下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀蛋白，離心除雜。，三氯乙酸沉淀蛋白，離心除雜。B、凈化凈化 陽(yáng)離子固相萃取柱陽(yáng)離子固相萃取柱，用水、甲醇洗脫除雜，用水、甲醇洗脫除雜，氨化乙醇洗脫，收集，氨化乙醇洗脫，收集洗脫液，備用。洗脫液，備用。16第15頁(yè)/共50頁(yè)C、測(cè)定、測(cè)定 C8或或C18柱柱 流動(dòng)相：檸檬酸、辛烷磺酸鈉、流動(dòng)相：檸檬酸、辛烷磺酸鈉、乙腈組成乙

13、腈組成 流速流速1mL/min，柱溫，柱溫40，進(jìn)樣，進(jìn)樣量量20L 波長(zhǎng)波長(zhǎng)240nm 。17第16頁(yè)/共50頁(yè)方法方法原理原理紫外吸收法紫外吸收法蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在280nm280nm處有吸收。處有吸收。 考馬斯亮藍(lán)比色法考馬斯亮藍(lán)比色法考馬斯亮藍(lán)使蛋白質(zhì)染色，在考馬斯亮藍(lán)使蛋白質(zhì)染色，在620nm620nm處有處有最大吸收（最大吸收（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：牛血清蛋白bovine serum albuminbovine serum albumin）。）。雙縮脲法雙縮脲法 雙縮脲與堿性銅生成紫紅色配雙縮脲與堿性銅生成紫紅色配合物，在合物，在560nm560nm處有最大吸收。處有最大吸收

14、。（備注（備注1 1）lowrylowry法法 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)- -銅絡(luò)合物中的酪氨酸及銅絡(luò)合物中的酪氨酸及色氨酸殘基使磷鉬酸色氨酸殘基使磷鉬酸- -磷鎢酸磷鎢酸（FolinFolin phenol reagent phenol reagent）還）還原成藍(lán)色物質(zhì)。（備注原成藍(lán)色物質(zhì)。（備注2 2）18第17頁(yè)/共50頁(yè)備注備注1：19雙縮脲法雙縮脲法第18頁(yè)/共50頁(yè)備注備注2：（1）lowrylowry法的原理法的原理 色澤的變化主要緣于色澤的變化主要緣于鉬、鎢化學(xué)價(jià)的鉬、鎢化學(xué)價(jià)的降低降低，該物質(zhì)的吸收波長(zhǎng)在，該物質(zhì)的吸收波長(zhǎng)在550-750nm之之間，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在間，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在1-

15、100g/ml時(shí)，用時(shí)，用750nm或或660nm，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量更高時(shí)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量更高時(shí)，用，用550nm。 沒(méi)有銅離子時(shí)，色澤由蛋白質(zhì)中的沒(méi)有銅離子時(shí)，色澤由蛋白質(zhì)中的酪酪氨酸及色氨酸氨酸及色氨酸殘基含量決定，其次是半胱殘基含量決定，其次是半胱氨酸和組氨酸殘基含量決定，銅離子將肽氨酸和組氨酸殘基含量決定，銅離子將肽鍵聚合在一起，從而鍵聚合在一起，從而加速加速了電子的傳遞。了電子的傳遞。 干擾物質(zhì)較多干擾物質(zhì)較多：檸檬酸，檸檬酸，tris，甘氨酸，甘氨酸，組氨酸，谷氨酸，組氨酸，谷氨酸，EDTA，葡萄糖，果糖，高濃，葡萄糖，果糖，高濃度的尿素，硫酸銨等都有影響度的尿素，硫酸銨等都有影響。20

16、第19頁(yè)/共50頁(yè)（2）試劑組成（）試劑組成（/hansen/protocols/lowry.htm）Lowry A: 2% Na2CO3 in 0.1 M NaOH Lowry B: 1% CuSO4 in diH2O Lowry C: 2% sodium potassium tartrate (NaKC4H4O6 4H2O) Lowry stock reagent 49 ml Lowry A 0.5 ml Lowry B 0.5 ml Lowry C Folins Reagent: Phenol reagent - 2N (Folin - C

17、iocalteau reagent) 主要成分為：主要成分為：3H2OP2O513WO35MoO310H2O 3H2OxP2O514WO34MoO310H2O（ /wiki/Folin%E2%80%93Ciocalteu_reagent ） Folin phenol試劑還可以測(cè)定酚類(lèi)試劑還可以測(cè)定酚類(lèi)物質(zhì)的含量物質(zhì)的含量（鄭鴻元鄭鴻元 許光輝許光輝 李鳳珍等李鳳珍等 .土壤微生物分析土壤微生物分析方法手冊(cè)方法手冊(cè). 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1986.）21第20頁(yè)/共50頁(yè)（3）該法的歷史）該法的歷史 吳憲博士吳憲博士（18931959年）是

18、國(guó)際著名生物化學(xué)家、中國(guó)近代生物化學(xué)事業(yè)的開(kāi)拓者和奠基人于于1922年發(fā)現(xiàn)年發(fā)現(xiàn)Folin phenol reagent能測(cè)定蛋白質(zhì)能測(cè)定蛋白質(zhì) (Wu, H. (1922) J. Biol. Chem. 51, 3339) 。 Lowry發(fā)現(xiàn)，在此前，先讓蛋白發(fā)現(xiàn)，在此前，先讓蛋白質(zhì)與銅發(fā)生發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)（雙縮脲質(zhì)與銅發(fā)生發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)（雙縮脲法法 ），能提高反應(yīng)的靈敏度），能提高反應(yīng)的靈敏度(Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J.(1951) J. Biol. Chem. 193, 265275）。）。22

19、第21頁(yè)/共50頁(yè)23第22頁(yè)/共50頁(yè)24第23頁(yè)/共50頁(yè)一、甲醛滴定法一、甲醛滴定法1 1、原理、原理 酸性的酸性的-COOH-COOH，堿性的，堿性的-NH-NH2 2，使，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，加入甲醛溶氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，加入甲醛溶液時(shí)，液時(shí)，-NH-NH2 2與甲醛結(jié)合，其堿性消失與甲醛結(jié)合，其堿性消失，用堿滴定，用堿滴定-COOH-COOH基，以間接方法測(cè)基，以間接方法測(cè)定氨基酸的量。定氨基酸的量。2 2、大約過(guò)程、大約過(guò)程 加堿中和酸（加堿中和酸（pH 8.2）、加入甲）、加入甲醛，加堿滴定。當(dāng)加入甲醛后，溶液醛，加堿滴定。當(dāng)加入甲醛后，溶液的的pHpH值還在值還在8.2

20、8.2嗎？當(dāng)樣品中存在嗎？當(dāng)樣品中存在4 4+ +時(shí)時(shí), , 則測(cè)定結(jié)果偏大偏小？如何則測(cè)定結(jié)果偏大偏?。咳绾闻懦@種影響？排除這種影響？25第24頁(yè)/共50頁(yè)4NH4+ 6HCHO =(CH2）6N4 H+ + 3H+ + 6H2O26第25頁(yè)/共50頁(yè)1、茚三酮法、茚三酮法氨基酸與茚三酮生成氨基酸與茚三酮生成藍(lán)紫色藍(lán)紫色化合物二酮化合物二酮茚胺，該物在茚胺，該物在570nm有最大吸收（但脯有最大吸收（但脯氨酸和羥脯氨酸由于氨酸和羥脯氨酸由于氨基被取代，生成氨基被取代，生成物顯黃色物顯黃色440nm有最大吸收）。有最大吸收）。27第26頁(yè)/共50頁(yè) 茚三酮反應(yīng)的適宜茚三酮反應(yīng)的適宜pH為為5

21、-7 所有所有-氨基酸和蛋白質(zhì)氨基酸和蛋白質(zhì)都有此反應(yīng)都有此反應(yīng)，但有此反應(yīng)的不一定都是，但有此反應(yīng)的不一定都是-氨基酸和氨基酸和蛋白質(zhì)，比如蛋白質(zhì)，比如-丙氨酸、氨、許多一級(jí)丙氨酸、氨、許多一級(jí)胺與茚三酮都呈陽(yáng)性胺與茚三酮都呈陽(yáng)性。（。（鄭繼平，湯華，陳銀鄭繼平，湯華，陳銀華華 .現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo). 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007.）但但色澤不一定一樣，比如，色澤不一定一樣，比如，-氨基酸呈黃氨基酸呈黃色，苯胺橙紅色。（色，苯胺橙紅色。（楊桂法等楊桂法等. 有機(jī)化學(xué)分析有機(jī)化學(xué)分析. 湖湖南大學(xué)出版社，南大學(xué)出版社，1996. ）28第27頁(yè)/共50頁(yè) 但課本但

22、課本P140所談及的及所談及的及GB/T 8314-2002茶游離氨基酸總量測(cè)定時(shí)：茶游離氨基酸總量測(cè)定時(shí)：-氨基氨基酸在酸在pH8.0的條件的條件下與茚三酮共熱，形成下與茚三酮共熱，形成紫色絡(luò)合物，用分光光度法在特定的波長(zhǎng)紫色絡(luò)合物，用分光光度法在特定的波長(zhǎng)下測(cè)定其含量。下測(cè)定其含量。 茚三酮受陽(yáng)光、空氣、溫度、濕度茚三酮受陽(yáng)光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化，使用前用活性炭吸附被等影響而被氧化，使用前用活性炭吸附被氧化物而純化。氧化物而純化。29第28頁(yè)/共50頁(yè)2、鄰苯二甲醛法（、鄰苯二甲醛法（O-Phthalic aldehyde ,OPT)鄰苯二甲醛在鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，

23、堿性巰基乙醇存在下，堿性溶液中，與氨基酸產(chǎn)生熒光物質(zhì)，激發(fā)溶液中，與氨基酸產(chǎn)生熒光物質(zhì)，激發(fā)光波長(zhǎng)為光波長(zhǎng)為340nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為，發(fā)射光波長(zhǎng)為455nm。n靈敏度比茚三酮高，但熒光強(qiáng)度與氨基靈敏度比茚三酮高，但熒光強(qiáng)度與氨基酸種類(lèi)有關(guān)，對(duì)半胱氨酸、胱氨酸和賴酸種類(lèi)有關(guān)，對(duì)半胱氨酸、胱氨酸和賴氨酸等的熒光值偏低，和氨酸等的熒光值偏低，和脯氨酸和羥脯脯氨酸和羥脯氨酸不反應(yīng)，尿素、尿酸及氨等不發(fā)生氨酸不反應(yīng)，尿素、尿酸及氨等不發(fā)生類(lèi)似反應(yīng)類(lèi)似反應(yīng)。30第29頁(yè)/共50頁(yè)3、三硝基苯磺酸法（、三硝基苯磺酸法（TriNitroBenzene Sulfonic acid ）31第30頁(yè)/共50頁(yè)n與茚

24、三酮相比：靈敏度相當(dāng)，且與茚三酮相比：靈敏度相當(dāng)，且不受不受NH4+的影響，但不能與的影響，但不能與Pro反應(yīng)，可以反應(yīng)，可以和和Cys的的-SH反應(yīng)，為此，反應(yīng)，為此，TNBS前，堿前，堿性條件下性條件下30保溫?cái)?shù)小時(shí)，使保溫?cái)?shù)小時(shí)，使-SH都氧化都氧化成成-S-S-后，再測(cè)定。后，再測(cè)定。n堿性條件下測(cè)定的優(yōu)勢(shì)是可以用堿性條件下測(cè)定的優(yōu)勢(shì)是可以用420nm，在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，劣勢(shì)是每種氨基酸，在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，劣勢(shì)是每種氨基酸的消光系數(shù)不同；酸性條件下的優(yōu)勢(shì)是的消光系數(shù)不同；酸性條件下的優(yōu)勢(shì)是每種氨基酸的消光系數(shù)同，但需紫外光每種氨基酸的消光系數(shù)同，但需紫外光。32第31頁(yè)/共50頁(yè)4、丹磺酰

25、氯法（、丹磺酰氯法（dansyl chloride）丹磺酰氯是丹磺酰氯是5-二甲基氨基萘二甲基氨基萘-1-磺酰氯（磺酰氯（5-dimethylaminonaphthalene-1 -sulfonyl chloride）的簡(jiǎn)稱。丹磺酰氯與氨基酸反）的簡(jiǎn)稱。丹磺酰氯與氨基酸反應(yīng)生成熒光性質(zhì)強(qiáng)和穩(wěn)定的磺胺衍生物應(yīng)生成熒光性質(zhì)強(qiáng)和穩(wěn)定的磺胺衍生物(激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)298nm，發(fā)射波長(zhǎng)，發(fā)射波長(zhǎng)546nm），），也常用于多肽鏈的也常用于多肽鏈的N末端氨基酸的鑒定。末端氨基酸的鑒定。33第32頁(yè)/共50頁(yè)5、 2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）法

26、）法DNFB也叫做也叫做Sanger試劑，試劑，DNFB在弱堿性溶液在弱堿性溶液中與氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，生成黃色化合物二中與氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，生成黃色化合物二硝基苯基氨基酸（硝基苯基氨基酸（dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸）氨基酸）34第33頁(yè)/共50頁(yè)351.0 mL 的的0.2 mol/L NaHCO3,1.0 mL 的的 1% DNFB (1.0mL 溶解在溶解在100mL的的1,4-dioxane) ，1.0 mL 樣品液樣品液, 黑暗處黑暗處60 ，40min, 加入加入0.5 mL of 1 mol/L HCl終止反應(yīng)，加入終止反應(yīng)，加入5mL乙

27、酸乙乙酸乙酯萃取，靜置酯萃取，靜置10min,420nm測(cè)定，氨基酸濃度測(cè)定，氨基酸濃度0.021.00 mg/mL有良好的線性關(guān)系有良好的線性關(guān)系（Lin Chen，et al. A novel colorimetric determination of free amino acids content in tea infusions with 2,4-dinitrofluorobenzene. Journal of Food Composition and Analysis 22 (2009) 137141）。第34頁(yè)/共50頁(yè)方法方法靈敏度靈敏度脯氨酸、羥脯脯氨酸、羥脯氨酸氨酸受氨的受

28、氨的影響影響茚三酮茚三酮能反應(yīng)能反應(yīng)有影響有影響鄰苯二甲醛鄰苯二甲醛比茚三酮比茚三酮高高不反應(yīng)不反應(yīng)不影響不影響三硝基苯磺三硝基苯磺酸酸與茚三酮與茚三酮同同不反應(yīng)不反應(yīng)不影響不影響丹磺酰氯丹磺酰氯比茚三酮比茚三酮高高反應(yīng)反應(yīng)未知未知2,4-二硝基氟二硝基氟苯苯比茚三酮比茚三酮高高反應(yīng)反應(yīng)未知未知幾種比色法的比較幾種比色法的比較36第35頁(yè)/共50頁(yè)第五節(jié)第五節(jié) 氨基酸分離及測(cè)定氨基酸分離及測(cè)定一、蛋白質(zhì)的水解一、蛋白質(zhì)的水解n酸水解：酸水解：5.7mol/L鹽酸，密封的水解管中，鹽酸，密封的水解管中，105-115水解水解20h以上。鹽酸水解后，以上。鹽酸水解后，色氨酸色氨酸全部被破壞全部被破

29、壞。n堿水解：堿水解：5mol/L NaOH，充氮?dú)夂筇畛涔?，充氮?dú)夂筇畛涔埽?10水解水解22h，測(cè)定時(shí)，用，測(cè)定時(shí)，用6mol/L鹽酸中和至鹽酸中和至pH6-7后測(cè)定，堿水解時(shí)，多數(shù)氨基酸破壞，后測(cè)定，堿水解時(shí)，多數(shù)氨基酸破壞，僅僅色氨酸穩(wěn)定，色氨酸穩(wěn)定，因此專用于色氨酸的測(cè)定。因此專用于色氨酸的測(cè)定。n磺酸水解：磺酸水解：4mol/L甲基磺酸，并加入色氨酸甲基磺酸，并加入色氨酸保護(hù)劑，水解后，用保護(hù)劑，水解后，用3.5mol/L NaOH中和至中性中和至中性，可以測(cè)定，可以測(cè)定除半胱氨酸以外的所有氨基酸。除半胱氨酸以外的所有氨基酸。n酶解：酶解：保持所有的氨基酸不被破壞，但水解保持所有的

30、氨基酸不被破壞，但水解不全，且酶本身也是蛋白質(zhì)，對(duì)測(cè)定有干擾。不全，且酶本身也是蛋白質(zhì)，對(duì)測(cè)定有干擾。（顏真（顏真. 蛋白質(zhì)研究技術(shù)蛋白質(zhì)研究技術(shù). 西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2007）37第36頁(yè)/共50頁(yè)二、氨基酸的薄層層析法二、氨基酸的薄層層析法、原理、原理制備樣品，點(diǎn)其于薄層板，雙制備樣品，點(diǎn)其于薄層板，雙向上行法展開(kāi)，組分在薄層板上經(jīng)向上行法展開(kāi)，組分在薄層板上經(jīng)過(guò)多次的被吸附、解吸、交換等作過(guò)多次的被吸附、解吸、交換等作用，氨基酸得到分離。后用茚三酮用，氨基酸得到分離。后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比，通顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)比移值（過(guò)比移值

31、（）定性，斑點(diǎn)顏色深）定性，斑點(diǎn)顏色深淺大致定量。淺大致定量。38第37頁(yè)/共50頁(yè)、過(guò)程、過(guò)程（）薄層板制備（）薄層板制備吸附層析吸附層析: :如硅膠、氧化鋁、聚如硅膠、氧化鋁、聚酰胺等（固定相：這些物質(zhì)）；酰胺等（固定相：這些物質(zhì)）；分配分配層析層析: :纖維素、硅藻土等（固定相：纖維素、硅藻土等（固定相：水）；水）；離子交換層析離子交換層析: :支持劑是離子支持劑是離子交換劑。交換劑。（）樣品液制備（）樣品液制備游離氨基酸提?。河坞x氨基酸提取：水浸液，加乙水浸液，加乙醇沉淀除去蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，離醇沉淀除去蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，離子交換樹(shù)脂凈化。子交換樹(shù)脂凈化。酸水解法：酸水解法：蛋白質(zhì)

32、樣品，加入鹽蛋白質(zhì)樣品，加入鹽酸水解。酸水解。（）點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色。（）點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色。39第38頁(yè)/共50頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)1標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)2標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)3樣樣液液abRf=b/a40第39頁(yè)/共50頁(yè)三、氨基酸自動(dòng)分析儀三、氨基酸自動(dòng)分析儀利用各種氨基酸的酸堿性、極利用各種氨基酸的酸堿性、極性、相對(duì)分子量不同等性質(zhì)，使用性、相對(duì)分子量不同等性質(zhì)，使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在色譜柱上進(jìn)行分陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在色譜柱上進(jìn)行分離。通常先出來(lái)的為酸性氨基酸和離。通常先出來(lái)的為酸性氨基酸和極性較大的氨基酸，其次是非極性極性較大的氨基酸，其次是非極性的芳香族氨基酸，最后是堿性氨基的芳香族氨基酸，最后是堿性氨基酸，分子量小的先洗脫

33、下來(lái)，洗脫酸，分子量小的先洗脫下來(lái)，洗脫下的氨基酸通過(guò)茚三酮顯色，從而下的氨基酸通過(guò)茚三酮顯色，從而定量各種氨基酸。定量各種氨基酸。 41第40頁(yè)/共50頁(yè)42第41頁(yè)/共50頁(yè)常量凱氏常量凱氏定氮定氮微量凱氏微量凱氏定氮定氮改良微量凱氏改良微量凱氏定氮定氮43第42頁(yè)/共50頁(yè)策略三：策略三：非蛋白質(zhì)有機(jī)物物中的非蛋白質(zhì)有機(jī)物物中的N，改用，改用別的方法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)或別的方法測(cè)定惡別的方法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)或別的方法測(cè)定惡意添加物。意添加物。 三聚氰胺檢測(cè)（三聚氰胺檢測(cè)（GB/T22388-2008GB/T22388-2008）HPLCHPLC（高效液相色譜法）、（高效液相色譜法）、HPLC-MC

34、HPLC-MC、GC-MSGC-MSHPLCHPLCA A、提取、提取 超聲波及振蕩下，三氯乙酸、乙腈混合提取超聲波及振蕩下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀蛋白，離心除雜。，三氯乙酸沉淀蛋白，離心除雜。B、凈化凈化 陽(yáng)離子固相萃取柱陽(yáng)離子固相萃取柱，用水、甲醇洗脫除雜，用水、甲醇洗脫除雜，氨化乙醇洗脫，收集，氨化乙醇洗脫，收集洗脫液，備用。洗脫液，備用。44第43頁(yè)/共50頁(yè)備注備注2：（1）lowrylowry法的原理法的原理 色澤的變化主要緣于色澤的變化主要緣于鉬、鎢化學(xué)價(jià)的鉬、鎢化學(xué)價(jià)的降低降低，該物質(zhì)的吸收波長(zhǎng)在，該物質(zhì)的吸收波長(zhǎng)在550-750nm之之間，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在間，當(dāng)?shù)?/p>

35、白質(zhì)濃度在1-100g/ml時(shí)，用時(shí)，用750nm或或660nm，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量更高時(shí)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量更高時(shí)，用，用550nm。 沒(méi)有銅離子時(shí)，色澤由蛋白質(zhì)中的沒(méi)有銅離子時(shí)，色澤由蛋白質(zhì)中的酪酪氨酸及色氨酸氨酸及色氨酸殘基含量決定，其次是半胱殘基含量決定，其次是半胱氨酸和組氨酸殘基含量決定，銅離子將肽氨酸和組氨酸殘基含量決定，銅離子將肽鍵聚合在一起，從而鍵聚合在一起，從而加速加速了電子的傳遞。了電子的傳遞。 干擾物質(zhì)較多干擾物質(zhì)較多：檸檬酸，檸檬酸，tris，甘氨酸，甘氨酸，組氨酸，谷氨酸，組氨酸，谷氨酸，EDTA，葡萄糖，果糖，高濃，葡萄糖，果糖，高濃度的尿素，硫酸銨等都有影響度的尿素，硫酸銨等

36、都有影響。45第44頁(yè)/共50頁(yè)（2）試劑組成（）試劑組成（/hansen/protocols/lowry.htm）Lowry A: 2% Na2CO3 in 0.1 M NaOH Lowry B: 1% CuSO4 in diH2O Lowry C: 2% sodium potassium tartrate (NaKC4H4O6 4H2O) Lowry stock reagent 49 ml Lowry A 0.5 ml Lowry B 0.5 ml Lowry C Folins Reagent: Phenol reagent - 2N (Folin - Ciocalteau reagent